トキゾイトに対するin vitro生活性分子のスクリーニングのための抗増殖プラークアッセイ

サマリー

本研究は、原虫 トキゾプラズマ・ゴンディイのタキゾイト段階に対する新しい生物活性分子のスクリーニングを支援するための簡単なプラークアッセイ法を記述することを目的としています。

要約

トキソプラズマ症は、眼の病変や新生児奇形によく関連する寄生虫感染症です。1950年代初頭以降、この病気の第一選択治療はスルファジアジン、ピリメタミン、フォリン酸の組み合わせに依存してきました。その間、代替的な治療法はごくわずかしか導入されていません。これは トキソプラズマ・ゴンディイに対する新たな生体活性分子の発見の必要性を浮き彫りにしています。この病原体は必須の細胞内寄生虫であるため、従来の薬物スクリーニングは蛍光タンパク質やβガラクトシダーゼ発現寄生虫を用いたアッセイなど、高価な材料や機器を必要とすることが多いです。さらに、光学顕微鏡の定量化のような手法は時間がかかることがあります。プラークアッセイは、寄生虫の溶解サイクルによって損傷した細胞単層の領域数と破壊面積を測定することで、細胞内病原体増殖の強度を評価する方法です。本研究は、 T. gondiiの細胞内タキゾイトに対して活性分子をvitroでスクリーニングするために設計された最適化されたプラークアッセイプロトコルを記述しています。このプロトコルは安価な材料とシンプルな実験室環境を用い、迅速かつ再現性の高い結果を生み出し、さまざまな研究グループによる新たな有効分子の同定を容易にします。

概要

トキソプラズマ症は世界中に分布が異なる人獣共通感染症であり、世界人口の約3分の1に影響を及ぼしています^1,2。この病気の症状は宿主免疫の度合いや寄生虫の複製と関連しています ^3,4。急性期はタキゾイト期の複製を特徴とし、免疫能力^{のある個体}では一般的に無症状です^5,6。対照的に、免疫抑制状態の患者は、全身の倦怠感、発熱、脳炎、網膜軟膿膜炎などの非特異的症状を含むより頻繁な症状^{を示します。}臨床的に重要であるにもかかわらず、現在利用可能な治療法はトキソプラズマ・ゴンディイ緩動性段階(慢性期)には効果がなく、寄生虫学的根治には至りません。現在の薬に対する有害事象も治療遵守率を低下させます^(9,10,11)。したがって、トキソプラズマ症に対して新たで安全かつ効果的な治療法を見つける必要があります。

新薬の開発には長期にわたる投資、数十億ドルの投資、そして複数の研究段階が必要です。薬剤開発コストが高いため、製薬業界は事前に最適な薬剤候補を選定^{する必要があります。}薬物スクリーニングには、サイリコ法、人工知能の利用、そして最も一般的な生物学的手法(16,17,18,19)など、いくつかのアプローチが用いられます。in vitro生物学的スクリーニングは、分子ライブラリー(化学ライブラリー)を用いて生物学^的活性の同定に利用可能にする^{ものです。}これらの化学ライブラリーは多様な分子を含むため、資源と時間の最適化が必要です。したがって、プラークアッセイはT. gondiiのようなさまざまな病原体に対して新しい生体活性分子を迅速にスクリーニングする方法となり得ます。

プラークアッセイは、細胞内病原体の溶解回路を利用して細胞単層内の病原体の濃度を定量化し^{、時間をかけ}て壊死性プラークを形成するin vitro法です。プラーク分析技術を用いた最初の研究は20世紀後半に遡り、レナート・ドゥルベッコのチームは西洋馬脳脊髄炎ウイルスに感染した鶏の線維芽細胞の単層細胞を用いて、壊死性プラークの数とウイルス¹⁶の濃度の比例性を示しました。この技術のT. gondiiでの使用も、Ufermannらによって以前に明らかにされているように、よく説明^{されています。}

