本記事は以下の通りです:(1) DOL 6の時点で新生マウスにテスト分子を経口で投与すること;および(2) DOL 10から離乳(DOL 20)までの生検における大腸上皮障壁機能の生検におけるエクス ビビ 評価(Ussingチャンバーを用いた細胞外および細胞間透過性の評価)。
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この記事について
サマリー
要約
増え続ける証拠は、生後最初の1,000日が腸内マイクロバイオーム軸を形成する上で重要であることを強調しています。この早期の窓は、長期的な生理学的軌跡や免疫適応の確立に極めて重要であり、細菌群の乱れやバリア機能障害に関連する疾患への感受性に影響を与える可能性があります。基礎となるメカニズムをより深く理解するには、新生児腸の細胞外および細胞間透過性を含む主要な生理学的パラメータの包括的な評価が必要です。これらのパラメータを評価することは、早期の外因性分子曝露が腸の健全性や長期的な健康結果にどのように影響するかを明らかにするために不可欠です。したがって、この記事の前半では、マウスの子マウスに関心のある分子を生前1日から経口投与する方法を説明しつつ、ストレス、怪我のリスク、共食いを最小限に抑えることを述べています。潤滑された丸い先端の24-G給餌針は、最低体重2.5gのマウスの子マウスをガベージするために使われます。第2部では、DOL-10から離乳期までの子犬の大腸サンプルに対するUssingチャンバーアッセイを用いた生 前 外および細胞間透過性の評価を概説しています。ピンレススライダーは小型生検に適応され、ウッシングチャンバーと組み合わせて新生児の大腸サンプルをマウントします。細胞外プローブFITC-デクトラン4 kDaと細胞間マーカーホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ44 kDa タイプVIが、アッセイ開始時にシステムの頂端区画に追加されます。サンプルは0分、30分、60分、90分、120分に基底外側区画で採取され、プローブ通過を定量化します。両方のマーカーの通過は、プレートリーダーによって直接(FITC)および間接的に(HRP)定量化され、標準曲線を用いてフラックスで表されます。
概要
腸管の障壁の完全性は、粘膜免疫応答を調整し、腸上皮の選択的透過性を調節することで、全体的な健康維持に重要な役割を果たします。このバリアシステムは栄養素の通過を制御しつつ、病原体、抗原、毒素の全身循環への移動を防ぎます。この界面の慢性的な破壊は、腸の透過性の増加に伴い、一般に「リーキーガット」と呼ばれ、その結果としてだけでなく、慢性炎症状態やさまざまな腸外病変の原因としても特定されています2。
例えば、腸関門機能の低下は、炎症性腸疾患(IBD)、若年性特発性関節炎(JIA)、1型糖尿病(T1D)などの自己免疫疾患や代謝疾患の重要な要素であることが示されています。これにより、腸のバリア状態が重要なバイオマーカーであると同時に、病態生理学的プロセスの早期開始を防ぎ、急性炎症が慢性状態に進行するのを防ぐ治療的標的でもあることが示されています。
この文脈で、新生児期は腸と腸内細菌叢の界面の確立と成熟が生涯の腸および全身の健康に深い影響を与える、独特で非常に敏感な発達の窓口を示しています。この初期段階では、腸上皮と免疫系は内因性および外因性因子の両方に対して敏感度が高まり、急速な成長と分化を経つ、同時に微生物の定着や食事の変化に適応します。この重要な発達段階で腸の障壁の健全性を損なう障害は、後の人生で幅広い急性および慢性疾患の発症に重要な役割を果たす可能性があります。これらの疾患には、食物アレルギーなどの免疫介在性疾患や、IBD、JIA、T1D 7,8,9のようなより重篤な慢性疾患が含まれます。これらの疾患は、病態生理学的過程がしばしば早期に発生していることを強調しており、主な発症は一般的に子ども期から成人初期の間に起こることが多いです(10,11)。したがって、新生児における腸の障壁機能を支配するメカニズムを理解することは、多くの慢性疾患の負担を減らすための予防および治療戦略の開発に不可欠です。
このような状況を踏まえ、腸の障壁の完全性、慢性疾患メカニズム、炎症を新生児の環境で研究するための信頼性が高く生理学的に関連性の高いツールの緊急性が迫っています。このようなツールは、成人の文脈で既に証明された実験的アッセイを精度と有効性を損なうことなく再現できるようにしなければなりません。さらに、新生児の文脈で腸の恒常性に有益または有害の影響をもたらすと予想される多くの分子候補の短期的および長期的な影響を調査することがますます緊急になっています。利用可能なツールの中でも、新生マウスの子マウスにおける経口ガベージ投与は、特定の発生段階で関心分子を確実に届ける非常に信頼性の高い方法です。さまざまな生物活性化合物、薬物、微生物代謝物が腸の成熟やバリア機能に与える影響を制御された調査を可能にします。
