マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法

サマリー

ミトコンドリア染料標識の局所注射、シュワン細胞ミトコンドリアの生 体内 共焦点顕微鏡検査。この方法は、健康または病変したマウスの骨格筋組織で実証された概念実証を利用し、高解像度のミトコンドリア可視化を提供します。

要約

ミトコンドリアネットワークの形態は細胞の健康指標として広く用いられています。しかし、完全な組織内でミトコンドリア構造を定量化することは技術的に依然として困難です。神経筋接合部の維持と再生に不可欠な末端シュワン細胞(tSC)は、その解剖学的な位置と組織破壊への感受性のため、現地解析が特に困難です。このプロトコルは、標準的な共焦点顕微鏡を用いて、全身骨格筋およびマウスのtSCにおける三次元ミトコンドリアネットワークの形態をラベル付け・定量化するための再現可能なアプローチを記述しています。この方法は、膜電位感受性ミトコンドリア染料をin vivo で投与し、その後迅速な組織処理と高解像度共焦点イメージングを行います。画像スタックは、ミトコンドリアネットワークの接続性、面積、断片化を定量化するために解析されます。このプロトコルは、まずジストロフィーおよび健康な骨格筋で検証され、ミトコンドリア形態の予想される違いを確認し、その後、S100βレポーターマウスを用いて同定されたtSCsのミトコンドリアネットワークの可視化と定量に適応されています。このアプローチにより、トランスジェニックなミトコンドリアレポーターや専門的な画像プラットフォームを必要とせずに、完全な神経筋組織内のミトコンドリア形態の解析が可能になります。このプロトコルは大学のコア施設で一般的に利用可能な機器のみを必要とし、他の薄い組織や表面的にアクセス可能な組織にも適応可能です。

概要

ミトコンドリアは非常に可塑的な小器官で、細胞の肺として機能し、細胞呼吸中に酸素を消費して代謝需要に応じてアデノシン三リン酸(ATP)の産生を支えます1^。かつては離散的な小器官と考えられていましたが、現在ではミトコンドリアが^{高度に統合されており、局}所的な要求に従ってネットワーク全体でエネルギー基質を共有していることが理解されています。統合は分離よりも明確な利点を持ちます。連結ミトコンドリアはエネルギー不足を支え、代謝需要が高まる際に酸化リン酸化のための電気化学的勾配を維持します。実際、ミトコンドリアの分布、体積、形態はその周辺のエネルギー需要に適^{しています5。}健康面では、ミトコンドリアネットワークの定期的な入れ替わりが、ミトコンドリアの生合成、融合および核分裂イベント、そしてミトファ^ジー2,3によって維持されています。ミトコンドリアの生合成は、健康なミトコンドリアを維持し拡大するために必要です。身体運動などの代謝需要は、ペルオキシソーム増殖活性化受容体γ共アクチベーター1α(PGC-1α^)の発現を増加させます5。この過程は一次持久力信号、特に運動誘発によるAMPK活性タンパク質キナーゼ(AMPK)、カルシウム、活性酸素種^6,7の上昇を通じて行われます。核融合はネットワークを拡大し生存率を高め、欠損を補完します。一方、核分裂は機能不全領域^2,3,8を優先的に除外することでさらなるミトコンドリア損傷を軽減します。除去後、排除された領域はミトファジーを受け、機能不全の小器官やタンパク質の蓄積を防ぎます ^6,9。

