本記事では、文陽定川煮込み薬によるM2マクロファージ分極の阻害による肺線維芽細胞線維化の調節に関する研究について述べています。
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本記事では、文陽定川煮込み薬によるM2マクロファージ分極の阻害による肺線維芽細胞線維化の調節に関する研究について述べています。
文陽鼎泉堂(WYDCT)が線維芽細胞機能、喘息における気道再構築、およびその基礎メカニズムに与える影響を研究すること。IL-4はRAW264.7マクロファージのM2分極誘導に用いられ、分極したマクロファージはWYDCTで処理されてマウス肺線維芽細胞への影響を調べられました。分極したRAW264.7細胞は異なる処理を受け、線維芽細胞と共培養されました。M1およびM2マーカーレベル、細胞形態、IL-6濃度を評価しました。STAT3タンパク質レベルを解析しました。線維芽細胞の生存性、増殖、コロニー形成、PCNA発現、フィブロネクチン、COL1A1、α-SMAの発現は、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、CCK-8、Edu、免疫蛍光法、コロニー形成法など様々なアッセイを用いて解析されました。WYDCTはRAW264.7細胞におけるIL-4誘発の形態変化を逆転させ、M2マーカー(Arg-1、CD206)およびIL-6のレベルを低下させ、RAW264.7細胞におけるSTAT3発現を減少させ、IL-6の補給によりM2マーカーへの効果が回復しました。さらに、WYDCTは線維芽細胞の生存率と増殖を抑制し、PCNA発現を減少させ、線維化マーカー(フィブロネクチン、COL1A1、α-SMA)を減少させ、これにより、マクロファージM2分極を抑制することで肺線維芽細胞の生存可能性、増殖、線維化を抑制していることが示唆されます。IL-6/STAT3シグナル伝達経路が重要な役割を果たす可能性があります。
喘息は気管支喘息とも呼ばれ、呼吸器の持続的な炎症状態です。アレルゲン曝露、低温、物理的・化学的刺激物と頻繁に関連し、炎症細胞の浸潤、気道の可逆的収縮、粘液分泌、気管支痙攣2を特徴とします。現在、世界中で少なくとも3億人の喘息患者がおり、その有病率は3年ごとに増加しています。2015年には40万人が喘息で亡くなり、これは深刻な世界的健康問題となっています。中国も同様の問題に直面しており、研究では喘息の有病率が4.2%で、成人患者約4,570万人を占めており、対照率は先進国の6.7%と比べて低いことが示されています。この病気にかかっている人々の福祉は大きく損なわれ、家族にとって大きな経済的負担となっています。
気道再構築は、コントロールが難しい喘息の治療において重要な要素と考えられています。したがって、慢性持続性喘息の治療が重要なポイントとなります。臨床では、吸入コルチコステロイドを気管支拡張薬と併用することがよくあり、患者の症状を効果的に緩和することができます。しかし、これらの治療には副作用があり、一部の患者にとっては症状改善に効果が薄い場合があります。さらに、喘息は薬を中止した後も再発する傾向があります。研究により、肺線維芽細胞の活性化は喘息の進行過程における気道再構築と関連していることが示されています。活性化後、肺線維芽細胞は表現型変換を経て、気道再構築の中核病理的特徴である細胞外マトリックス(ECM)沈着を促進する主要なタンパク質を分泌します。具体的には、フィブロネクチンはECM組み立ての初期の足場として機能し、他のマトリックス成分のリクルートと接着を促進します。COL1A1(タイプIコラーゲンα1鎖)はECMの主要な構造タンパク質であり、その過剰な蓄積は気道壁の肥厚と硬さを引き起こします。α-SMA(α平滑筋アクチン)は、線維芽細胞が強力な収縮性と分泌能力を持つ筋原線芽細胞へと変換し、ECMの沈着と気道線維化をさらに加速させます。