この記事の第一部では、マウスの子マウスのガベージ(早期の生命日(DOL)6の方法について説明しており、食物の多様化によって誘導される腸内細菌叢の種数の急増の前後の介入を研究できるようにしています。したがって、この技術により、子犬の成長と発達に伴う治療効果の縦断的分析が可能になります。
この記事の後半では、このアプローチを補完する形で、Ussingチャンバーを用いた大腸上皮障壁機能の 生外 評価により、透過性特性の感度が高く定量的な測定を提供します。新生マウス(例:DOL 10子株)からの大腸生検における細胞外および細胞経透過性の評価により、いくつかの主要な候補が上皮バリアの完全性と機能に与える影響を正確に決定できます。細胞外輸送は、上皮層の細胞間空間を通じて起こる本質的に受動的なメカニズムです。これにより、電気化学的および浸透圧的勾配によって駆動される小さな溶質が腔から基底外側側へと通過することを可能にします。このメカニズムは主にクローディンやオクルディンなどのタイトジャンクションファミリーのタンパク質によって調節されています。対照的に細胞間輸送は能動的なメカニズムであり、より大きな溶質の吸収を可能にし、特定のチャネル、キャリア、ポンプ を介して 上皮細胞を通じて起こります。
フルオレセイン・イソチオシアネート(FITC)-デキストラン(4 kDa)はその大きさゆえに主に細胞外輸送を行いますが、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(HRP;44 kDa)は細胞経路 を通じて 基底外側に選択的に運ばれます。これらの非内因性マーカーの定量化により、それぞれ細胞外および細胞間透過性を明確に評価することが可能になります。FITCおよびHRPを用いたウッシングチャンバーアッセイは組織構造を保持し、腸管の任意の区間における傍細胞および細胞間透過率をリアルタイムで測定することを可能にします。新生児のガバゲージとウシングチャンバー解析の組み合わせは、特定の分子が腸のバリア機能に即時的かつ長期的にどのように影響するかを研究する強力な戦略を提供し、炎症を緩和し慢性疾患を生命の初期段階から予防するための戦略を導きます。
まとめると、このプロトコルは以下の2つの補完的な実験手法を説明しています:(1) 新生児初期に関心のある分子をマウスの子に投与(ステップ1);(2) 新生児から離乳期の子犬までの腸管セグメントにおける傍細胞および細胞通過性の評価(Ussingチャンバーを用いて)(ステップ2-6)。
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プロトコル
すべての動物処置は、関連する国内規則に従って実施され、フランス高等教育・研究・イノベーション省のAPAFISプラットフォーム(認可番号:APAFIS#23855)および国立研究庁(ANR)からの助成金(11-IDEX-0005-02、ANR-24-CE15-7152、18-IDEX-0001) を通じて 承認されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 新生マウスの子ガヴェージ
注:以下の方法はFrancisら12から応用したものです。元のプロトコルではDOL 2からマウスの子ガベージが認められていましたが、ここではDOL 6以前にはガヴェージは行われていません。なぜなら、より早い年齢の技術的要求がこの手順をかなり困難にしているからです。さらに、若い子犬を使うと、治療初期数日間での動物喪失リスクが高まり、より大きなコホートが必要になるため、研究が複雑になります。
- ガベージソリューションの準備とセットアップ
- 子犬を個別に体重測定してください。
- ガベージ溶液の濃度と体積を調整し、投与される総体積が体重1グラムあたり20μLを超えないようにしてください。
注:標準的な条件下では、マウスの子マウスはDOL 6で2.5g未満になることはほとんどありません。 - 24Gの丸い先端の給餌針は脱イオン水でしっかり洗い流し、その後注射器で70%エタノールを洗い、オートクレーブ消毒してください。
注意:交差汚染を防ぐため、各処理グループごとに別々の給餌針を使用することが推奨されています。 - 消毒した温熱パッドの上に、~38°Cに設定した清潔なペーパータオルを置きます。
- ケージを開ける前に70%エタノールで手袋を洗い、子犬への臭いの伝わりを抑え、食人のリスクを減らしてください。
- 子犬の鳴き声によるストレスを減らすために、ダムを別の部屋の別のケージに移してください。
- 巣作りの材料で手袋をこすり、ガベージ中に外臭が子に伝わるリスクを抑えましょう。
- 子犬の歯突起(胸骨の下端)と吻部の間の長さを測定し、給餌針の最大挿入距離を示します(図1A,B)。
- マウスの子食道内ガベージ
- 針の先端を無菌状態で注射器に取り付け、必要な量以上のガベージ溶液を抽出して、気泡が入るリスクを避けて必要な量を投与します。気泡は誤嚥のリスクを劇的に増加させます。
- 利き手でない親指と人差し指で肩甲骨の間の皮膚を優しくつまみ、子犬を持ち上げます。