骨格筋は体重の約40%を占め、好気代謝と細胞シグナル伝達にミトコンドリアに依存して恒^{常性を維持し}ています。骨格筋機能障害の条件下では、ミトコンドリアの品質管理機構が損なわれ^ます。筋機能障害の調査では、ミトコンドリア呼吸、体積、形態、活性酸素種(ROS)の生成を測定し、ミトコンド^リアの質を評価する^3,10。この点で、筋肉機能障害が長期化するとミトコンドリア呼吸が減少し、ROSが増加し、ネットワークは^3,10分断されます。ミトコンドリア形態の乱れは主にミトコンドリア核分裂タンパク質、ダイナミン関連タンパク質1(DRP1)およびミトコンドリア核分裂1(FIS1^)2,8,11の活性化によって引き起こされます。筋萎縮に反応して、外ミトコンドリア膜の表面に存在するFIS1は、DRP1を複数のDRP1二量体と共にオリゴマー化させ、ミトコンドリアの周囲にフィラメントを作り、その間も縮小し、最終的にミトコンドリアの特定の断片が「ピンチ」されるまで縮小し、断^{片化を促進し}ます^3,11。ミトコンドリア核分裂の過剰活動、新たに形成されたミトコンドリアの融合の減少、そして機能不全のミトファジーが、機能不全のミトコンドリアネットワークの断片的な外観を引き起こしており、不活動または病変した筋肉に見られるようなものです^2,12。

神経筋接合部(NMJ)は筋肉の興奮が起こる部位です。ソーマで開始される活動電位は軸索に沿って伝播し、ミエリン化シュワン細胞(SC)によって被覆され、終点は終末シュワン細胞(tSC)によって被覆されるNMJsで終わる。NMJは怪我後に再生可能です。しかし、損傷部位とNMJの距離が広がるにつれて再生の可能性と速度は減少します^13,14。神経切断、圧迫、伸ばによる損傷後、SCは脱髄前身様状態へと脱分化します^15,16。脱髄性SCは増殖し、マクロファージと協力して損傷部位と近位軸索切断部の間の破片を除去し、Waller変性を通じて再生のために局所環境を再構築します^17,18。移動するSCは炎症反応を示し、神経再生の成功のために環境を再構築します¹⁸。神経再生は前駆細胞様SCによって形成される神経鞘内で起こり、これらはバンガーバンドを形成し、そこから軸索が再生^します。軸索切断部はその後、糸足を伸ばして再神経支配¹⁴を開始します。再神経支配後、tSCがNMJ²⁰に再投資すれば、シナプス前は完全に再生できます。

ミトコンドリアの形態は細胞タイプごとに大きく異なり、組織機能²¹に準拠します。肝臓組織からの報告によると、ミトコンドリアはよりコンパクトで球状であるのに対し、脳の白質はより細長く^{管状であること}が示唆されています。加齢や酸化ストレスなどの条件下で挑戦すると、これらの組織のミトコンドリアはドーナツのような表現型を示します。しかし、骨芽細胞では、ミトコンドリアのドーナツ形成と断片化がミトコンドリアおよびミトコンドリア由来小胞の分泌増加、さらに骨芽細胞の成熟と関連していました²³。骨格筋のミトコンドリアネットワークは複数の種で広く研究されていますが、末梢神経系のtSCからのミトコンドリアネットワークのイメージングには依然として限界があります。これらは細胞の超微細構造が分離後に大きく変化するため、生 体内 で染色素で標的化するのが困難であり、伴う骨格筋の負荷が伴います。

生体内のミトコンドリア形態を捉えるために用いられるイメージング技術は、光顕微鏡と電子顕微鏡のいずれかに分類されます^。従来の光捕捉顕微鏡では、染料が生細胞に標識し、固定細胞に免疫標識を付け、ミトコンドリアを遺伝的に標^{識できます5,24}。生細胞イメージングは通常、蛍光解析前に20〜60分間細胞をインキュベートする必要があります。染料は膜電位を介してミトコンドリアに導かれ、したがって^膜電位が変化した条件下で変質されることがあります。理論的には、造影ローディングによって骨格筋内のtSCsのミトコンドリア形態を捉えることが可能である。しかし、組織全体の画像診断や詳細な標識技術が必要です。特に、骨格筋の標識による干渉なしに、ミトコンドリアを完全な構造内に捕捉します。これらの制約を克服するために、ミトコンドリア蛍光染色を用いて健康マウスおよびジストロフィーマウスの生体骨格筋を標識し、その後tSCミトコンドリアをin vivoおよびin situ画像で標識しました。脛骨前筋(TA)は、その浅い解剖学的位置、よく特徴付けられた注射量および筋膜の拡散^25,26,27、そして同時機能的測定に適していることから、骨格筋イメージングの最適化のために選定されました。大臀筋(GM)は、確立された注射手順^28,29、背景蛍光を最小限に抑える薄い構造、そしてGMと中臀筋間の神経筋接合部の浅い腹側位置により、tSCを骨格筋線維より優先的に標識できることに基づきtSC画像診断に選ばれました。

