本記事は以下の通りです:(1) DOL 6の時点で新生マウスにテスト分子を経口で投与すること;および(2) DOL 10から離乳(DOL 20)までの生検における大腸上皮障壁機能の生検におけるエクス ビビ 評価(Ussingチャンバーを用いた細胞外および細胞間透過性の評価)。
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この記事について
サマリー
要約
増え続ける証拠は、生後最初の1,000日が腸内マイクロバイオーム軸を形成する上で重要であることを強調しています。この早期の窓は、長期的な生理学的軌跡や免疫適応の確立に極めて重要であり、細菌群の乱れやバリア機能障害に関連する疾患への感受性に影響を与える可能性があります。基礎となるメカニズムをより深く理解するには、新生児腸の細胞外および細胞間透過性を含む主要な生理学的パラメータの包括的な評価が必要です。これらのパラメータを評価することは、早期の外因性分子曝露が腸の健全性や長期的な健康結果にどのように影響するかを明らかにするために不可欠です。したがって、この記事の前半では、マウスの子マウスに関心のある分子を生前1日から経口投与する方法を説明しつつ、ストレス、怪我のリスク、共食いを最小限に抑えることを述べています。潤滑された丸い先端の24-G給餌針は、最低体重2.5gのマウスの子マウスをガベージするために使われます。第2部では、DOL-10から離乳期までの子犬の大腸サンプルに対するUssingチャンバーアッセイを用いた生 前 外および細胞間透過性の評価を概説しています。ピンレススライダーは小型生検に適応され、ウッシングチャンバーと組み合わせて新生児の大腸サンプルをマウントします。細胞外プローブFITC-デクトラン4 kDaと細胞間マーカーホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ44 kDa タイプVIが、アッセイ開始時にシステムの頂端区画に追加されます。サンプルは0分、30分、60分、90分、120分に基底外側区画で採取され、プローブ通過を定量化します。両方のマーカーの通過は、プレートリーダーによって直接(FITC)および間接的に(HRP)定量化され、標準曲線を用いてフラックスで表されます。
概要
腸管の障壁の完全性は、粘膜免疫応答を調整し、腸上皮の選択的透過性を調節することで、全体的な健康維持に重要な役割を果たします。このバリアシステムは栄養素の通過を制御しつつ、病原体、抗原、毒素の全身循環への移動を防ぎます。この界面の慢性的な破壊は、腸の透過性の増加に伴い、一般に「リーキーガット」と呼ばれ、その結果としてだけでなく、慢性炎症状態やさまざまな腸外病変の原因としても特定されています2。
例えば、腸関門機能の低下は、炎症性腸疾患(IBD)、若年性特発性関節炎(JIA)、1型糖尿病(T1D)などの自己免疫疾患や代謝疾患の重要な要素であることが示されています。これにより、腸のバリア状態が重要なバイオマーカーであると同時に、病態生理学的プロセスの早期開始を防ぎ、急性炎症が慢性状態に進行するのを防ぐ治療的標的でもあることが示されています。
この文脈で、新生児期は腸と腸内細菌叢の界面の確立と成熟が生涯の腸および<....
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プロトコル
すべての動物処置は、関連する国内規則に従って実施され、フランス高等教育・研究・イノベーション省のAPAFISプラットフォーム(認可番号:APAFIS#23855)および国立研究庁(ANR)からの助成金(11-IDEX-0005-02、ANR-24-CE15-7152、18-IDEX-0001) を通じて 承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 新生マウスの子ガヴェージ
注:以下の方法はFrancisら12から応用したものです。元のプロトコルではDOL 2からマウスの子ガベージが認められていましたが、ここではDOL 6以前にはガヴェージは行われていません。なぜなら、より早い年齢の技術的要求がこの手順をかなり困難にしているからです。さらに、若い子犬を使うと、治療初期数日間での動物喪失リスクが高まり、より大きなコホートが必要になるため、研究が複雑になります。
- ガベージソリューションの準備とセットアップ
- 子犬を個別に体重測定してください。
- ガベージ溶液の濃度と体積を調整し、投与される総体積が体重1グラムあたり20μLを超えないようにしてください。
注:標準的な条件下では、マウスの子マウスはDOL....