プラークアッセイを用いてT. gondiiが異なる分子濃度に対して抑制反応を観察した最初の研究の一つは、1976年にRobertsらによって行われ^ました。プラークアッセイはウイルスの滴定に広く用い^{られていますが、}この方法は分子21,22,25,26,27の抗T. gondii活性を評価するために用いられている研究グループはごく一部です。高スループットで化合物ライブラリーを検査し、安価な材料と簡単な実験室設備を用いるアッセイを求めて、プラークアッセイは通常の検査の代替手段として検討されました。その結果、単純な材料と画像取得システムを用いて異なる分子の活性を同時に評価できる最適化プロトコルが確立され、迅速かつ再現性の高い結果が得られました。したがって、本研究室で検証された詳細なプロトコルを説明し、他のグループがT. gondiiのタキゾイトに対して新しい生体活性分子をスクリーニングするのを支援することを目的としています。

プロトコル

寄生虫および細胞培養の操作、廃棄物の処理および送先は、国家衛生監視機関(ANVISA)RDC 第222/2018号の規定に従い、ブラジルの法律に従って実施されました。すべての手順はICB-UFMGの内部バイオセーフティ委員会(CIBio)によって監督されました。本研究は動物、人間、遺伝子組み換え生物の使用を含みません。CNPq、CAPES、FAPEMIGからの助成金がこの研究を支援しました。ESMD(CNPq 308082/2023-0)およびRWAV(CNPq 305574/2021-3)はCNPq生産性フェローです。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 補足されたRPMI-1640培地の調製

注:RPMI-1640培地はもともと、懸濁液および単分子層の両方でヒト白血病細胞の培養用に開発されました。しかし、その後の研究により、さまざまな哺乳類細胞培養に適合していることが示されています。

1. RPMI-1640が250mL入ったボトルに、200 mM L-グルタミン(100x)を2.5mL加えます。
2. 培地に抗生物質-抗菌剤(100倍)を2.5mL加えます。
3. 次に、RPMI-1640(2%または10%FBS)を含む胎児用牛血清(FBS)を5.0mLまたは25mLのボトルに追加します。
4. 冷蔵庫で保存してください(2〜8°C)。

2. PBSの準備(1回)

注:pH 7.2、25°Cでリン酸塩緩衝生食塩水1Lを製製するには、以下の手順に従ってください。

1. 塩の量を別々に測定します:Na₂HPO₄ 1.4 g、KH₂PO₄ 0.24 g、NaCl 8.5 g。
2. 重り塩を別々に1リットルのビーカーに800mLの脱イオン水を加えます。溶液をかき混ぜて、すべての塩が完全に溶けるまでします。
3. pHメーターを使って溶液のpHを測定します。7.2のはずです。必要に応じて、6M塩酸または3M水酸化ナトリウムを使ってpHを7.2にします。
4. ガラス棒を使って、上記の溶液を定量的に1Lの体積フラスコに移します。
5. 脱イオン水を体積フラスコに加え、総体積が1Lに達するまで加え、メニスカスが正しい位置にあることを確認します。
6. 溶液をボリューメトリックフラスコで混ぜ、優しく逆さまにします。
7. 最終的なPBS溶液を小さなガラス瓶(100〜250mL)に分けます。
8. ボトルを121°C、1.1kg/cm^で 15分間オートクレーブします。
9. PBS溶液は冷蔵庫(2〜8°C)で保存します。
   注1:すべての実験ではPBSを37°Cで使用してください。

3. 4%ホルムアルデヒド溶液の製剤

1. PBS1x35.68mLと37%P.A.ホルムアルデヒド4.32mLを混ぜます。
2. 溶液は室温(25°C)のプラスチックフラスコに保存します。

4. 活性分子のストック溶液の調製

注意:分子のDMSO、DMF、エタノール、または水での溶解度を確認し、最適な溶媒を選択してください。寄生虫に対する希釈毒性の影響を最小限に抑えるために、ストック溶液は検査対象化合物の最高濃度の少なくとも1000倍にすべきです。例えば、テストすべき最高濃度が1μMであれば、ストック溶液は少なくとも1mMであるべきです。10 mMのストック溶液を準備するには、以下の手順に従ってください:

