機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル

サマリー

急性炎症性、感染性、構造的滑膜の変化を評価することができるヒト の生外 トランスウェルシステムを開発しました。

要約

関節炎は関節内の炎症状態であり、軟骨の損傷、痛み、可動域の喪失を引き起こします。関節炎研究の最近の進展は、関節包(例えば滑膜)がこの炎症の重要な原因であることを明確に示していますが、必須滑膜構造を再現するヒトモデルは存在しません。これに対処するために、合同宇宙分析システム(JSAS)が設立されました。前滑膜は全膝関節形成術(TKA)を受けた患者から術中に採取されました。滑膜を解離し、3mm生検コアに切片しました。コアは5μmまたは0.4μmのトランスウェル上部井戸に設置され、300μlのDMEMと10%のFBSを含みました。下部ウェルには600μLの培地が追加され、2〜3日ごとに交換されました。生存可能性は、高酸素(50%)、大気/標準(~21%)、生理学的(5%)の潜伏条件下で最大7日間評価されました。下部ウェルの刺激には、単球化学誘発タンパク質1(MCP-1/CCL2)、リポ多糖(LPS)、N-アセチルシステイン、 S. aureus、 B. burgdorferiが含まれていました。培地はELISAのために保管され、組織はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)解析のために保管されました。標準条件下では滑膜は3日間完全に生存可能でした。刺激は内膜および滑膜サブライニング細胞の構造と機能を変化させ、駐留マクロファージ境界の喪失、サブライニング拡張、病原性線維芽細胞のアップレギュレーション、サイトカインIL-1βおよびTNFαの産生などが含まれます。免疫細胞と線維芽細胞はフローサイトメトリー解析の結果、下部チャンバー(5μmの孔径)に移動しました。移動可能な B. ブルグドルフェリ は0.4 μmの孔径で組織内に移動しましたが、非運動性 のS. aureus は移動しませんでした。関連するサイトカインはELISAに十分な量で発現していました。JSASは、ヒト滑膜の急性変化を研究できるモジュールシステムであり、前臨床モデルで3D構造の複雑さを可能にしつつ、生物学的に重要な構造と機能を維持しています。

概要

関節炎は、米国成人の20%以上、65歳以上の50%が^{慢性疾患を}患っています。また、世界的な障害の主な原因の一つで^{もあります。}関節炎には軟骨損傷だけでなく、関節包や滑膜の炎症(例:滑膜炎)も含まれます。慢性滑膜炎は、変形性関節症や関節リウマチにおける骨や軟骨損傷を増強する炎症促進サイトカインの主要な原因である可能性が高いです^。3,4。したがって、滑膜内の免疫媒介性の変化を理解することは、関節炎患者に対する新たな治療的および予防的選択肢の開発に不可欠であると考えられます。

滑膜は、細胞内膜(IntL)とサブライニング(SubL)という二つの主要な層から成る組織的な構造です。IntLは滑液(SF)と接するもので、SubLはSF成分を構成し血管構造を含み^ます。IntLにはマクロファージと線維芽細胞様シノビオサイト(FLS)の両方が存在します。IntLのマクロファージは常駐細胞であり、SubL⁶内の間質性マクロファージによって局所的に更新されます。これらの常駐滑膜マクロファージ(RSMs)はCD206およびTREM2の発現によってM2歪み、上皮化され、タイトジャンクションマーカーを発現します。このIntLのサブ構造は、機能的かつ物理的に関節空間の恒常性を維持する上で重要な役割を果たす可能性があります^5,6。これは関節リウマチ(RA)で観察されています。例えば、IntLが分解すると、関節リウマチの患者は症状の悪化を経験し、内膜が再形成されると症状が解消^します。自然発生性RA寛解は特にMerTK ⁺CD206⁺滑膜マ^{クロファージ}と関連しています7。急性関節痛患者のSFでもRSMが確認され、感染性または炎症性疾患の重症度がRSMsおよび炎症性サイトカインの量と相関していることが確認されました⁸。残念ながら、IntLとSubLの構造、RSMやFLSの機能的変化、そして軟骨や骨を損傷させる可能性のある炎症メディエーターの産生との関係は、特に人間において調査が難しいです。