プロトコル

生後6か月(n=3)の成年雄DBA/2J[野生型(WT)] [RRID: IMSR_JAX:000671) およびD2.B10-DMD^D2.mdx/J [D2.mdx (mdx)] (RRID: IMSR_JAX:013141)、および3〜5か月齢(n=8)の成獣雄および雌のB6;D2-Tg(S100-EGFP)^1Wjt/J (S100B)(RRID: IMSR_JAX:005621)[DBAと差がないためWTともプール化]は、研究者管理の継続的なコロニーから使用されました。TAおよびGM注射、組織処理、画像診断の全体的な実験ワークフローは 図1にまとめられています。追加のD2。mdx マウスはmdxにおけるtSCイメージングのために研究者提供されました(n=1)。すべての動物処置はテキサスA&M大学の施設動物ケア・使用委員会(AUP 2022-0215)によって承認され、全米研究評議会の『実験動物のケアと利用ガイド』(第8版)に従って実施されました³⁰。安楽死は、麻酔下のイソフルラン過剰投与による子宮頸部脱臼によって行われました。

1. 2μMの蛍光ミトコンドリア染色作業液の製備

1. 製造元の指示に従い、ミトコンドリア染色(50μg)を322μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に懸浮させ、200μMのストック溶液を準備します。
2. 2 μMの作業液30 mLを準備するには、200 μMのストック溶液300 μLを29.7 mLの滅菌生理食塩水に移します。よく混ぜてください。
3. 2μMの作業液のうち250μLをマイクロ遠心分離機管に分割し、使用まで-80°Cで保存します。
   注:-80°Cで3年間保管しても検出可能な信号劣化は観察されませんでした。

2. 染料と動物の調理

1. 実験の15分前に冷凍したアリコットを1つ解凍します。溶液を30G、1ccのインスリン注射器に吸い込みます。
2. 動物にイソフルランで麻酔をかけてください。眼軟膏を塗布し、注射部位を剃り、動物と熱源の間に温度プローブを設置した温熱ランプで体温を維持します。
3. 剃った注射部位を70%イソプロピルアルコールで洗浄してください。

3. 脛骨前筋(TA)筋ミトコンドリア染料投与と機能

1. TA染料投与
   1. 麻酔下のWTマウスおよびD2.mdxマウスの右TA筋に2μMミトコンドリア染色50 μLを注入します。
   2. 針を膝の先位腱に差し込み、注射経路に沿って針を引き抜きながらプランジャーを押し込みます。
   3. 解剖前に1時間インボで培養します。
2. TA筋機能測定
   1. 45分間の染料培養後、イソフルラン(誘導2%–3%、酸素中1.5%–2%維持)でマウスを麻酔します。
   2. 左のTA筋を外科的に露出させつつ、周囲の組織は保存してください。遠位腱を筋肉テストシステムの荷重梁に結びつけます。
   3. 露出した筋肉を実験室用ワイプで包み、0.9%の無菌生理食塩水を40°Cに温めて3 mL min^⁻1 で洗浄します。 ヒートランプを使って筋肉温度を32°Cに保ちます。
   4. プラチナ/イリジウムのワイヤー電極を筋肉の腹部に配置し、直接刺激します。
   5. 負荷ビームをマイクロメーターに接続し、1 Hzの筋肉縮縮(T_w)を使って最適長さ(L₀)を調整します。デジタルキャリパーでL₀を記録します。
   6. 最大破傷性収縮(P₀)を140Hzで3回誘発し、収縮間に60秒の休憩を設けます。最も高い力の値(g)を記録します。筋機能システムと分析ソフトウェアを使ってデータを取得します。
3. TA組織処理
   1. 潜伏後、安楽死前にTA筋を分離・剥離します。
   2. 分離した筋繊維束を4%パラホルムアルデヒドに室温で15分間浸し、立体顕微鏡で優しく刺激します。
      注意:パラホルマルデヒドは有毒であり、適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用しながら化学換気フード内で取り扱うべきです。
   3. 細胞透過核酸染色を最終濃度5〜10 μg/mLに加え、核を標識します。
   4. 過剰な染料を除去するためにリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で3回、それぞれ5分間洗浄します。
   5. 50%、75%、100%エタノールで順に5分間脱水します。
   6. サンプルを室温で組織クリアリング液IおよびIIに順次30分間インキュベートし、十分な体積で組織を完全に浸かせます。
   7. クリアしたTAの束をカバースリップに置き、ガラスブロック(2.5cm×2cm×1cm;質量7.8g^)で優しく平らにします。

