方法論記事

トキゾイトに対するin vitro生活性分子のスクリーニングのための抗増殖プラークアッセイ

DOI：

10.3791/69725

⸱

2026年1月23日

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1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本研究は、原虫 トキゾプラズマ・ゴンディイのタキゾイト段階に対する新しい生物活性分子のスクリーニングを支援するための簡単なプラークアッセイ法を記述することを目的としています。

要約

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トキソプラズマ症は、眼の病変や新生児奇形によく関連する寄生虫感染症です。1950年代初頭以降、この病気の第一選択治療はスルファジアジン、ピリメタミン、フォリン酸の組み合わせに依存してきました。その間、代替的な治療法はごくわずかしか導入されていません。これは トキソプラズマ・ゴンディイに対する新たな生体活性分子の発見の必要性を浮き彫りにしています。この病原体は必須の細胞内寄生虫であるため、従来の薬物スクリーニングは蛍光タンパク質やβガラクトシダーゼ発現寄生虫を用いたアッセイなど、高価な材料や機器を必要とすることが多いです。さらに、光学顕微鏡の定量化のような手法は時間がかかることがあります。プラークアッセイは、寄生虫の溶解サイクルによって損傷した細胞単層の領域数と破壊面積を測定することで、細胞内病原体増殖の強度を評価する方法です。本研究は、 T. gondiiの細胞内タキゾイトに対して活性分子をvitroでスクリーニングするために設計された最適化されたプラークアッセイプロトコルを記述しています。このプロトコルは安価な材料とシンプルな実験室環境を用い、迅速かつ再現性の高い結果を生み出し、さまざまな研究グループによる新たな有効分子の同定を容易にします。

概要

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トキソプラズマ症は世界中に分布が異なる人獣共通感染症であり、世界人口の約3分の1に影響を及ぼしています1,2。この病気の症状は宿主免疫の度合いや寄生虫の複製と関連しています 3,4。急性期はタキゾイト期の複製を特徴とし、免疫能力のある個体では一般的に無症状です5,6。対照的に、免疫抑制状態の患者は、全身の倦怠感、発熱、脳炎、網膜軟膿膜炎などの非特異的症状を含むより頻繁な症状を示します。臨床的に重要であるにもかかわらず、現在利用可能な治療法はトキソプラズマ・ゴンディイ緩動性段階(慢性期)には効果がなく、寄生虫学的根治には至りません。現在の薬に対する有害事象も治療遵守率を低下させます(9,10,11

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プロトコル

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寄生虫および細胞培養の操作、廃棄物の処理および送先は、国家衛生監視機関(ANVISA)RDC 第222/2018号の規定に従い、ブラジルの法律に従って実施されました。すべての手順はICB-UFMGの内部バイオセーフティ委員会(CIBio)によって監督されました。本研究は動物、人間、遺伝子組み換え生物の使用を含みません。CNPq、CAPES、FAPEMIGからの助成金がこの研究を支援しました。ESMD(CNPq 308082/2023-0)およびRWAV(CNPq 305574/2021-3)はCNPq生産性フェローです。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 補足されたRPMI-1640培地の調製

注:RPMI-1640培地はもともと、懸濁液および単分子層の両方でヒト白血病細胞の培養用に開発されました。しかし、その後の研究により、さまざまな哺乳類細胞培養に適合していることが示されています。

  1. RPMI-1640が250mL入ったボトルに、200 mM L-グルタミン(100x)を2.5mL加えます。
  2. 培地に抗生物質-抗菌剤(100倍)を2.5mL加えます。
  3. 次に、RPMI-1640(2%または10%FBS)を含む胎児用牛血清(FBS)を5.0mLまたは25mLのボトルに追加しま....

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結果

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治療後のプラークアッセイを評価する際には、陽性(タキゾイトに感染し未処理の細胞)と陰性(DMSO0.1%の未感染細胞)の両方が重要です。実験終了時には、陽性コントロールウェルは接着細胞の残留を含む明確な空白空間を示すはずです(図2)。対照的に、ネガティブコントロール井戸は空白のない完全な単層を示すべきです。陰性コントロールは、単分子層の完全性と実験全体を通じて細胞の生存可能性を確認する上で非常に重要です。陽性対照は、検査化合物・薬剤による T. gondii 増殖抑制率の計算基準となります。したがって、正確な評価には、明確なプラークを持つ完全な細胞単分子層の残存物が必要です。コントロールを確認した後、処理済みのウェルを評価してください。

図2は期待される結果を示しています。陰性対照群は良好に保存された単層を示し、陽性対照群は保存された粘着細胞内に明確に定義された空白(プラーク)を示すことが観察できます。いかなる井戸にも誤った取り扱い、細胞に対する.......