複数の臨床的に関連性の高い環境における滑膜炎の基礎メカニズムを探求するため、関節空間解析システム(JSAS)と呼ばれるヒト の体外 モデルが開発されました。このシステムは、炎症性および感染症性関節炎の広範な評価を可能にするモジュール要素を用いた再現性の高い結果を生み出します。本記事では、全関節置換術、JSAS設計、滑膜の急性構造変化を定量化するために必要な組織形態計測、免疫蛍光法(IF)、RNAscope、酵素結合免疫吸着法(ELISA)などの組織機能的応答など、一般的な開胸関節手術からの組織獲得の過程について説明します。JSASは一般的なヒト in vitro モデルと異なり、IntLおよびSubL構造を維持しているため、軟骨損傷を引き起こす急性または急性の活膜炎を近 体内 で知ることができます。滑膜の本来の構造を維持することで、炎症を抑制または持続させるRSMおよびFLSの内在能力を解明することが可能です。 生体外 モデルとして、末梢免疫細胞を滑膜マクロファージに分化させることも、滑膜を1〜2種類の離散細胞タイプに過度に単純化することも必要ありません。これは、自然に病変したヒト組織を用いることで、コラーゲン誘発性関節炎(CIA)などの動物モデルとは異なり、ヒトに関連する病原体特異的評価が可能です。最後に、複数の感染症をシミュレーションでき、変形性関節症や炎症性関節炎に加えて敗血症性関節炎のモデルも作り出します。主な制限は、アポトーシスが始まる前の標準条件下での3日間の培養です。

プロトコル

患者の同意および組織処理プロトコルは、地元の機関審査委員会(IRB)によって承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 組織取得および生検