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結果
標準曲線と井戸濃度の定量化
板の各井戸からブランクの平均値を差し引いた。吸光度はY軸、濃度はX軸に、GraphPad Prismの「標準曲線補間」関数を使って標準曲線が作成されました。すべての標準点が揃っていれば、「線」モデルが最も良い結果をもたらします。あるいは、「シグモイド、4 PL、Xは集中」モデルは非線形標準曲線補間において非常に柔軟性と正確性を提供します(図6)。Y軸のサンプルの吸収度値は標準値の下に貼り付けられ、結果タブ(図6)の「補間されたX平均値」から濃度を復元しました。
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ディスカッション
経口ガベージは、個体個体に正確かつ定義されたルミナル用量を繰り返し投与することを可能にします。対照的に、任意給餌は有効な代替手段であるものの、より少ない化合物量を投与し、投与精度を低下させるために動物ごとの投与時間を長く必要とします。さらに、経口ガベージは注射経路よりも大きな容量を受け入れ、低濃度でより多くの総用量を扱いやすく、投与時の潜在的な毒性を最小限に抑えます。消化管を通過することで化合物の分布量がさらに制限され、腸の透過性やバリア機能を標的とした研究に有利です。しかし、毒性は発生ウィンドウや分子クラスによって大きく異なります。したがって、新生児に対して初めて治療を行う際は注意が必要です。新生児の子犬のガヴェージは繊細な処置であり、特にDOL 10未満の子犬には訓練が必要です。PBSに含まれる濃い食用色素のトレーニングが推奨され、ガベージが成功すると子犬の胃が目に見えて暗くなることが推奨されます。胃の外、特に喉や胸部周辺に色が現れるのは、ガベージ失敗の.......
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開示事項
著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。
謝辞
この研究は、ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX、Fondation de l'avenir(2025年、AP-RM-24-012)、およびANR助成金Diab1GUT(ANR-24-CE15-7152)からの資金援助を受けて行われました。この調査はINFIBREXコンソーシアムの枠組みの中で実施され、フランス政府が開始し、パリ市立大学が「卓越主義」IdExプログラム(ANR-18-IDEX-0001)のもとで実施した「France 2030」投資計画の支援を受けました。炎症研究センターのウシング・チェンバー技術プラットフォームの貴重な支援に感謝申し上げます。また、アレクサンドラ・ウィレムツ氏とモード・ル・ガル氏の専門的な支援に特別な感謝申し上げます。また、炎症研究センターの動物施設プラットフォームの皆様にも心より感謝申し上げます。特にイザベル・ルノー氏とギヨーム・アンセルメ氏に特別な感謝を申し上げます。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10本のDPB(キャラ&カレッジなし)MG | ダルベッコス | 14200091 | |
| 抗HRP抗体 | ノルディック・バイオサイト | GTX10183 | モノクローナルマウスホースラディッシュペルオキシダーゼ IgG [2H11] |
| 双眼鏡ルーペ | オリンパス | SZ61 | 仕様書は不要です。 |
| 黒の96ウェルプレート平底 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 137101 | プレートは黒色で、蛍光測定に適応していなければなりません。読書中は蓋を外さなければなりません。 |
| BSA | メルク | A4503 | |
| C57BL/6Jマウス | チャールズ川 | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | メルク | 2382 | |
| クリア96ウェルクリアフラットボトムハイバイディング | コーニング | 9018 | |
| D-(+)-グルコース | メルク | G8270 | |
| 蒸留水2O | |||
| D-マンニトール | メルク | M4125 | |
| 細かい鉗子 | FST | 11445-12 | |
| ファインシザーズ | FST | 14058-09 | |
| FITC-デクストロン4Kd | FD4 | TdBラボ | 光劣化に敏感です。 |
| ヒートパッド | ミネルヴェ | 20 031 01 | |
| HRP | メルク | P8375 | |
| MgCl2、6H2O | メルク | M2670 | |
| Milli-Q H2O | |||
| P2300 イージーマウント 使用システム&議場 | 生理学的器具 | EM6-C-CE | システム、チャンバー、スライダーはすべて互換性が必要です。 |
| P2306 ユーシングチャンバースライダー | 生理学的器具 | PI-P2306 | スライダーのモデルは、サイズや組織の種類によって異なる種類があります。 |
| QuantaBlu フルオロゲンペルオキシダーゼ基質キット | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 15169 | |
| 再利用可能な丸い先端の給餌針 | FST | 18061-24 | 24ゲージ、先端径1.25mm、丸型先端。使用前に滅菌水、エタノール70%で洗い、高湯消毒が必要です。 |
| 重炭酸ナトリウム | メルク | S6297 | |
| 炭酸ナトリウム | メルク | S7795 | |
| 分光光度計 | TECAN | スパーク10M | 137101黒いプレートを使用する場合は、トップ取得付きのプレートリーダーが必要です。 |
| トゥイーン-20 | メルク | P7949 |
参考文献
- Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
- Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a ....
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