注意:子犬の背中に皮膚を多く剥がさないように注意してください。窒息を引き起こす恐れがあります。 - 子犬をほぼ水平に保ち、給餌針を口腔内に優しく挿入し、咽頭に垂直に進めて喉の奥まで伸ばします(図1C)。
- 同じ角度と深さを保ちながら、舌を避けるために針を口腔の右側または左側に滑らせます。
- 針の角度をゆっくり調整しながら、子犬の頭を優しく後ろに傾け、注射器、頭部、背中が揃い、頭がやや後ろ向きになるまで続けます(図1D)。
- 圧力をかけずに、注射器を自重でゆっくりと降りさせ、最大挿入マークが吻部の高さに近づくか到達するまで放置します(図1E)。
注意:抵抗がある場合は、注射器を指の間で前後に転がして優しく回転させて降下を容易にしてください。それでも注射が進まない場合は、挿入角度を調整するか、ガベージ溶液で潤滑された給針を使って手順をやり直してください。窒息を防ぐために、針は20秒以上刺したままにしてはいけません。 - 最大挿入マークに達したか近づいたら、すぐに希望のボリュームを分散します。ボリュームを供給中に抵抗が発生した場合は、注射器とヘッドバックの位置合わせを確認し、挿入深さをわずかに調整してください。
注意:長時間の針刺しは窒息、もがき、動物への怪我のリスクを大幅に高めるため、迅速な投与を推奨します。 - 適切な量が投与されたら、挿入時と同じ角度で針を優しく引き抜きます。
- 子犬を以前に置いたキッチンペーパーの上に置き、回復をモニターします。正常な呼吸パターンは20秒以内に戻るはずです。
注:動物の鼻や口から泡が現れると誤嚥を示し、DOL 14未満の子犬では即時安楽死が必要です。口中から口内に少量の血液が存在し、口咽頭と食道の間の病変によるものであれば、動物のモニタリングが必要ですが、体系的な安楽死は必要ありません。回復が不確実な場合は、横向きに寝かせてください。もし自分で元に戻そうとしなければ、すぐに安楽死させてください。 - 動物の回復が確認されたら、子犬を巣に戻し、母犬と再集合させます。
注意:DOL 10までは、子犬は移動が困難で、ケージ内のすべての子犬のガベージが完了するまで温熱パッドの上に留まることができます。年上の子犬はパッドに一人で置いてはいけません。逃げ出そうとする恐れがあります。
図1:DOL 10での新生マウスの子ガベージ。 吻突と木突起の距離を測定し(A)、給餌針に最大挿入長さをマーキングできるようにします(B)。給餌針は口腔の左側または右側(C)に挿入されます。喉の奥に到達したら、針の角度を調整し、注射器、頭部、動物の背中が揃うまで調整します(D)。針は抵抗なくゆっくりと滑り、最大挿入マーク(E)にほぼ到達するまで続けます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
2. 新生マウスの子の安楽死および大腸採取
- 国の法律で義務付けられた適切な方法で安楽死を行うこと。
注:DOL 10までの子犬の首切断およびDOL 10より上の子犬の子宮頸部脱臼が推奨されます。CO-2 や麻酔による安楽死は推奨されません。なぜなら、子犬はこれらの方法に強い耐性を示すからです。 - 安楽死した動物を双眼顕微鏡の下に置きます。
- 動物の腹部に70%のエタノールを塗布します。
- 鉗子を使い、腹部の皮膚とその下の腹膜をつまみ、腸を切らずに細かいはさみ(前尾軸に垂直)で大きな横腹部切開を行います。
- 細かいハサミを優しく切開部に差し込み、両側の腹膜を横切って切り開きます。
- 鉗子と細いハサミを用いて、胸部から骨盤下部までの腹膜の上部と下部の両方を切り開きます(図2A)。
- 大腸の遠位部分を特定し、その軸に沿って直腸に向かって切開します。
- 大腸の末端部や直腸部に切開して動員してください。
- 大腸を優しく引っ張り、盲腸に向かって進行し、結合組織や脂肪組織の欠片を取り除いていきます。
- 腸の上部、回腸接合部を切って腹部から大腸を解放します(図2B)。
- 盲点と近位結腸の最初の数ミリを廃棄し、ウッシングスライダーの開口サイズより大きい近位結腸から1〜2つのサンプルを採取します(図2C)。
注意:新生児大腸は非常に脆弱で、洗浄や装着時に簡単に裂けたり裂けたり、穴を開けたりする可能性があるため、2本の過剰な生検を確保することが推奨されます。 - ハサミを閉じた状態で、薄い圧力をかけて近位端から遠位端に滑らせて、平らな生検の糞便内容を優しく取り除きます。
- 空になった大腸の塊を氷のように冷たいKRBバッファーに入れます。
図2:DOL10の子の大腸の解離。 子の表皮と腹膜は、結腸の不意的な切開を避けるために2段階で切り開かれ、腹腔全体が露出するまで行われます(A)。大腸は、遠位/直腸切開の最初の切開から腹部から解放され、その後盲腸(B)の上方で2回目の切開を行います。近位結腸の最初のミリメートルは廃棄され、Ussingスライダーの開口サイズより大きい1〜2つの大腸サンプルが採取されます(C)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