1. 外科医のスケジュールに基づいて術前で患者を特定しましょう。全膝関節形成術(TKA)や脛骨結節骨切開術(TTO、別名フルカーソン病)などの開放関節手術を受けており、全身免疫調節薬を服用していない18歳から65歳の患者を対象にします。
   注意:理想的には、複数回の関節鏡手術または複数回のグルココルチコイド注射を受けた患者は除外してください。これらの患者は線維症による他の集団よりも術中の組織獲得失敗率が高いためです。感染移転のリスクを考慮し、C型肝炎またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)の既往がある患者の募集は、アウトカムに関係する場合を除き延期してください。感染の有無にかかわらず、常に新鮮な人体組織の安全な取り扱いを実践してください。
2. 整形外科医は標準手術の一環として関節切開術と解離術を行います。滑車溝のすぐ近位にある前滑膜を特定し、動脈骨筋の解離や内側・外側上顆付近の剥離を避けつつ、電気焼灼で滑膜を一括切除します。滑液切除術はTKAの結果に比較的中立的であり、炎症性の状態では有益である^{可能性があります。}滑膜を無菌状態で研究チームのメンバーに渡し、冷たいドゥルベッコリン酸塩緩衝生塩水(DPBS)を氷に浸した無菌標本容器に入れます。
   注意:外科チームが異常を認めた場合、または滑膜切除術が閉鎖や手術結果に影響を及ぼす場合は組織取得を中止してください。特に後者はTKAでは非常に稀であり、滑膜切除術は硬くなった関節を緩めるための伸展手術として用いられることがある。切除量は実験の規模によって異なります。組織1 cm² あたり約4個の3 mm生検コアを得ることが可能です。多くの場合、^24cm2 以上の組織を得ることが可能です。組織重量は外科的解剖に大きく依存するため、実験の適切性を判断するには表面積ほど信頼性が高くありません。 図1 はステップ1.2から1.7を示しています。
3. 滑膜をラボに戻し、プレートロッカーで冷たいDPBSで10分間2回洗浄します。
4. 滑膜を、バイオセーフティレベル2(BSL2)認証済みのキャビネット内の無菌条件下で、10cm以上の無菌ペトリ皿に移します。冷たく無菌の低グルコース、ドルベッコ改良イーグル培地(DMEM)をピルビン酸ナトリウムとL-グルタミンを含むものを加え、皿の半分を満たす量を加えます。滑膜は焼灼面(図2B)ではなく、真珠色のIntL層(図2A)で識別します。
   注:国際政府は脆弱です。剥がさないように注意してください。そうしないとサブライニングから離れてしまいます(図2A、ヘモスタットで掴んでいます)。真珠状の形状は、血腫(ヘモシデリンによる黄橙色の出現)、高BMI(脂肪に覆われる)、炎症(赤く、もろく、絨毛状)の既往歴によって変化することがあります。進む前にIntLを正しく識別することは絶対に不可欠です。外科的切除、焼灼、出血、凝固の兆候を注意深く調べ、以下の手順がIntLで行われていないか確認してください。
5. 焼灼側の余った脂肪組織や間質組織を切り離し、滑膜を分離し、全領域で約4〜5mmの組織深度を維持します。アイリスハサミやメスは、個人の好みに応じて使用されることもあります。視野を維持するために必要に応じてペトリ皿の媒体を変更してください。
   注:後部間質組織や脂肪組織は容易に切除できます。しかし、剥離の困難や強い抵抗を感じる場合は、靭帯の滞留、不適切な軟骨沈着などの組織化生、またはIntLの切断が示唆されます。
6. 適切な深さまで解剖されたら、検査状態ごとに最低2回の技術的再現のために必要に応じて3mmの生検コアを採取します。滑膜の内側をコアリングツールの方を向いて、ペトリ皿の表面に当てないようにしてください。質の高い生検パンチは、鈍くなるため交換が必要になるまで約10〜15回使用されます。鈍い生検パンチは内膜構造の損傷を引き起こすためです。
   1. 力強く垂直な荷重と優しいねじりでコア掘削を行います。もし組織がねじれるなら、生検器具は鈍くなり交換が必要になります。利き手でない方の手で鉗子や止血剤を使って安定させてください。
      注:3mmコアは組織灌流の最大化と患者あたりのコア数を最大化し、これらの実験に必要な十分な技術的再現を保証するために使用されました。異なるサイズのコアも使用可能ですが、このプロトコルでテストされたのは3mmのみでした。
      注意:不十分な剥離による過剰な保持脂肪は、JSAS内でコアが浮遊する原因となる可能性があり、これは最適とは言えません。コアが水中に留まるのではなく浮かんで表面に浮かぶ場合は、解剖に戻るか、水中のコアを選びます。
7. もう一皿のペトリ皿を開け、10%FBSを含む温めた培地5〜10mL(37°C)を充填します。平らなまたは歯のないピンセットで、コアをこの皿に移し、1〜2秒の優しい機械的攪拌でゴミを洗い流します。芯を強くつままないでください。そうすると内膜を傷つける恐れがあります。
   注意:ここで≤24時間、組織コアを標準設定の37°C、5%_CO2でインキュベーターに入れてお願いします。