4. TA筋サンプルの画像診断

1. 共焦点顕微鏡で筋肉サンプルを画像化し、高分解能の三次元(3D)光学断片を取得します。
2. 筋肉のZスタック画像を、63倍倍の対物レンズ(N.A. 1.40)を用いて約100μmの深さで取得します。
3. 646nmの励起波長を持つイメージングシステムの共焦点ソフトウェアを使用して、最も少ない背景で最大の鮮明さを提供します。
4. 1μmステップサイズの「システム最適化」パラメータを用いたデコンボリューションモードで画像を取得します。
   注意:脱水や光漂白を防ぐために、組織を組織クリアリング溶液IIに移し、カバースリップに置いてください。画像撮影前に、クリアリング溶液2を組織に直接2滴置きます。

5。 GM筋肉のtSC染色ローディングと画像診断

1. TSCの特異的蛍光同定にはS100βマウスを使用します。
2. GM筋肉の上に小さな皮膚切開を行います。創傷閉鎖前に2μMの遠赤色蛍光ミトコンドリア染色をGMの下に75μL注入^します。
3. 傷口を閉じて45分間潜蔵し、基礎筋繊維の顕著な標識を避けてtSCを選択的に標識します。
4. GMの筋肉を解剖し、すぐに冷やした0.9%の無菌生理食塩水に入れます。余分な脂肪や結合組織を素早くカットしましょう。
5. 解剖したGMを画像診断用カバースリップに移します。
6. D2.mdxマウスを使用する場合のみ、マイクロセクサリーバスに蛍光アセチルコリン受容体(AChR)染料を1:500希釈で加えます。神経筋接合部(NMJ)のシナプス後成分を観察するために組織を30分間潜伏します。
7. この二重標識法を用いて、シナプス後ミトコンドリアとtSC特異的ミトコンドリアを区別します。
   注意:解剖後の形態変化を最小限に抑えるため、画像検査のためにカバースリップに置く10分以内の解剖と洗浄を制限してください。この期間は、解剖後の形態変化やミトコンドリア分解を最小限に抑えるために非常に重要です。
8. 共焦点顕微鏡を用いて高解像度の三次元(3D)光学断片を取得します。
9. tSCの約16μm深さで20倍倍の対物レンズ(N.A. 0.75)を用いてZスタック画像を取得できます。63倍倍の対物レンズを用いて、個々のtSCの高解像度代表画像を取得します。
10. 画像撮影中の組織脱水や光漂白を最小限に抑えるためのマウンティング手順を実施してください。
    注意:逆立型顕微鏡検査のために生理食塩水で組織をカバースリップに移し、腹側が下を向くようにしてください。
11. GMの背面に2μLの一般的な取り付け媒体を塗布します。
12. 均一なイメージング面を確保するために、キャリブレーション済みのガラスブロック(2.5 cm × 2 cm × 1 cm;質量7.8 g)を使って組織を優しく平らにします。

6. 集束イオンビーム顕微鏡

1. 既存のプロトコルに従い、集束イオンビーム走査型電子顕微鏡(FIB-SEM)を^{実施します。}
   1. FIB-SEMを適用して、共焦点画像で特定された新しい形態的特徴を確認・可視化します。