IL-6はSTAT3経路活性化において最も重要な細胞質シグナル伝達因子です。IL-6が上昇するとSTAT3経路が活性化されます。喘息マウスの肺組織では、STAT3およびリン酸化されたmRNAおよびタンパク質の発現が有意に増加します。IL-6/STAT3シグナル伝達経路は喘息治療の標的の一つです。研究により、IL-6/STAT3シグナル伝達経路の活性化が喘息における気道炎症と関連しており、この経路を阻害することで気道炎症を軽減できることが確認されています12,13。IL-6/STAT3はマクロファージのM2分極とも関連しています。海外の研究では、IL-6発現が下流のSTAT3活性化を有意に減少させることが示されており、これは肝臓の腫瘍表面数の減少、増殖の減少、M2マクロファージ数の減少と相関しています14。
マクロファージとして知られる免疫細胞は、古典活性化(M1)と代替活性化(M2)という異なる表現型に分類され、それぞれ独自の役割を担っています15。M1マクロファージは炎症反応や組織損傷を誘発し、M2マクロファージは細胞増殖を促進し、創傷の治癒と組織修復を促進します。研究によれば、喘息における気道の再構築はM2マクロファージと関連していることが示されています。in vitro 実験により、IL-4でマクロファージのM2分極を誘導することで、α-SMA陽性細胞の増殖能力が大幅に向上することが示されています17。M2マクロファージ分極の抑制は喘息における気道再構築の効果的な治療法です。
喘息は伝統中国医学における「Xiao Bing」のカテゴリーに属します。Xiao Bingの病理的要因は主に痰に関係しています。痰の生成は、内臓の陰陽のバランスの乱れに加え、外因性病原体、食事、病気後の状態などの外的要因が体液の移動に影響を与え、停滞や蓄積を引き起こすことによるものです。喘息治療における伝統中国医学のメカニズムの継続的な探求により、伝統中国医学が気道炎症の緩和、過剰な粘液分泌の減少、気道の再構築の抑制に顕著な効果があることがますます多くの研究で示されています18,19。Xiao Bingでは主に肺に影響を受け、次いで脾臓と腎臓が続きます。Xiao Bingの患者は肺気が不足し、外部病原体に対する防御力が弱いため、肺気の伝播が失われ、長期的かつ繰り返しの陽気損傷を負い、肺陽不足症を引き起こします。陽の欠乏は体液の異常な循環を引き起こし、それが痰に凝結します。長期発作では、冷痰は脾臓や腎臓の陽に影響を与え、陽の欠乏、陰陽のバランスの乱れ、体質の過剰な支配や欠乏、体液の異常循環といったパターンを引き起こします。肺は液体を分散できず、脾臓は水やエッセンスを変換できず、腎臓は蒸発して液体を変換できず、痰が凝縮し、喘息として現れるスタシスが形成されます。したがって、陽の欠乏が小Bingの根本原因であり、痰の停滞がその特徴です。文陽鼎泉湯は、エピミット(15g)、エフェドラ(加工済み)(10g)、人参(15g)、黄耆(15g)、イチョウ(15g)、フロス・ファーファラエ(15g)、苦杏(15g)、ピネリア・テルナータ(加工)(10g)、シサンドラ・チネンシス(10g)、ミミズ(10g)、ペルシカ(10g)、リコリス(加工)(10g)で構成されています。この薬方は『神生中妙芳』の丁川堂の改良された処方に由来し、陽を温め、気を強化し、痰を溶かし、血行を促進し、咳や喘息の緩和効果を持っています。この治療の臨床的有効性が確立されており、喘息における気道再構築のメカニズムに関する実験的研究が進められています。
吸入型コルチコステロイド、β2作動薬、IgEやIL-5を標的としたモノクローナル抗体ベースの生物学的製剤など、喘息に対する現在の薬理学的治療と比較して、文陽鼎泉(WYDCT)は多標的かつ安全な治療戦略の可能性を提供しています。従来のコルチコステロイドは気道の炎症を効果的に緩和しますが、免疫抑制、ホルモンバランスの乱れ、離脱後の再発などの副作用を伴うことが多いです。生物学的製剤はより特異的であるものの、高価で特定の喘息表現型に限定されます。これに対し、WYDCTは「陽を温め痰を解消する」という伝統中国医学の理論に由来し、免疫バランスの調整、気道炎症の軽減、気道再構築の抑制に包括的な効果を発揮しており、臨床および実験的研究で示されています。その多成分組成は、マクロファージの分極、線維芽細胞の活性化、サイトカイン放出を同時に調節し、喘息病理のより広範で持続可能な改善をもたらす可能性があります。