2. 統合空間解析システム(JSAS)の設置

1. JSASの底部ウェルに、10%FBSを含む600μLの温めた低グルコースDMEMを準備します。1%ペニシリン・ストレプトマイシンはこのシステムで目立った悪影響が認められていませんが、十分に無菌が維持されている場合、抗生物質は通常培地に添加されません。
   注:細菌や異なる培地を必要とする細胞株と共培養する場合、下部ウェルは別の培地である可能性があります。細菌と共培養する場合は抗生物質媒体の使用は避けてください。
2. 底のウェルには、選んだトリートを加えます。例えば、リポ多糖(LPS)です。浸透圧差を避けるために、処理量は総体積の2.5%を超えないことが推奨されます(例:600 μLに対して≤15 μL)。処理によるpH変化があればバッファーし、pH7.0〜7.4を維持してください。それ以外は、車両のコントロールを活用しましょう。
3. 望ましい実験結果に応じてトランスウェルの孔径を選択してください(図3)。
4. トランスウェルに10%のFBSを含む低グルコースDMEM300μLを加えます。
5. 無菌鉗子で個々のコアをトランスウェルの培地に優しく移します。組織の向きは制御できません。しかし、間質組織の脂肪と自然な浮力により、ほとんどの組織コアの内膜は自然に下向きになります。
   1. コアのイメージを注意深く意識し、コア採掘の過程で内側の内側を乱す可能性があるため、実験開始時にほつれているように見えるコアの使用は避けてください。コアが浮いている場合は、解剖を改善し、別のコアを選びましょう。
      注意:組織の配向が重要な場合はコラーゲンマトリックスを考えてください。しかし、これにより底井戸の化学勾配が形成される時間に影響が出ます。
6. インキュベーターに37°C、_CO25 %で所定の時間入れます。
   注:生物学的変化の推奨最早時期は8時間です。生物学的活性の最新の検証された時間点は3日間です。