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ディスカッション

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抗拡散検査の新しいプロトコルの標準化は、将来の薬剤の特定に関する科学的研究を前進させるための基本的なステップです。ここで提示するプロトコルは、T. gondiiのタキゾイトに対する生体活性分子の活性を評価するための代替アプローチを提供します。T. gondiiは滑空運動で移動する強制的な細胞内寄生虫であるため、溶けた細胞から寄生虫が出ると、感染した細胞の近くにある細胞に侵入します。したがって、寄生虫が増殖するにつれて、明確な破壊領域(図2)が生じ、その大きさは逃げ出した寄生虫の数や侵入細胞の数に比例し、T. gondiiの増殖を測定することが可能になります。

プラークアッセイは、複数の分子を異なる濃度で検査することを可能にします。顕微鏡的定量分析に必要な類似の実験室構造を持ちつつ、より高いスループットを実現します21,30

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開示事項

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著者たちは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

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著者たちはまた、国営漁業計画委員会(CNPq)、ミナスジェライス漁業資源財団(FAPEMIG)、CAPES/PROEXからの資金提供にも感謝しています。著者らは、本研究を支援してくださったミナスジェライス連邦大学のプロ・レイトリア・デ・ペスキサに感謝申し上げます。ESMD(CNPq 308082/2023-0)およびRWAV(CNPq 305574/2021-3)はCNPq生産性フェローです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン-EDTAライフ・テクノロジーズ25300-062
10 mL 血清学ピペットオーレンK17-110
15mLファルコンチューブ遠心分離機ファネムモデル:206
5 mL 血清学ピペットオーレンK17-115
6ウェル培養プレートサーステット833920
分析的均衡トレドのメットラー モデル:AB204 シリアル番号:1116473813
抗生物質・抗菌薬(100倍)ライフ・テクノロジーズ15240-062
自動ピペットカスヴィK1エイド
遠心分離機エッペンドルフモデル5415 R シリアル番号:0023591
CO2インキュベーターPHCコーポレーションモデル番号:MCO-230AICUVL-PA シリアル番号:210360090
培養ボトル 25 cm2サーステット833910
ジメチルスルホキシド(DMSO)P.A.メルク 1,02,95,21,000
エタノールP.Aメルク1,00,98,31,000
胎児用牛血清(FBS)ライフ・テクノロジーズ12657-029
ホルムアルデヒド 37-38%パンレアック131328
GraphPadプリズム GraphPadソフトウェア-バージョン 8.0.1
ImageJ ソフトウェア --バージョン 1.52e
画像記録システムバイオ・ラッドモデル: ケミドック MPイメージングシステム シリアル番号:734BR2249
層流フードベコ・ド・ブラジルモデル:VLFS-09
L-グルタミン 200 mM(100X)ライフ・テクノロジーズ25030-081
マイクロチューブ 0.5 mLサーステット72,699
新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)ロンザCC-3132ブラジル、フィオクルス・パランアキュートのシーラ・ナルデッリ博士より寛大に提供されました
ノイバウアーチャンバー 0.100 mm 0.0025 mm2新しい光学系7301-1
pHメーターミクロンモデル:B374 シリアル番号:30/37
ピペット20-200およびマイクロ;LKasvi basic22032893
ピペット2-20およびマイクロ;Lラボメイト・プロ656630226
ピペット 0.2-2 & micro;Lラボメイト・プロ556610114
ピペット 1000-5,000 & マイクロ;LユニサイエンスYM4A021482
ピペット 100-1000 & マイクロ;Lエッペンドルフ・リサーチ・プラスQ34354C
リン酸カリウム単塩基性化合物 (KH2PO4)P.A シンセ01F2002.01.AF
RPMI-1640 ミディアムシグマ・オルドリッチ R0883
塩化ナトリウム(NaCl)P.A. クロモリン・クイアキュート;ミカ・フィナ -
リン酸ナトリウム二塩基(Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos EireliR2715920500
ヒント1.000 &マイクロ;Lサーステット7,01,186
ヒント10とマイクロ;Lサーステット7,03,010
ヒント:5,000 & micro;Lサーステット70,11,83,001
ヒント 200 & マイクロ;Lサーステット7,03,030
トランスファーピペット (3.5 mL) サーステット86,11,71,001
チューブ 15 mLサーステット6,25,54,502
バイオレットクリスタルメルク101408
ボルテックスミキサーフェニックスモデル:AP56 シリアル番号:6633
ウォーターバスブラジルのヘモキミカモデル:HM1003 シリアル番号:700001556

参考文献

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  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al.

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