本研究では、文陽鼎泉湯(WYDCT)の水抽出物を12種類のハーブから固定された従来比率で抽出し、最終1 g/mL(粗剤換算)のストック溶液に濃縮し、細胞培養用にろ過しました。抽出物は、50、100、200 μg/mLの濃度で適用され、これらは非細胞毒性を確保しつつ薬理学的活性を維持するために、予備的な細胞生存能力アッセイに基づいて選択されました。in vitro モデルでは、IL-4誘導によるRAW264.7マクロファージのM2分極とマウス肺線維芽細胞(L929細胞)との共培養を用い、マクロファージパラクリンが線維芽細胞活性化および線維症関連応答に与える効果を評価することが可能となりました。これらの詳細は、気道再構築におけるWYDCTの線量応答特性およびメカニズム経路の今後の研究における再現可能な枠組みを提供します。
上記の発見に基づき、文陽鼎泉唐は喘息においてマクロファージのM2分極を抑制し、線維芽細胞の活性化を抑制することで気道再構築効果を発揮すると推測します。
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本研究は、国際的、国内的、機関的な動物扱いガイドラインに従い、関連法令に準拠して実施されました。具体的には、マウスを対象としたすべての処置は、チチハル医科大学第三付属病院の動物倫理ケア委員会(AECC-2022-009)によって承認されました。マウスは標準的な実験室環境下で飼育され、自由に餌や水が与えられ、苦痛を最小限に抑えるようあらゆる努力が払われました。人道的エンドポイントが確立され、研究を通じてモニタリングされました。
1. WYDCT抽出物の製製
文陽鼎川湯の12種類の薬草は伝統的な比率で計量されました:エピミウム(15g)、加工エフェドラ(10g)、高麗人参(15g)、黄耆(15g)、イチョウ(15g)、フロス・ファルファラエ(15g)、苦杏(15g)、加工された ピネリア・テルナータ (10g)、 シサンドラ・チネンシス (10g)、ミミズ(10g)、ペルシカ(10g)、 および加工リコリス(10g)を使いました。
蒸留水の10倍の量を加え、混合物を30分間沸騰させました。抽出は2回繰り返し、ろ過液を組み合わせました。結合抽出物は低圧下で濃縮され、粗薬換算濃度1 g/mLにされました。抽出物は0.22μmの膜を通してろ過され、アリクォートされ、−20°Cで保存されました。 作業濃度(50、100、200 μg/mL)は使用直前に希釈して調製されました。
2. 細胞培養とM2分極
RAW264.7細胞(ATCC、米国)は解凍され、10 mL DMEMに10 mL DMEMに10% 胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補足して、10 cm 皿あたり10× 10⁶ 細胞の密度でシードしました。細胞は37°Cの加湿大気で5%のCO₂を含む環境で24時間培養され、80%〜90%の合流に達するまで続けました。
培養培地は20 ng/mL IL-4を含む新鮮なDMEMに交換され、細胞はさらに24時間インキュベートされてM2分極を誘導しました。培養後、細胞はPBSで2回洗浄され、その後WYDCT抽出物(10 mg/mLの指定最終濃度に希釈されたストック溶液)で24時間処理されました。IL-6補給実験では、WYDCT治療中に50 ng/mLのIL-6を追加しました。
0.1%のDMSOで処理された細胞が陰性対照群として機能しました。細胞の形態を逆顕微鏡で観察し、代表的な画像を撮影しました。
3. マウス肺線維芽細胞の単離および培養
マウスは承認された倫理的プロトコルに従って安楽死させられました。肺葉を採取し、ハンクスの冷たいバランス塩溶液に入れました。見える血管と結合組織は摘出され、肺組織は小さく刻み(~1 mm3)にされました。
組織断片は0.25%トリプシンで37°Cで40分間穏やかに攪拌しながら消化され、その後0.25%トリプシンで30分間2回目の消化が行われました。細胞懸浮液は300 × g で5分間遠心分離し、上清液を廃棄し、10%胎児用牛血清を補足したDMEMに再懸浮させました。