3. マウス生検を用いた大腸透過性アッセイ(ウッシングチャンバー)
- アッセイの準備
- ウッシング実験の前日に。最適なアッセイ条件を確保するために、実験前日に複数の溶液を準備することが推奨されます。これらの解は 表1の指示に従って作成されます。
注:以下の表は12のウッシングチャンバーに必要な量を示しており、KRBは10倍多めに分かれているため、アリクオットが可能です。
注:KRB 10x溶液は4°Cで最大6〜12ヶ月間保存可能です。 - 実験当日、動物の安楽死の30分前:
- 表2の指示に従い、400mLのKRBバッファーを準備します。
注意:KRB 10x、脱イオン水、重炭酸塩は、CaCl2を加える前にCaCl2を15分間事前に混合し、15分間泡立てる必要があります。 - 炭化物システム(95%O2、5%CO2)を使い、新鮮なKRBバッファーを15分間バブル化します。
- 400 mLのKRBバッファーを2つに分け、200 mLのクレブス-グルコース、200 mLのクレブス-マンニトール、 そして表3に記載されたHRP溶液を準備します。
- 表2の指示に従い、400mLのKRBバッファーを準備します。
- システムセットアップの用法
- ウシングシステムを37°Cまで予熱します。
- チャンバーの事前組み立ては以下の通りです:
- 各スロットのラッチを持ち上げます。
- システムを締めずにチャンバーをスロットに入れてください。
- 2本のガス供給管をチャンバーの各部分に挿入します。
- 実験前に、前方開口部に4つの電極を導入するか(ここでは扱いません)、200μLの接着剤を充填した4つの開口部を密封してください。
- 漏れの可能性に備えて、チャンバーの下にトレイを置いてください。
- 組織の取り付け
- 以前に洗浄した大腸のサンプルをペーパータオルで軽く乾燥させ、余分な水分を取り除きます。
- 大腸の断片を虫眼鏡の下に置き、細かいハサミの刃を管腔部に非常に優しく差し込み、切り開きます(図3A)。
注意:ハサミを完全に挿入すれば、一動でカットできます。使用される結腸切片は、ねじれを避けつつできるだけまっすぐでなければなりません。 - 細かい鉗子を使って、組織をスライダーの白い部分に取り付け、腔内部分を操作者側に向けて上に保ちます。組織は脂肪、糞便、しわ、穿孔、裂傷の痕跡がなく、開口部を広く覆う必要があります(図3B)。
- スライダーを双眼顕微鏡の下で閉じて、組織の置換の可能性を調べます。スライダーに圧力をかけると組織のわずかな変形が見え、スライダーがきつく閉じられていることを示します。
注意:スライダーはウッシングチャンバーに設置し(図4)、準備が整い次第個別に平衡段階を開始して、試料脱水を防ぎましょう。 - スライダーを閉じたまま軽く圧力をかけながら、スライダーをウッシングチャンバーに挿入し、ルーメン(透明な部分)が左向きになるようにします。
- 両方のラッチを閉め、右側にあるネジをチャンバーが気密化し、スライダーが動かなくなるまで締めます。
- 最終セットアップとバランス調整
- チャンバーの左側(頂端)区画にクレブス・マンニトール4mLを加えます。
- チャンバーの右側(基底側側)区画にクレブスグルコース4 mLを加えます。
- 交差汚染を防ぐために、両方の区画の間に小さなパラフィルムを置いてください。
- ガスインテーク(95%酸素/ 5%CO2)を開けて、出力を1〜2バブル/秒間に設定します。
- パスツールピペットを使って組織やシステム内に大きな気泡を除去します。
- システムのバランスを最大20〜30分ほど待ちます。
- 表4に記載されたFITC 4kDa + HRP + マンニトール溶液を準備します。
- ウッシング実験の前日に。最適なアッセイ条件を確保するために、実験前日に複数の溶液を準備することが推奨されます。これらの解は 表1の指示に従って作成されます。
- 大腸透過性アッセイの開始
- システムが平衡に達したら、頂端区画(左)からクレブス・マンニトール200μLをFITC 4Kd + HRP + Mannitol溶液200μLに置き換え、直ちにタイマーを開始します。先端はコンパートメント内で優しく上下に洗い、各チャンバーの間に先端は捨てます。
- 各チャンバーごとに、基底(右側)区画から2×100μL(重複)を集め、黒い96ウェルプレートに堆積します。プレート内のFITCの光劣化を防ぐために、アルミホイルで覆います。
- 直ちに200μLを新鮮なクレブスグルコース200μLに置き換えてください。
- 2時間のタイムポイントに達するまで30分ごとにステップ(2)と(3)を繰り返し、 T0、T30、T60、T90 、 T120のタイムポイントを取得します。
- FITCの光劣化を防ぐためにアルミホイルでプレートを密封し、FITC定量化に進みます。
| MgCl2 1M | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 20 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| MgCl2, 6H2O | 203.3 | 4.066 g | 1 M |