3. 実験的な削除と解析

1. 組織学では、無菌の非歯型鉗子を用いて組織を3〜5 mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)に移し、ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)分析を行います。埋め込みと断面作業の前にNBFで3〜7日間保管してください。
   1. 組織を長時間放置しないでください。これは自己蛍光を悪化させます。標準的な方法に従い、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)¹¹染色を含む組織形態測定、免疫蛍光(IF)¹²、および/またはIF13を用いたRNAスコープの染色を含む組織学的解析を行います。
      注意:組織を除去する際は、鉗子でトランスウェルを刺さないように注意してください。コアを移動させる際は非常に優しく、そうしないと内膜が解離してしまうことがあります。芯を優しく固定液に浸し、かき混ぜないようにしてください。NBFは認定された化学換気フード内で使用し、地域の環境衛生・安全(EHS)ガイドラインに従って廃棄しなければならず、シンクに流し込んではいけません。実験で未使用のヒト組織は、10%以上の漂白剤に30分間浸され、その後、地域の環境健康保障(EHS)規定に従い二次封じ込めにされ、ラベル付きのバイオハザードビンに捨てて焼却されます。漂白剤溶液は、地元の環境衛生局(EHS)の承認を受ければシンクに流し込むことができます。学校によって異なる地域のガイドラインに従いましょう。
2. 同じFFPEブロック内に技術的な複製を埋め込むことができます。サンプルの損失を避けるために、スクリーニング済みカセットを使用してください。縦軸上の厚さ5μmの断面。1枚のスライドに3つの連続セクションを配置します(補足図1参照)。
3. 画像H&Eスライドは明視野顕微鏡で10倍および40倍で撮影します。IntLを組織と空間の界面にある組織化された細胞層として特定してください。
   1. 各処理条件下で最低2回の技術的複製にわたり、代表的な10倍切片3本と40倍切片10本を取得し、視野内にIntLを保持します。高解像度のTIFFとして画像をキャプチャしてください。組織形態計測分析を行う:
   2. ImageJ/FIJIで測定を行います。まず、 Analyzeメニュー→Set Scaleを使ってスケールを設定します。セットスケールは、各顕微鏡の各対物レンズで画像化された校正スライドの使用を必要とします。まず、キャリブレーションスライド画像に基づいて直線ツールを使って既知の長さの線を作成します。スケールをグローバルに割り当てます。
      注:10倍ではスケールは3 px/μmです。40倍ではスケールは12 px/μmです。
   3. 直線ツールで10倍画像を使ってSubLの厚さを測定します。厚さはIntL面からSubLの底(μm)までの垂直深さとして測定します。各線を描いた後、キーボード ショートカット mを使って線の長さを測ります。
      1. 10倍画像ごとに最低5回の測定値を平均してください(図4A、B)。SubLと間質組織の遷移は、より組織化が弱く細胞細胞も少ないコラーゲンと脂肪を含む領域への移行によって区分されます(図4B)。組織区画間の遷移点を二分します。
   4. IntLの厚さ、IntLのセルラリティ、IntLの完全性、SubLセルラルの40倍測定は、まずAdobe Photoshop(または類似の画像編集ソフト)で40xのTIFFを開いてください。IntLは、1~5細胞の厚さの層として定義され、組織と空虚空間(例:滑液)の界面に独立した細胞層として組織されています(図4C)。
   5. 新しいレイヤーを作成します。 ポリゴンラッソ ツールを選択してください。マウスクリックで投げ縄を起動し、線のアンカー屈曲を行い、画像全体にわたってIntLとSubLのトランジションを二分します。そして、IntLのすぐ外の空いたスペースで投げ縄を続けます。
      1. ダブルクリックで投げ縄を閉じる。選択した部分を反転(逆選択)し、ペ イントバケット ツールで黒→スペースを埋めます。これでIntL以外のすべての領域がカバーされます。この画像をIntLを表す高解像度JPGとして保存し、レイヤーを非表示にします。
   6. 新しいレイヤーを作成します。ポリゴンラッソ設定で交 差機能を選択し 、新しいラッソエリアと古いラッソエリアが交わる場所だけを選択します。サブライニング層の周りにIntLの中央をクリックして巻きつけ、画像の左右の端を背景キャンバスに入り、SubLとその背後の無細胞組織の遷移部を二分します。
      1. SubLの下部が40x画像の寸法を超える場合は、残りのエッジの周囲の背景キャンバスを選択するだけです。再び、上記のようにこのエリアの逆部分を選択し、 ペイントバケット ツールで黒を塗りつぶします。この画像はSubLを表す高解像度JPGとして保存します。このレイヤー画像は後で参照できるようにPSDとして保存してください。