懸濁液は線維芽細胞が付着するために100分間培養され、その後300×gで5分間遠心分離して精製を強化しました。精製された線維芽細胞は適切な培養皿に播種され、37°Cの加湿大気で5%のCO₂を含む環境で約80%の合流率に達するまで培養されました。
4. 線維芽細胞と調控培地の共培養
上清液は処理済みのRAW264.7細胞から採取され、3000 × g で4°Cで10分間遠心分離しました。 線維芽細胞培養培地は、収集したマクロファージ調整培地に置き換えられました。線維芽細胞は、機能分析を行う前に、37°Cの加湿大気で5%のCO₂を含む環境で24時間培養されました。培養後、線維芽細胞をRNAおよびタンパク質抽出のために採取し、その後のqRT-PCRおよびウェスタンブロット解析を行いました。
5. 細胞生存率(CCK-8アッセイ)
線維芽細胞は1ウェルあたり5×10³の密度で、100μLの培養培地を含む96ウェルプレートにシードされました。細胞は24時間にわたり指示された処理を受けました。その後、各ウェルに10μLのCCK-8試薬を加え、プレートを37°Cで2時間インキュベートしました。 光学密度(OD)はマイクロプレートリーダーを用いて450 nmで測定されました。細胞生存率は(OD_treated / OD_control)×100%と計算されました。すべての実験は3つの生物学的複製体で実施されました。
6. コロニー形成アッセイ
セルは1ウェルあたり1×10³セルの密度で6ウェルプレートにシードされ、各条件に3つの複製ウェルが設けられました。プレートは10〜14日間培養され、目に見えるコロニーが形成されました。コロニーは0.1%のクリスタルバイオレットで室温で10分間染色されました。染色後、コロニーは洗浄され、写真撮影が行われました。結合染料は30%酢酸に15分間溶解され、光学密度は590 nmで測定されました。3つの独立した実験が行われました。
7. EdU増殖アッセイ
細胞は24時間、所指示通りに処理されました。その後、各ウェルに50μMのEdU100μLを加え、セルを37°Cで2時間培養しました。 細胞は4%パラホルムアルデヒドに30分間固定され、2 mg/mLのグリシンで5分間焼入れされました。細胞はPBS中に0.5%トリトンX-100で透過され、洗浄後、アポロ染色液で30分間培養されました。核はHoechst 33342(1×)で30分間カウンターステインされました。EdU陽性細胞は蛍光顕微鏡で観察・画像化されました。
8. IL-6のELISA
RAW264.7の細胞上清液は3000 × g で4°Cで15分間遠心分離されました。IL-6レベルは製造元の指示に従いBeyotime ELISAキットで測定されました。吸収度はマイクロプレートリーダーで測定され、IL-6濃度は標準曲線に基づいて算出されました。
9. 免疫蛍光
線維芽細胞は予備冷却されたアセトンで10分間固定され、PBSで3回洗浄されました。細胞は0.1%トリトンX-100で10分間透過され、PBS中に1%BSAで30分間ブロッキングされました。その後、細胞はPCNAに対する一次抗体(1:100)と共に4°Cで一晩培養されました。 PBSで3回洗浄した後、細胞はFITC結合の二次抗体(1:200)と室温で1時間インキュベートされました。核はDAPIで染色され、洗浄され、蛍光顕微鏡で画像化されました。
10. qRT-PCR
トリゾール試薬(中国のBeyotime)を用いて、製造元のプロトコルに従い総RNAを抽出しました。逆転写はcDNA合成キットを用いて、2μgのRNAとランダムプライマーを用いて実施されました。PCR反応は、10μLのSYBRグリーンマスターミックス、各遺伝子特異的プライマーそれぞれ0.5μL(最終濃度0.5μM)、およびcDNAテンプレート1μLを含む20μLの容量で調製されました。使用されたプライマーにはCD16、iNOS、Arg-1、CD206、フィブロネクチン、COL1A1、α-SMA、GAPDH(配列提供)が含まれていました。
熱循環条件は、95°Cで5分間の初期変性、その後95°Cで30秒、60°Cで30秒、72°Cで30秒の40サイクルで構成されていました。溶融曲線解析を60°Cから95°Cまで0.5°C単位で分析し、増幅の特異性を検証しました。