| KRB 10X | |||
| MW(g/mol) | 最終巻 = 1L | 最終集中 | |
| ミリ-Q H20 | 最終巻に持ち込む | ||
| NaCl | 58.44 | 70 g | 1.198 M |
| KCl | 74.55 | 3.4 g | 45.6 mM |
| Na2HPO4 , 2H2O | 177.99 | 1 g | 5.62 mM |
| NaH2PO4 、2H2O | 156.01 | 2.3 g | 14.7 mM |
| MgCl2 1M | 5 mL | 5 mM | |
| 重炭酸塩 750 mM | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 250 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| NaHCO3 | 84 | 15.75 g | 750 mM |
| CaCl2 2M | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 50 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| CaCl2 | 111 | 11.098 g | 2 M |
表1:ウッシング実験前日の溶液調製。
| KRBバッファー(400 mL) | ||
| 音量 | 最終集中 | |
| KRB 10X | 40 mL | 1X |
| H2O(ミリ-Q) | 352 mL | |
| 重炭酸塩 750 mM | 8 mL | 15 mM |
| CaCl2 2M | 240 μL | 1.2 mM |
表2:ウッシング実験当日のKRBバッファー準備。
| クレブス-グルコース/マンニトール(それぞれ200 mL) | ||||
| 最終体積 = 200 mL | 最終集中 | |||
| KRBバッファ | 最終巻に持ち込む | |||
| グルコース | 360mg | 10 mM | ||
| または | ||||
| マンニトール | 364mg | 10 mM | ||
| HRPソリューション | ||||
| 最終体積 = 1480 μL | 最終集中 | |||
| クレブス・マンニトール | 最終巻に持ち込む | |||
| HRP | 13mg | 8.8 mg/mL | ||
表3:ウッシング実験当日のクレブス-グルコース/マンニトール溶液およびHRP溶液の調製。
| FITC 4kDa + HRP + マンニトール溶液 | ||
| 12室の場合 | 音量 | 最終集中 |
| HRP(8.8mg/ml) | 1345 μL | |
| クレブス・マンニトール | 1155μL | |
| FITC 4Kd | 166.6mg | 16.66 mM |
表4:ウッシング実験当日にFITC 4 kDa + HRP + マンニトール溶液の調製。
図3:DOL 9の子犬からの大腸サンプルのマウント。 細いハサミの刃を試料の管区間に挿入し、一度の動きで切断します(A)。開封された試料はUssingスライダーの開口部に取り付けられ、ルミナル側はオペレーター(B)に向いています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図4:完全に準備されたウシングチャンバーの写真。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
4. FITC定量による大腸側細胞透過性評価
- FITC規格の準備
- 表 5 および 図5に記載された標準希釈液を準備するため、FITC 4Kd + HRP + マンニトール溶液をクレブス・グルコースで希釈します。
- 各標準希釈液を1〜7号まで2×100μL(重複)を板内に堆積します。プレートをアルミホイルでシールして光から守り、プレートの読み取りが始まるまで保護してください。
- データ取得:プレートリーダーを使い、励起波長を485 nm、発光波長を535 nmに設定し、できるだけ早くプレートを読み取る。
注意:最適ゲインと手動設定ゲインの両方でプレートを読み込むことが推奨されており、プレート間値の比較を容易にし、標準希釈時に誤りがあった場合の補間を可能にします。 - プレート保存:FITC定量データが保存されたら、HRP定量を行う場合はアルミホイルで密封して4°Cで一晩保管し、長期間保存する場合は-80°Cで冷凍保存してください。
図5:FITC標準希釈調製の視覚的表示。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。
| FTIC標準希釈 | |||||||