         注:赤血球はこれらのスライドでよく見られ、将来の細胞数測定に干渉する可能性があります。血管が広い範囲の場合は、ポリゴンラッソツールやペイントブラシツール、その他の選んだツールを使って、それらの部分を覆う別のレイヤーにマスクを作成します。
   7. FIJIでは、 IntL のマスク イメージを開いてください。直線ツールを用いて、ステップ3.3.2-3.3.3で40倍画像に対して最低5回の測定値を平均してIntL厚(μm)を測定します。
   8. 分割線ツールを使ってIntLの全長(μm)を測定します。その後、分割線ツール(図4D,E)で、無傷の領域の長さのみを測定します。完全に残っていないIntL切片は、細胞間の隙間、虫食いされた外観、組織からIntLが剥がれ落ちることで区切られます。
      1. 保持しているIntL境界の割合を(完全なIntL/総IntL)×100として計算します。これは、断面アーティファクトを補正するために同じ時間点制御と比較する必要があります。
   9. IntLマスク画像を用いてIntLのセルラリティを測定します。まず8ビットに変換します(画像タイプ→ → 8ビット)。次に閾値(画像→閾値)を用いてノイズを最小化し、セル識別を最大化します。しきい値メニューで暗 い背景 を選択し、下部のトグルで調整を行います。
      1. ノイズ(例:背景アーティファクト)が消えることで、元の核体数を維持しつつ、画像ごとの閾値を手動で決定します。忠実度を保つために、元の画像を頻繁に比較してください。ノイズが最小化(偽陽性)が最大(真核陽性)である場合、閾値を設定するのが適切です(補足図2参照)。
         注意:閾値は単一のスライドスキャンで一貫しますが、スライドスキャン間および個々の10x画像や40x画像間でも異なります。また、H&Eのバッチによって色の深みが一貫しない可能性が高いため、色の深みも異なります。したがって、単純なマクロは、患者、H&Eのバッチ、断面厚、照明条件(部屋や顕微鏡の明るさ・色温度)、画像取得に使用したソフトウェア、画像取得に使用した顕微鏡、ホワイトバランスやカラーバランシングアルゴリズムの使用など、いずれかのカテゴリーに違いがある場合には適切ではありません。このリストは網羅的ではありません。AmScope T390B-3M顕微鏡と対応カメラとソフトウェアを使い、薄暗い部屋で顕微鏡の光を最大にし、自動ホワイトバランス設定を用いて、3人の患者を対象に10枚のランダムな40倍画像を撮影した場合、閾値は96〜182の範囲で、平均は137でした。この広い範囲は、ユーザーの不整合ではなく、基盤となる8ビットヒストグラムの違いを反映しています。したがって、元の画像としきい値画像の視覚的忠実さを保証することは重要であり、しきい値の正確な数ではありません。このプロセスの自動化は、通常のベンチサイエンティストの範囲外であり、画像解析の専門家によるプログラミングが必要です。
   10. 細胞サイズ8-150μm^²の粒子解析(Analyze Particles、分析→粒子解析)を使って、細胞数の代替として核を特定しカウントします。設定でオーバーレイマスクを選択して、元の画像と比較して識別セルを可視化します。IntLは主に体積構造ではなく線形構造であるため、この100μmのIntL長(例:#cells/100μm)を正規化します。これは新たに採取された滑膜組織において、100μmあたり約13.19個(範囲5.4〜21.9、標準差3.9)の細胞を平均化した。
       注:範囲8-150μm^²は、セットスケールと閾値画像と元の画像との反復的な視覚比較に基づいて決定されました。データセットを通じて経験的に決定された限界は、マクロファージの細胞径が約8〜20μm^の範囲であるという形状仮定に対応し^{ています。}大きなサイズは、近接する複数の離散核が一つの細胞として読み取られることが多く、除外されました。
       注:同様のワークフローは、例えばQuPathでも確立されることがあります。
   11. 赤血球を除外したSubLマスクを開けます(図4G)。ステップ3.3.9-10で述べた8ビット変換、しきい値、および粒子解析を行います。SubLは体積層であるため、数えられたセル数をSubL面積の100μm^² に正規化します(例:マスクされていない面積の測定)(図4H)。
4. 下部ウェルの移動細胞のフローサイトメトリー解析では、300 x g 、4°Cで10分間遠心分離し、細胞ペレットを氷の上に保管します。24時間経過時には、3mm生検コアあたり約20,000個の生きた移動細胞が見込まれます。フローサイトメトリー法^{はこれまでに}発表されています。
5. ELISAでは、最大速度(>5000 x g)で4°Cで5分間遠心分離し、細胞や細胞の破片をペレットで除去します。希望の温度で保存してください。ELISA手法^{はこれまでに}発表されています。