7. 画像解析

1. TA筋肉サンプル
   1. AI駆動の画像解析ソフトウェアを用いて、TAスキャンの共焦点光学断片(約1μm)の定量解析を行います。
      注意:アルゴリズム適応を促進するために、自動セグメンテーションの前に複数回の監督付きトレーニングセッションを実施してください。
   2. 単一の光学断面(Zスライス)をインポートし、黒い背景を除外しつつ、白いミトコンドリア染料を表すピクセル化された情報を保持するようソフトウェアに学習させます。
   3. 高品質な分析と正確性を確保するために、研究者がレビューできる画像マスクを開発しましょう。
   4. アルゴリズム最適化後に3D画像スタックを単一の光学セクションに分離します。
   5. 各3D画像から5番目のZスライスを選択し、各データポイントはサンプルごとの各セクションの平均値を表します。
   6. ミトコンドリア形態を定量化し、空間分布やネットワーク接続性指標を導き出します。
   7. すべての試料で強度閾値、エッジ検出設定、ボクセルサイズのキャリブレーションを標準化し、実験のばらつきを最小限に抑えましょう。
2. GMサンプル上のtSC
   1. 1μmの光学断片をZスタック(約6〜25μm厚)に組み立て、2D画像解析ソフトウェアを用いて画像を個別のカラーチャンネルに分離します。
   2. スケールバーを用いたソフトウェアのキャリブレーションと閾値調整を適用し、背景干渉を最小限に抑えてtSCミトコンドリアの可視化を最適化します。
   3. 二分化を行い、背景雑音を除去してtSCミトコンドリアまたはtSCを分離し、面積や粒子数の測定を行います。
   4. バイナリ画像を保存して一貫した処理を確保し、すべての画像実験を同一条件下で実施することで生物学的複製間での再現性を確保します。

8. 免疫組織化学

1. 最適な切断温度(OCT)化合物に左のTA筋サンプルを埋め込み、断面積(CSA)を評価しました。
   1. -17°Cに設定したクライオスタットを用いて厚さ10μmの切片サンプルを採取し、顕微鏡スライドに収集します。
   2. ラミニンの筋肉断面染色を用いて筋繊維境界を特定し、ウサギ抗ラミニン一次抗体(1:400)およびヤギ抗ウサギロダミン二次抗体(1:400)を用います。
   3. 画像撮影前に適切な装着媒体を使ってスライドをマウントしてください。
2. 共焦点顕微鏡を用いて、20x(N.A. 0.75)の対物レンズで1サンプルあたり2〜3の関心領域(580 x 580 μm)をランダムに選び、画像スライドを撮影します。
3. 筋肉あたりの領域ごとの平均値を分析し、TA筋断面あたり約400本の筋線維を解析します。
4. 半自動の筋肉分割ソフトウェアを使って、筋繊維をマスキングしてCSA(^μm²)を測定します。

9. 統計分析

1. 平均±平均の標準誤差(S.E.M.)として要約データを報告します。
2. 専用の統計ソフトウェアを用いて統計解析を行い、パラメータ的かつ非ペアの学生t検定を用いて、グループ平均差間の有意性を判断します。
3. TA筋のCSAおよび筋力に関する単純な線形回帰を行い、これらをDMD病理のマーカーとして用いて、TA筋とGMtSCのミトコンドリア形態を比較します。
4. DMD病理とミトコンドリア病理の相関を調べるために、ピアソン r 相関係数を評価します。統計的有意性を P ≤ 0.05と定義します。

結果

ミトコンドリアネットワークは、接続性の低下が予想されました
TA筋共焦点スキャンの代表的な3D蛍光画像を、WT群とmdx群の2群に分けて示します(図2)。WT群と比較して、mdxマウスのミトコンドリア結合性はWTに比べて低下しているように見えます(図2A–D)。mdxマウスではより多くの小さなミトコンドリア断片が観察されました[<100μm2](WT、17.3±3.5%;mdx、36.3±4.9%;P = 0.015)およびWTマウスと比較して大規模に相互接続されたミトコンドリアネットワークの数[1000 μm²]を減少させました(WT、23.5 ± 0.26%; mdx、16.8 ± 1.02%;P = 0.001)(図3A,B