| 番号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 希釈 | 1:10000のFITCストック解 | 希釈1:1の1:2 | 希釈量n°2の1:2 | 希釈量1:10 | 希釈量n°4の1:2 | 希釈量n°5の1:2 | |
| クレブス・グルコース | |||||||
| FITC(μM) | 1.66 | 0.83 | 0.415 | 0.166 | 0.083 | 0.0415 | 0 |
表5:ウッシング実験当日のFITC標準希釈剤の調製。
5. HRP定量による大腸間透過性評価
- HRP定量アッセイの前日に:
- アッセイ当日に最適な条件を確保し、実験前日には複数の溶液を準備する必要があります。これらの解は 表6に記載された通りに作成されます。
注:以下の表は96ウェルプレート1枚に必要な量を示しています。HRP規格は分割され、-20°Cまたは-80°Cで数か月間保存できます。不安定性のため、新鮮な炭酸塩/重炭酸塩緩衝材のみを使用してください。 - 抗HRP抗体溶液の準備後、直ちに100μLの1ウェルあたり100μLをClear 96ウェルのクリアフラットボトム高結合マイクロプレートでコーティングします。アルミホイルで包み、4°Cで一晩培養します。
- アッセイ当日に最適な条件を確保し、実験前日には複数の溶液を準備する必要があります。これらの解は 表6に記載された通りに作成されます。
- HRP定量アッセイの当日:
- 表7に記載された5%BSAブロッキングバッファを準備します。
- プレートの中身を捨て、280μLのPBSトゥイーンで4回洗い、洗う間に350回転で1分間振る。
- 各ウェルに200μLのBSAブロッキングバッファを追加します。
- アルミホイルでプレートを密封し、シェイカーで500rpmで最低1時間孵化します。その間に、サンプルを解凍して希釈(1:10または1:50)し、 表8に記載された標準希釈液を準備します。
- プレートの中身を捨て、280μLのPBSトゥイーンで4回洗い、洗う間に350回転で1分間振る。
- 標準または希釈したサンプル50 μLを加え、プレートを密封して300 rpmで1時間のRT培養を行います。
- インキュベーション中は、QuantaBlu試薬をRTに持ち込み、 表9に記載された動作液を準備します。
- プレートの中身を捨て、280μLのPBSトゥイーンで4回洗い、洗う間に350回転で1分間振る。
- 各ウェルに100μLのQuantaBlu作業液をRTまたは37°C(平均1.5〜90分、平均30分)で加えます。
注:アッセイの進行後には、UV光源の下で強い青色蛍光が現れることがあります。 - 各ウェルに100μLのQuantaBluストップ溶液を加えて過酸化酵素活性を抑制します。プレートを密封し、RTで350rpmの攪拌下で10分間培養します。
- プレートリーダーを使い、励起波長を315nm、発光波長を470nmに設定します。できるだけ早くナンバープレートを読んでください。
注意:最適ゲインと手動設定ゲインの両方でプレートを読み込むことが推奨されており、プレート間値の比較を容易にし、標準希釈時に誤りがあった場合の補間を可能にします。QuantaBluのフルオロゲンペルオキシダーゼ基質キットの代わりに、テトラメチルベンジジンなどの他のペルオキシダーゼ基質(450 nmまたは650 nmで測定、停止液の有無)も使用できますが、この代替品の使用は感度が低下するという代償があります。
| BSAソリューション | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 12.7 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| BSA | 66430 | 1.27 g | 100 mg/mL |
| クレブス-グルコース+BSA | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 30 mL | 最終集中 | |
| クレブス・グルコース | 最終巻に持ち込む | ||
| BSAソリューション | 60 μL | 0.2 mg/mL | |
| PBSトゥイーン | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 500 mL | 最終集中 | |
| PBS 1X | 最終巻に持ち込む | ||
| トゥイーン-20 | 500 μL | 0.1% | |
| 炭酸ナトリウムソル。 | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 3.22 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| NA2CO3 | 105.99 | 34.13mg | 0.1 M |
| 炭酸水素ナトリウムソル。 | |||
| MW(g/mol) | 最終体積 = 12.7 mL | 最終集中 | |
| ミリ-Q H2O | 最終巻に持ち込む | ||