1. 測定対象の化合物を0.0001gの精度で分析天秤で計量します。
2. 以下の式を用いて10 mM溶液を得るために必要な希釈液の体積を算出します:
   V (mL) = (Y MM) × 100
   どこ：
   Y:化合物の質量(ミリグラム単位)です
   MM:化合物のモル質量
   V(mL):溶媒の体積
3. 加重化合物を含む希釈剤を受受体に加えます。
4. ボルテックスミキサーを使って均質化します。
5. 溶液を小さな分割に分け、-20°Cの冷凍庫で保存します。
6. 使用前に、アリコート溶液を完全に解凍し、渦ミキサーで再び均質化します。
   注意:他の濃度のサブストック溶液を調製するには、以下の式を用いてください
   V (μL) = x mM × y μL/10 mM
   新しい溶液を準備するために必要なストック溶液の体積 V (μL) ×
   x mM:新しい溶液の希望濃度。
   y(μL):新しい溶液の望ましい体積。

5. 細胞培養

1. NHDFセルは37°Cの水浴でバイアルを優しく回して使用します。
   注:NHDF細胞は、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)や安定した単一層を形成する他の細胞株に置き換えることができます。プラークアッセイは、接触によって成長が止まる安定したモノレイヤーを形成する細胞株にのみ有効です。腫瘍株のように増殖抑制を示さない細胞株は使用できません。なぜなら、細胞は培養培地内の栄養素を寄生虫と競合し、寄生虫が形成するプラーク領域を補充するためです。
2. 解凍した細胞を直ちに15 mL円錐形チューブに移し、10 mLの補給RPMI-1640培地(シーステップ1)を挿入します。
3. セルを200 x g で室温で5分間遠心分離します。スピンサイクルが完了すると、チューブの底に細胞ペレットが見えるはずです。
4. 細胞ペレットを保存するために上清液を慎重に捨ててください。
5. 細胞ペレットを12mLの補充されたRPMI-1640培地(10% FBSを含む)で再懸浮させ、25cm2培養フラスコ3個または75cm2フラスコ1個をシードします。2〜3日後、逆位相対比顕微鏡で培養フラスコを調べ、細胞増殖の回復を判断します(細胞は少なくとも40%〜50%のコンフルエンスを示す必要があります)。
6. 細胞が完全な単分子層(100%コンフルエンス)に達したら、パスツールピペットで培地をフラスコから取り出します。培地とピペットは捨ててください。
7. 1〜2mLのPBSを1回フラスコに加え、1分待ってから取り除きます。
8. フラスコに0.05%トリプシン・バーセン溶液1mlを加え、5%_CO2、湿度、37°Cの温度で2分間インキュベーターに入れます。
9. 2分後、逆さ顕微鏡で細胞が剥離しているか確認します。
10. 10mLの血清学ピペットと自動ピペットディスペンサーを用いて、24 mLの補充済みRPMI-1640培地(10% FBS)で剥離細胞を再懸濁します。
    注:25 cm²または75 cm²の培養フラスコに結合した単分子層は、それぞれ5本または15本の他の25 cm²培養ボトルで複製可能です。
11. 必要な培地(24 mL)を加えた後、血清学的ピペットで細胞懸濁液を均質化します。
12. 培地中の細胞懸濁液4 mLを、それぞれ25 cm² フラスコ、または12 mLから75^{cm 2} フラスコに移します。最初のフラスコには4mLの細胞懸濁液を残すのを忘れないでください。
13. フラスコを_CO2濃度5%、湿度37°Cのインキュベーターに入れます。
14. 完全な単一層細胞が得られるまで待ちましょう(100%の合流)。
    注意:各フラスコには日付とパッセージ番号を記入してください。