ディスカッション

ミトコンドリアの細胞構造内の位置や形態は、ミトコンドリアの健康状態や代謝需要と相関しています²¹。ミトコンドリアの健康の臨床的意義と、異なる細胞タイプの呼吸動態や形態の違いを踏まえ、骨格筋でのミトコンドリア形態評価のための容易適用の共焦点顕微鏡法が開発され、生 体内 で維持が困難な組織タイプにおいて形態から示されるミトコンドリアの健康状態に関する情報を提供します孤立後の構造。この点で、蛍光ミトコンドリア染料を体内で制御的に負荷することで、骨格筋とtSCの両方にミトコンドリア を標識 し、健康や疾患における基本的な形態指標の定量化が可能になりました。

骨格筋は体重の40%を占め、呼吸、ミオキン分泌、移動に必要^です。ミトコンドリアの高い体重、分離の容易さ、そして多様な生理的効果から、1960年代以降、骨格筋におけるミトコ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-in-1 Whole Animal System	Aurora Scientific, Ontario, Canada	1300A	筋機能システムと分析ソフトウェア
AIVIA	Leica Microsystems, Bellevue, WA, USA	15	AI駆動型画像解析ソフトウェア
anti-laminin	MilliporeSigma	L9393-.2mL	筋線維の境界ラベル
B6; D2-Tg(S100-EGFP)1Wjt/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:005621	S100β
Cryostar NX50 Cryostat	Epredia, Kalamazoo, MI, USA	https://www.epredia.com/products/histology-instruments/cryotomy/cryostar-nx50	凍結切片装置
D2.B10-DMDD2.mdx/J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:13141	D2.mdx
DBA/2J Mouse Strain	Jackson Labs, Bar Harbor, ME	JAX:00671	WT
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	BP231-100	ミトコンドリア染色再構成試薬
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	細胞透過性核酸染色
ImageJ/Fiji	National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA	SCR_002285	2D解析ソフトウェア
Invitrogen ProLong Gold antifade reagent with DAPI	Fisher Scientific, Hampton, NJ, USA	P36941	実装媒体
KimWipe	Kimberly-Clark, Irving, TX, USA	06-666A	実験室用ワイプ
Leica LAS_X software	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	SCR_013673	共焦点ソフトウェア
MitoView Fix 640	Biotium	70075-50ug	遠赤色蛍光ミトコンドリア染色
NIS-Elements Advanced Research software	Nikon, Melville, NY, USA	SCR_014329	断面積解析ソフトウェア
Permount Mounting Medium	Fisher Scientific, Waltham, MA 02454, USA	#SP15-100	一般実装媒体
Prism 9 software	GraphPad Software, La Jolla, CA, USA	RRID: SCR_002798	統計解析ソフトウェア
Rhodamine (TRITC)	Fisher Scientific; Hampton, NJ, USA	AP132RMI	二次抗体
Stellaris 5 White Light Confocal Microscope and corresponding deconvolution software	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	158301313:158201310:158004752: 158301312:158301314:158401100: 158209011:158301130:158204510: 158301120:158401140:158204511: 15500332:15506428:15506517:155 13859:15521522:15525226:155252 32:15525314:15555009:15555017: 15555046:27100022:155933660: 155933666:155933668:158000640 :158002407:158003150:158004141 :158004201:158004421:158004423 :158200681:158202140:158203114: 158203200:158203220:158204201: 158204510:158204709:158301200: 9I_LL_STELLARIS_C:9T-CLSM-APP _CLASSC:9WE_LAS_405:9WE_ LAS_WLL:9WE_LL_STELLARIS_C	共焦点顕微鏡
SZ61	Olympus, Breinigsville, PA, USA	sz61	立体顕微鏡
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Scigen, Fischer Scientific, Hampton, NJ, USA	23-730-571	最適切断温度化合物
Visikol I	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H1-30	組織クリアリング溶液 1
Visikol II	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	H2-30	組織クリアリング溶液 2
α-bungarotoxin 552	Biotrend, Koln, Germany	00014	アセチルコリン受容体染料