データ解析:相対発現は2^−ΔΔCT 法を用いて計算し、GAPDHに正規化しました。プライマーは以下の通りです:CD16(マウス):5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGGAGG-3′および5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′、iNOS(マウス):5′-TGCTCCCCAGGAGGAGGGTGT-3′および5′-TGGTCTGTAGGGTAGGGG-3′、Arg-1(マウス):5′- GCTGCTGCTGCTGCTG-3′および5′- GGTGGCTGTGTGTGTC-3′、CD206(mo) 使用例:5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′および5′- CTGGGCTTCTGGATGTGTT-3′、フィブロネクチン(マウス):5'-CGTGTGAAGGTGTTTCTGC-3' および5'-GAGGTCAGTGTGTGTGTGT-3'、COL1A1(マウス):5'-CCCTGGACTACCTGGTTTT-3'および5'-GCGGGTCCCTTCTCTTC-3'、α-SMA(マウス): 5'-CTGGAACAGACACACCATTTC-3' および 5'-GGGACATAGCACAGCTTCTC-3', GAPDH(マウス): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATTCTGA -3′ および 5′- CCTGCTTCACCACCTTCTCTGAT-3′。
11. ウエスタン・ブロット
細胞はプロテアーゼ阻害剤を含むRIPAバッファーを使用して溶解されました。タンパク質濃度はBCAアッセイを用いて測定されました。SDS-PAGEでは、10%ポリアクリルアミドゲルの各レーンに60μgのタンパク質を充填し、120Vで1.5〜2時間分離しました。タンパク質は100Vの湿式転送法を用いてPVDF膜に1時間移送しました。TBS-Tで5%無脂肪乳で室温で1時間ブロッキングした後、膜は一次抗体(希釈1:1000)で4°Cで一晩インキュベートされました。 TBS-T洗浄後、膜はHRP結合二次抗体(希釈1:5000)で室温で1時間インキュベートされました。追加の洗浄後、ECL化学発光試薬を用いてタンパク質バンドを検出し、化学発光イメージングシステムで画像化しました。バンド強度はImageJソフトウェアを用いて定量化され、タンパク質レベルは内部対照としてGAPDHに正規化されました。
12. 統計分析
データはSPSS 17.0を用いて解析されました。連続変数は平均±標準偏差(SD)で表されました。2つのグループ間の比較は非ペアt検定を用い、複数群間の比較は一方向ANOVAとLSDの後継検定で行われました。p値が0.05未満の場合は統計的に有意とされました。
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WYDCTがマクロファージのRAW264.7細胞M2分極に与える影響
私たちは光学顕微鏡を用いてRAW264.7細胞の形態を観察しました。 図1Aに示すように、IL-4刺激は細胞を伸長させ、未処理の細胞と比べてより細長く紡錘状の形状を形成しました。さらに、IL-4刺激細胞は細胞質の粒度が増加し、培養基質への付着性も向上しました。これらの形態変化は、IL-4刺激がRAW264.7細胞の細胞構造および表現型に有意な影響を与えることを示唆しています。
WYDCT投与後、RAW264.7細胞の細胞形態が逆転しました。その後、qRT-PCRおよびウェスタンブロット解析を用いてM1マーカー(CD16、iNOS)およびM2マーカー(Arg-1、CD206)の発現を調べました。特に、CD16およびiNOSのmRNAおよびタンパク質レベルは有意に減少した(p <0.001)一方、Arg-1およびCD206のmRNAおよびタンパク...