6. 培養プレートの準備

1. 逆立顕微鏡を用いて培養フラスコ内の細胞単分子層(100%コンフルエンス)の完全性を検査します。
2. 上記のトリプシン化手順(ステップ5.7-5.9)に従ってください。
3. 5 mLの血清学ピペットを使い、剥離した細胞を4 mL RPMI培地で再懸浮させ、15 mLの円錐形チューブに移します。
4. 200 x g で室温で5分間遠心分離機にします。
5. 上澄液は慎重に捨てます。
6. 細胞ペレットを新鮮なRPMI-1640培地1mLで再懸浮させます。
7. ボルテックスミキサーを使って均質化します。
8. 滅菌チップを持つマイクロピペットで、10 μLを490 μLの4%ホルムアルデヒド溶液(希釈1:50)を含む1.5 mLのチューブに移します。
   注:希釈係数 = (総体積(μL))) / (試料体積(μL))
9. ノイバウアーチャンバーを設置しろ。
10. ボルテックスミキサーを用いて、寄生虫(項目6.8で準備)と固定液を均質化します。
11. 固定寄生虫を含む溶液を10μLノイバウアーチャンバーに加えます。
12. ノイバウアーの四つの区画を数え、それぞれ16の正方形からなる。
13. mLあたりの細胞数を決定します:
    細胞数(1mLあたり)= [(n°細胞/平方格)/4] × Fd × 10⁴
    どこ：
    Fd(希釈係数)= 50
14. 12ウェルまたは6ウェル培養プレートの各ウェルに、それぞれ5個×10個、⁴ 個、または10個の^5細胞を 、10%FBSを含むRPMI-1640補給培地の1または2mLに再懸濁させて播種します。
15. プレートを5%の_CO2、湿度の高い大気、37°Cの温度のインキュベーターに入れます。
16. 細胞単分子層が100%合流に達するまで待ちます。

7. タキゾイト の体外 培養

注:プラーク検査には、T . gondiiのRH株を推奨します。

1. パスツールピペットを使って、NHDF細胞の完全な単一層(100%コンフルルエンス)を含む25cm2フラスコから古い培地を捨てます。次に、フレスコに新鮮なRPMI-1640完全培地4mlを加えます。
2. 溶解感染培養液で、以前のフラスコから新鮮に排出されたタキゾイトを含む上清液5μLを移送します。5 μLの容量により、25 cm²フラスコあたり6〜7日の溶解サイクルが可能です。
3. 新たに感染したフラスコを_CO2濃度5%、湿度の高い大気、37°Cの温度のインキュベーターに入れます。

8. タキゾイト定量化

1. 新たに排出された寄生虫を含む培養フラスコから培地をパスツールピペットで取り出し、15 mLの円錐形チューブに移します。
2. チューブを室温で760 x g の温度で2分間遠心分離します。スピンサイクルが終わると、チューブの底にペレットが見えます。
3. 上澄液は慎重に捨てます。
4. 寄生虫ペレットを2%FBSを含む新鮮なRPMI-1640培地1mLで再懸浮させます。
5. ボルテックスミキサーを使って寄生虫の懸浮液を均質化します。
6. 10μLの寄生虫懸濁液を、490μLの4%ホルムアルデヒド溶液(1:50希釈)を含む1.5mLチューブに、滅菌先端のピペットで移します。
7. 6.10から6.12に記載されている手順に従ってください。
8. 1 mLあたりのタキゾイトの数を決定します。
   注:タキゾイトの数(1mLあたり)= [(n°タキゾイトの平方)/4] × Fd × 10⁴
   どこ：
   Fd(希釈係数)= 50

9. 化学ライブラリーからの活性分子に対するプラークアッセイ準備

注:このアッセイは、1μM濃度でT . gondii の増殖を50%以上減少させる分子を特定することを目的としています。このアッセイを開始する前に、細胞毒性アッセイ(例:MTS法やMTT法)を実施し、プラークアッセイで使用される化合物濃度が宿主細胞に有害でないことを確認しなければなりません。

1. 細胞培養が12ウェルまたは6ウェルのプレートで100%合流に達していることを確認しましょう。
2. 古い培地を廃棄し、12ウェルプレートと6ウェルプレートの各ウェルに、それぞれ2%のFBSを含む新鮮なRPMI-1640培地を1〜2mL追加します。
3. 各井戸に試験対象の化合物を所定の濃度で加えます。初回スクリーニングでは1μM濃度が推奨されます。
   注意:各井戸に加える体積を計算するには以下の式を用いてください。
   V (μL) = (井戸内の最終濃度 μM) × 井戸内の体積 (μL)) ÷ (ストック溶液 μM)
4. 各プレートウェルに、RHひずみの12ウェルプレート用に600タキゾイト、6ウェルプレート用1,000タキゾイトを加えます。
   注:寄生虫増殖の変動は、培養培地やFBSの供給者の違い、または使用する細胞株の違いによって生じる可能性があります。したがって、各検査条件に最適な寄生虫数を決定するためにパイロット実験を行うことが推奨されます。必要なら、この実験に使う寄生虫の量を調整してください。
5. プレートを37°Cのアニンキュベーターに5%の_CO2 、湿度の高い環境で7日間、攪乱せずに置きます。
   注意:7日間の潜伏期間中は、プレートを動かしたり触ったりしてはいけません。もしそうなれば、実験は台無しになります。