結果

酸素培養条件の最適化

生理学的組織灌流は約6%〜8%の酸素であり、細胞培養の標準的な培養条件は大気中の酸素濃度(~21%)である¹⁶。比較すると、過酸素化は細胞培養の生存率を高める場合もあれば、毒性を持つ場合^{もあります。}JSASの適切な利用は滑膜組織の生存可能性の早期判断を必要としました。したがって、アポトーシスは0日目、1日目、2日目、3日目、5日目、7日目にカスパーゼ3免疫組織化学または免疫蛍光法で、生理的(5%_O2)、大気/標準(21% O₂)、および高酸素(50% O₂)の3つの酸素条件下で評価されました。アポトーシスは標準的な潜伏条件下で3日目に始まり、5日目にピークに達しました。過酸素および低酸素状態の両方で、アポトーシスは1日目から2日目に確認され、5日目にピークに達しました。このため、さらなる実験には標準的なインキュベーション条件が選択されました(

ディスカッション

この研究はJSASの能力、特に生きた滑膜組織を機能的に応答性のある滑膜構造で維持できることを示しました。ほとんどの培養条件下で72時間の培養期間中、細胞死は最小限でした。滑膜構造の微細な変化を評価するために、IntLおよびSubLの構造変化を定量化する独自の組織学的測定システムが記述されました。これらの変化は急性または急性から慢性の滑膜炎の兆候です。この定量化は、従来の分類システムがリンパ球浸潤やより^長い経過経過に依存するため、細胞内の機構的解析と組み合わせることで特に有益である。組織間で組織形態測定とELISAの結果に一貫性があり、約50人の患者を比較するために結果を正規化する必要がなかった。再現可能な組織形態計測に加え、JSASは免疫組織化学、フローサイトメトリー、ELISAも行っています。ここで検証されていないが、確かに有用なのは、バルクqPCR、シノウのフレイノを酵素的に分解して単一細胞懸濁液に分解したフローサイトメトリー、単一細胞RNAシーケンシング、または空間トランスクリプトミクスである。また、手術室からのリク...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm ペトリ皿	Corning	CLS430167
23srRNA RNAscope プローブ	ACD/Biotechne	468211
24ウェルプレート	Life Sciences	3524
3 mm 生検パンチ	Integra	12460406
50 mL コニカル	N/A
70% エタノール（滅菌用）	N/A
Borrelia burgdorferi	ATCC	35210	最大の病原性を示すために、後期指数増殖期で使用する必要があります
BSK-H	Sigma-Aldrich	B8291
CD68 抗体	Invitrogen	14-0688-82	1:1000
CO2 タンク（標準条件）	N/A
Dulbecco's リン酸緩衝生理食塩水（Ca-/Mg-）	Thermofisher	14190144
胎児ウシ血清	Biotechne	S11150	熱不活化 ロット：F22100
鈍刃鉗子	N/A
ヘモスタット	N/A
加湿セルインキュベーター（標準条件）	N/A
低酸素インキュベーター	N/A
低酸素タンク（5% O2, 5% CO2, 残り N2, 生理的条件）	N/A
IL-4 抗体	Thermofisher	MA5-42470	1:100
iNOS 抗体	Thermofisher	PA1-036	1:100
虹彩鉗子	N/A
リポポリサッカライド	Sigma-Aldrich	L2630
低グルコース DMEM（+ナトリウムピルビン酸、+L-グルタミン）	Life Technologies	11885084
MMP9 抗体	Thermofisher	MA5-32705	1:1000
モジュラーインキュベーターチャンバー（高酸素条件）	Emrbient, Inc	MIC-101
モノサイトケモアトラクタントプロテイン 1	Peptrotech	300-04-20UG
N-アセチルシステイン	Sigma-Aldrich	A9165	各実験で新たに調製し、等モル量の重炭酸ナトリウムでpH 7-7.4にバッファーすることが必要です
OPG ELISA	Millipore	RAB0484	1:1 希釈
リットル毎分フローレギュレーター付き酸素タンク	N/A
PDPN 抗体	Invitrogen	14-9381-82	1:100
プロピジウムヨウ化物	Thermofisher	J66764.MC
RNAscope マルチプレックス蛍光V2アッセイ	ACD/Biotechne	323100
sRANKL ELISA	MyBioSource	MBS262624	1:1 希釈
Staphylococcus aureus USA 300 MRSA	ATCC	BAA-1717
SYBR Green	Thermofisher	S7563	10,000X ストック
TNF 抗体	Thermofisher	PA5-19810	1:100
トランスウェルインサート - 0.4 μm サイズ	Millicell	PICM01250
トランスウェルインサート - 5 μm サイズ	Corning	CLS3421