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本研究の目的は、WYDCTが喘息における線維芽細胞活性および気道再構築に与える影響、ならびにその基礎となるメカニズムを探ることでした。現在の研究結果は、WYDCTがRAW264.7マクロファージのM2分極を阻害し、その結果、マウス肺線維芽細胞の生存率、増殖、線維化に影響を与えることを示しています。さらに、IL-6/STAT3シグナル伝達経路はこれらの効果の媒介において重要な役割を果たしました。
マクロファージ分極は喘息および線維症の病因において重要なプロセスです。Arg-1およびCD206のレベルを特徴とするM2マクロファージは、組織の再構築と線維化に寄与します。本研究では、IL-4刺激がRAW264.7細胞の形態変化を誘発し、伸長、細胞質の粒度増加、培養基質への付着性の向上につながりました。これらの変化はM2偏極の指標です。しかし、WYDCTによる治療によりこれらの形態的...
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この研究プロジェクトに貢献してくださったすべてのパートナーの皆様に心より感謝申し上げます。この研究は2022年の黒竜江省大学基礎科学研究運営費(No.2022-KYYWF-0827)の支援を受けており、感謝いたします。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アポロ643号ハイブリダイゼーション試薬 | 広州リボバイオ株式会社 | C10371-2 | |
| アルギナーゼ-1(E4U1I)マウスmAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 43933T | |
| BCAタンパク質濃度測定キット | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | P0012 | |
| BeyoBlot HRP結合マウス抗ウサギネイティブIgG(H+L) | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | A0210 | |
| 二酸化炭素インキュベーター | 上海立信科学機器有限公司 | HF240 | |
| CD206/MRC1(E6T5J)XP®ウサギmAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 24595T | |
| 細胞計数キット-8 | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | C0037 | |
| COL1A1(E8F4L)XPウサギmAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 72026T | |
| ジメチルスルホキシド | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | ST038-100ml | |
| DMEM高糖メディウム | グランドアイランド・バイオカル・カンパニー | 11965092 | |
| EDU | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | ST067-250mg | |
| FcγRIII/CD16(F6K6G)ウサギmAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 71345T | |
| 胎児子牛血清 | グランドアイランド・バイオカル・カンパニー | A5256701 | |
| フィブロネクチン/FN1抗体 | セル・シグナル・テクノロジー株式会社 | 63779S | |
| FITC結合ヤギ抗マウスIgG(H+L) | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | A0568 | |
| 蛍光定量PCR装置 | ヤルイ・バイオテクノロジー株式会社 | MA-6000 | |
| Hoechst 33342 ライブセル染色液(100倍) | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | C1029 | |
| iNOS (E1W4J) ウサギ mAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 70706SF | |
| 逆立顕微鏡 | 広州明美光電子技術有限公司 | MI52-N | |
| LRRK2 T1348N RAW 264.7 | ATCC | SC-6005 | |
| ミュノステイン透過バッファー(Triton X-100搭載) | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | P0096-100ml | |
| マウスIL-6 ELISAキット | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | PI326 | |
| マウス肺線維芽細胞 | 武漢プロセル生命技術有限公司 | CP-M006 | |
| PCNA(PC10)マウスmAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 2586T | |
| ペニシリン・ストレプトマイシン | グランドアイランド・バイオカル・カンパニー | 15140148 | |
| 組換えマウス IL-4 | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | P5916-5μg | |
| 組換えマウス IL-6 | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | P5925-10μg | |
| レデュ酵素ラベル装置 | レイト・ライフサイエンス | RT-6100 | |
| Stat3 (124H6) マウス mAb | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 9139T | |
| スーパークリーンベンチ | 濟南バイオベースバイオテック株式会社 | BBS-SDC | |
| SynGAP-&α;2(E4Y6I)ウサギm | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 56927T | |
| サーモフィッシャー・サイエンティフィック RIPA 溶解抽出バッファー | サーモフィッシャー | 89901 | |
| トリゾール(全RNA抽出試薬) | ビヨタイム・バイオテクノロジー株式会社 | R0016 | |
| &β;アクチン抗体 | セル・シグナリング・テクノロジー社 | 4967S |
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