10. クリスタルバイオレットによるプレート染色と画像取得

1. 7日後、各ウェルから培地を取り除きます。
2. それぞれの井戸を室温で1xPBSで丁寧に洗ってください。
3. PBSは捨て、各ウェルに70%°のアルコール1mLを慎重に加えます。室温で15分置いてから捨てます。
4. 0.5%の結晶バイオレット水溶液を加え、室温で30分間放置します。
5. クリスタルバイオレット溶液を取り除きます。
6. それぞれの井戸を脱イオン水で丁寧に一度洗ってください。
   注意:洗浄時に培地やPBSを除去する際は、ピペットの先端でウェルの底に触れないでください。これは単分子層の完全性を損なう恐れがあります。洗浄作業中は、PBSやアルコールのジェットをセルに直接かけないでください。井戸の縁に沿ってしっかりと加えてください。
7. 皿を裏向きにして吸収性の紙の上に置き、余分な水分を抜き、室温で24時間乾燥させます。
8. 高精細フラットベッドスキャ^ナー28,29またはクーマッシーブルーゲルオプション21,22,30用に設定された画像記録システムでプレートを撮影してください。

11. 可逆性アッセイ

注:T. gondii タキゾイトを用いた可逆性アッセイの主な目的は、培養培地から化合物を除去した後、処理寄生虫の増殖能力が完全に消失するか減少するかを明らかに^{することです。}

1. ステップ6で説明したようにNHDFセルを6ウェルプレートにシーディングします。各ウェルごとに、10%のFBSを補充したRPMI-1640を2mLに再懸濁した1×10個の⁵ 細胞を追加します。
   注:各ウェルで細胞単分子層が100%合流に達すると、プレートはプラークアッセイの準備が整います。
2. 培地を捨て、各ウェルに2mLのフレッシュ培地に2%のFBSを加えた4タキゾイトを再懸濁させた1個を加えます。
3. タキゾイトがNHDF細胞と1時間相互作用した後、最終的な90%阻害濃度(IC₉₀)に近い濃度で選択化合物を加えます。薬物希釈剤のみを含む井戸が陽性対照として使用されます。
4. タキゾイトは37°Cのインキュベーターで4日間処理し、_CO25 %と湿度の高い環境で処理します。
5. 4日間の処理期間終了後、37°Cで1倍PBSでプレートを3回洗い、化合物を完全に除去します。
6. 各ウェルに化合物を含まない新鮮培地2mLを加え、培地をさらに7日間インキュベーターで保管します。
7. プレートにクリスタルバイオレット染料を塗り、ステップ10の手順で写真を撮ります。

12. ImageJソフトウェアを用いた画像解析

1. ImageJのソフトウェア³²を使って画像を開きます。
2. 楕 円 形選択ツール(図1A、B)を使って井戸に対応する領域を選択します。
   注意:選択時には、井戸境界で欠陥を示す領域は無視してください。これらは一般的に井戸の縁に存在します。
3. 新しい画像をコピーして作成する: Ctrl + Cを押して選択した領域をコピーします。 Ctrl + Nを押して新しい画像ファイルを作成し、コピーした画像を新しい黒いウィンドウに Ctrl + Vで貼り付けます。
   注意:新しい画像を作成する際は、デフォルト設定を使いましょう:8ビット、黒塗り、512×512ピクセル、1スライス(図1C)。
4. 画像 > しきい値を>調整するか、 Ctrl + Shift + T (図1D)を押してください。
5. 閾値ウィンドウで黄と赤のオプションを選択し、自動(図1E)をクリックします。
6. 「 分析」をクリックし、「 粒子解析 」を選択してください(図1F)。表示されたウィンドウにデフォルトのオプションを残し、「 OK 」をクリックしてください(図1G)。
7. 新しい窓が開く。% Area ( 図1Hで赤い長方形でハイライト)に表示された値をコピーして、寄生虫の増殖率や抑制率を計算します。
8. これらの手順をプレート上の各井戸ごとに繰り返します。
9. 拡散率を計算するには、以下の式を用いてください。
   増殖率=(処理面積÷面積制御井戸の割合)×100
10. 抑制率を計算するには、以下の式を用います。
    阻害率 = [1 - (処理面積の割合/面積制御ウェルの割合)] × 100