| NaHCO3 | 84 | 106.68mg | 0.1 M |
| コーティングバッファーpH 9.6 | |||
| 最終体積≈ 11 mL | |||
| 炭酸ナトリウムソル。 | 2.58 mL | ||
| 炭酸水素ナトリウムソル。 | pH = 9.6(~8.4 mL)まで加えます。 | ||
| 10 μM HRP規格 | |||
| 初期集中 | 最終体積 = 5 mL | 最終集中 | |
| クレブス・グルコース | 最終巻に持ち込む | ||
| HRPソリューション | 8.8 mg/mL | 50 μL | 0.088 mg/mL |
| BSAソリューション | 100 mg/mL | 10 μL | 0.2 mg/mL |
| 1.5 nM HRP標準 | |||
| 初期集中 | 最終体積 = 15 mL | 最終集中 | |
| クレブス・グルコース | 最終巻に持ち込む | ||
| 2.0 μM HRP標準 | 0.088 mg/mL | 2.25 μL | 13.2 ng/mL |
| BSAソリューション | 0.2 mg/mL | 3 μL | 40 ng/mL |
| 抗HRP抗体溶液 | |||
| 初期集中 | 最終体積 = 10 mL | 最終集中 | |
| コーティングバッファー | 最終巻に持ち込む | ||
| 抗HRP抗体 | 5.6 mg/mL | 8.93 μL | 5 μg/mL |
表6:HRP実験前日の溶液調製。
| BSAブロッキングバッファ | |||
| 初期集中 | 最終体積 = 25 mL | 最終集中 | |
| PBS 1X | 12.5 mL | ||
| BSAソリューション | 100 mg/mL | 12.5 mL | 50 mg/mL |
表7:HRP実験当日のBSAブロッキングバッファーの準備。
| 標準 | クレブス-グルコース+BSA | 1.5 nM HRP標準 | Fmol HRP/50 μL |
| ブランク | 1000 μL | 0 μL | 0 |
| 1 | 993.75 μL | 6.25 μL | 0.09375 |
| 2 | 987.5 μL | 12.5 μL | 0.1875 |
| 3 | 975μL | 25 μL | 0.375 |
| 4 | 950μL | 50 μL | 0.75 |
| 5 | 900 μL | 100μL | 1.5 |
| 6 | 850 μL | 150 μL | 2.25 |
| 7 | 800μL | 200 μL | 3 |
| 8 | 700μL | 300 μL | 4.5 |
| 9 | 600 μL | 400μL | 6 |
| 10 | 400μL | 600 μL | 9 |
| 11 | 200 μL | 800μL | 12 |
表8:HRP実験当日のHRP標準準備。
| QuantaBluの動作ソリューション | |
| 最終体積 = 12 mL | |
| QuantaBlu基板ソリューション | 10.8 mL |
| QuantaBlu安定過酸化物溶液 | 1.2 mL |
表9:HRP実験当日のQuantaBlu作業溶液の調製。
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結果
標準曲線と井戸濃度の定量化
板の各井戸からブランクの平均値を差し引いた。吸光度はY軸、濃度はX軸に、GraphPad Prismの「標準曲線補間」関数を使って標準曲線が作成されました。すべての標準点が揃っていれば、「線」モデルが最も良い結果をもたらします。あるいは、「シグモイド、4 PL、Xは集中」モデルは非線形標準曲線補間において非常に柔軟性と正確性を提供します(図6)。Y軸のサンプルの吸収度値は標準値の下に貼り付けられ、結果タブ(図6)の「補間されたX平均値」から濃度を復元しました。
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ディスカッション
経口ガベージは、個体個体に正確かつ定義されたルミナル用量を繰り返し投与することを可能にします。対照的に、任意給餌は有効な代替手段であるものの、より少ない化合物量を投与し、投与精度を低下させるために動物ごとの投与時間を長く必要とします。さらに、経口ガベージは注射経路よりも大きな容量を受け入れ、低濃度でより多くの総用量を扱いやすく、投与時の潜在的な毒性を最小限に抑えます。消化管を通過することで化合物の分布量がさらに制限され、腸の透過性やバリア機能を標的とした研究に有利です。しかし、毒性は発生ウィンドウや分子クラスによって大きく異なります。したがって、新生児に対して初めて治療を行う際は注意が必要です。新生児の子犬のガヴェージは繊細な処置であり、特にDOL 10未満の子犬には訓練が必要です。PBSに含まれる濃い食用色素のトレーニングが推奨され、ガベージが成功すると子犬の胃が目に見えて暗くなることが推奨されます。胃の外、特に喉や胸部周辺に色が現れるのは、ガベージ失敗の...