図1:ImageJソフトウェアでの結果の段階分析。 (A)「楕円形」ツールの選択。(B) 画像内の関心領域の選択。(C) 新しい画像ウィンドウ(Ctrl + N)で推奨設定を表示。(D) 「新しい画像ウィンドウに関心領域を貼り付けた後のしきい値解析」の手順。(E) 閾値ウィンドウで黄と赤の選択肢を選択し、白い部分がすべて赤で塗りつぶされる。(F)「粒子解析」で使用されるステップの順序。(G) 粒子解析に用いられる設定。(H)総破壊面積の割合の結果は要約ウィンドウに表示されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

13. 統計解析 sis

1. 増殖抑制率を計算した後、Officeソフトウェア内のExcelスプレッドシートでデータを整理します。
2. GraphPad Prism 5.0ソフトウェアを開き、 XY(新しい表とグラフの下)をクリックしてください。
3. Yセクション(「X:エラーバー」の下)にデータ重複回数(通常は3回の生物学的複製)を入力してください。この数は、実施された反復数によって異なる場合があります。
4. プロットの横で 「平均のみ 」を選択し、「他で既に計算済みの誤差値を入力」を選択してから 「作成」をクリックしないでください。
5. 濃度データはX軸に、増殖抑制率はA、A:Y1、A:Y2、A:Y3、A:Y4、A:Y5列に配置します。
6. =分析をクリックし、次に変換をクリックし、最後にOKを選びます。新しい窓が開く。この新しいウィンドウで、X = Log(X)を使ってX値を変換し、結果の新しいグラフを作成してからOKをクリックしてください。
7. = 解析 をクリックし、次に 正規化をクリックします。新しい窓が開く。「 0%はどう定義されるか?」のセクションでクリックして Y = 0.0を設定します。「 100%の定義はどうなっているか?」のセクションでクリックして Y = 100を設定します。「 パーセンテージ 」を選択し、「 結果の新しいグラフを作成」をクリックしてください。
8. 記号をクリックしてください:上にある 非線形回帰で曲線をフィッティング する= 解析。「 用量反応 - 阻害」をクリックし、次に 「log(阻害剤)」と「正規化反応」 - 可変傾きを選択し、「 OK」をクリックします。
   注意:以下の結果が表示されるウィンドウが表示されます:IC₅₀ (阻害濃度50%)、95%信頼区間、およびR2値。これらの値は重要であり、記事内の結果表に含めるべきです。
9. IC₂₅、IC₉₀、IC₉₅など他の抑制性濃度を推定するには、リンク(https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm)、Quick Calcs - GraphPad;EC:有効集中力。検査された各薬物ごとにPrismソフトウェアで得られるIC₅₀ とHillSlopeを報告してください。

結果

治療後のプラークアッセイを評価する際には、陽性(タキゾイトに感染し未処理の細胞)と陰性(DMSO0.1%の未感染細胞)の両方が重要です。実験終了時には、陽性コントロールウェルは接着細胞の残留を含む明確な空白空間を示すはずです(図2)。対照的に、ネガティブコントロール井戸は空白のない完全な単層を示すべきです。陰性コントロールは、単分子層の完全性と実験全体を通じて細胞の生存可能性を確認する上で非常に重要です。陽性対照は、検査化合物・薬剤による T. gondii 増殖抑制率の計算基準となります。したがって、正確な評価には、明確なプラークを持つ完全な細胞単分子層の残存物が必要です。コントロールを確認した後、処理済みのウェルを評価してください。

図2は期待される結果を示しています。陰性対照群は良好に保存された単層を示し、陽性対照群は保存された粘着細胞内に明確に定義された空白(プラーク)を示すことが観察できます。いかなる井戸にも誤った取り扱い、細胞に対する...

ディスカッション

抗拡散検査の新しいプロトコルの標準化は、将来の薬剤の特定に関する科学的研究を前進させるための基本的なステップです。ここで提示するプロトコルは、T. gondiiのタキゾイトに対する生体活性分子の活性を評価するための代替アプローチを提供します。T. gondiiは滑空運動で移動する強制的な細胞内寄生虫であるため、溶けた細胞から寄生虫が出ると、感染した細胞の近くにある細胞に侵入します。したがって、寄生虫が増殖するにつれて、明確な破壊領域(図2)が生じ、その大きさは逃げ出した寄生虫の数や侵入細胞の数に比例し、T. gondiiの増殖を測定することが可能になります。

プラークアッセイは、複数の分子を異なる濃度で検査することを可能にします。顕微鏡的定量分析に必要な類似の実験室構造を持ちつつ、より高いスループットを実現します^21,30

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン-EDTA	ライフ・テクノロジーズ	25300-062
10 mL 血清学ピペット	オーレン	K17-110
15mLファルコンチューブ遠心分離機	ファネム	モデル:206
5 mL 血清学ピペット	オーレン	K17-115
6ウェル培養プレート	サーステット	833920
分析的均衡	トレドのメットラー	モデル:AB204 シリアル番号:1116473813
抗生物質・抗菌薬(100倍)	ライフ・テクノロジーズ	15240-062
自動ピペット	カスヴィ	K1エイド
遠心分離機	エッペンドルフ	モデル5415 R シリアル番号:0023591
CO2インキュベーター	PHCコーポレーション	モデル番号:MCO-230AICUVL-PA シリアル番号:210360090
培養ボトル 25 cm2	サーステット	833910
ジメチルスルホキシド(DMSO)P.A.	メルク	1,02,95,21,000
エタノールP.A	メルク	1,00,98,31,000
胎児用牛血清(FBS)	ライフ・テクノロジーズ	12657-029
ホルムアルデヒド 37-38%	パンレアック	131328
GraphPadプリズム	GraphPadソフトウェア	-	バージョン 8.0.1
ImageJ ソフトウェア	-	-	バージョン 1.52e
画像記録システム	バイオ・ラッド	モデル: ケミドック MPイメージングシステム シリアル番号:734BR2249
層流フード	ベコ・ド・ブラジル	モデル:VLFS-09
L-グルタミン 200 mM(100X)	ライフ・テクノロジーズ	25030-081
マイクロチューブ 0.5 mL	サーステット	72,699
新生児正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)	ロンザ	CC-3132	ブラジル、フィオクルス・パランアキュートのシーラ・ナルデッリ博士より寛大に提供されました
ノイバウアーチャンバー 0.100 mm 0.0025 mm2	新しい光学系	7301-1
pHメーター	ミクロン	モデル:B374 シリアル番号:30/37
ピペット20-200およびマイクロ;L	Kasvi basic	22032893
ピペット2-20およびマイクロ;L	ラボメイト・プロ	656630226
ピペット 0.2-2 & micro;L	ラボメイト・プロ	556610114
ピペット 1000-5,000 & マイクロ;L	ユニサイエンス	YM4A021482
ピペット 100-1000 & マイクロ;L	エッペンドルフ・リサーチ・プラス	Q34354C
リン酸カリウム単塩基性化合物 (KH2PO4)P.A	シンセ	01F2002.01.AF
RPMI-1640 ミディアム	シグマ・オルドリッチ	R0883
塩化ナトリウム(NaCl)P.A.	クロモリン・クイアキュート;ミカ・フィナ	-
リン酸ナトリウム二塩基(Na2HPO4) P.A.	CRQ Produtos Quimicos Eireli	R2715920500
ヒント1.000 &マイクロ;L	サーステット	7,01,186
ヒント10とマイクロ;L	サーステット	7,03,010
ヒント:5,000 & micro;L	サーステット	70,11,83,001
ヒント 200 & マイクロ;L	サーステット	7,03,030
トランスファーピペット (3.5 mL)	サーステット	86,11,71,001
チューブ 15 mL	サーステット	6,25,54,502
バイオレットクリスタル	メルク	101408
ボルテックスミキサー	フェニックス	モデル:AP56 シリアル番号:6633
ウォーターバス	ブラジルのヘモキミカ	モデル:HM1003 シリアル番号:700001556