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開示事項
著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。
謝辞
この研究は、ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX、Fondation de l'avenir(2025年、AP-RM-24-012)、およびANR助成金Diab1GUT(ANR-24-CE15-7152)からの資金援助を受けて行われました。この調査はINFIBREXコンソーシアムの枠組みの中で実施され、フランス政府が開始し、パリ市立大学が「卓越主義」IdExプログラム(ANR-18-IDEX-0001)のもとで実施した「France 2030」投資計画の支援を受けました。炎症研究センターのウシング・チェンバー技術プラットフォームの貴重な支援に感謝申し上げます。また、アレクサンドラ・ウィレムツ氏とモード・ル・ガル氏の専門的な支援に特別な感謝申し上げます。また、炎症研究センターの動物施設プラットフォームの皆様にも心より感謝申し上げます。特にイザベル・ルノー氏とギヨーム・アンセルメ氏に特別な感謝を申し上げます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 10本のDPB(キャラ&カレッジなし)MG | ダルベッコス | 14200091 | |
| 抗HRP抗体 | ノルディック・バイオサイト | GTX10183 | モノクローナルマウスホースラディッシュペルオキシダーゼ IgG [2H11] |
| 双眼鏡ルーペ | オリンパス | SZ61 | 仕様書は不要です。 |
| 黒の96ウェルプレート平底 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 137101 | プレートは黒色で、蛍光測定に適応していなければなりません。読書中は蓋を外さなければなりません。 |
| BSA | メルク | A4503 | |
| C57BL/6Jマウス | チャールズ川 | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | メルク | 2382 | |
| クリア96ウェルクリアフラットボトムハイバイディング | コーニング | 9018 | |
| D-(+)-グルコース | メルク | G8270 | |
| 蒸留水2O | |||
| D-マンニトール | メルク | M4125 | |
| 細かい鉗子 | FST | 11445-12 | |
| ファインシザーズ | FST | 14058-09 | |
| FITC-デクストロン4Kd | FD4 | TdBラボ | 光劣化に敏感です。 |
| ヒートパッド | ミネルヴェ | 20 031 01 | |
| HRP | メルク | P8375 | |
| MgCl2、6H2O | メルク | M2670 | |
| Milli-Q H2O | |||
| P2300 イージーマウント 使用システム&議場 | 生理学的器具 | EM6-C-CE | システム、チャンバー、スライダーはすべて互換性が必要です。 |
| P2306 ユーシングチャンバースライダー | 生理学的器具 | PI-P2306 | スライダーのモデルは、サイズや組織の種類によって異なる種類があります。 |
| QuantaBlu フルオロゲンペルオキシダーゼ基質キット | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 15169 | |
| 再利用可能な丸い先端の給餌針 | FST | 18061-24 | 24ゲージ、先端径1.25mm、丸型先端。使用前に滅菌水、エタノール70%で洗い、高湯消毒が必要です。 |
| 重炭酸ナトリウム | メルク | S6297 | |
| 炭酸ナトリウム | メルク | S7795 | |
| 分光光度計 | TECAN | スパーク10M | 137101黒いプレートを使用する場合は、トップ取得付きのプレートリーダーが必要です。 |
| トゥイーン-20 | メルク | P7949 |
参考文献
- Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
- Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
- Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
- An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
- Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
- Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
- Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
- Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
- Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
- Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
- Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
- Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
- McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
- Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
- Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
- Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
- Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
- Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
- Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).
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