アグロバクテリウム媒介によるフィトフトラ・パルミヴラの簡易化方法

サマリー

私たちは、P. capsiciにも応用可能な、P. capsiciにも応用可能な、アグロバクテリウム媒介のフィトフトラ・パルミボラ形質転換のためのシンプルで効果的かつ再現性の高いプロトコルを提案します。

要約

フィトフトラは卵菌類の属で、多数の破壊的な植物病原体を含みます。その中には広範囲の宿主種であるP. palmivoraも含まれます。フィトフトラの機能ゲノミクスは、堅牢で実装しやすい形質転換法の利用が限られているため制約を受けてきました。利用可能なアプローチの中で、アグロバクテリウム媒介型転換(AMT)は、特殊な機器を最小限に必要とし、単一の遺伝子挿入で安定したトランスポルタントを生成することが多いため特に魅力的です。ほとんどのAMTプロトコルは、アグロバクテリウム誘導および共培養培地において最小培地(MM)塩を使用します。これらの媒体の調製は通常、複数のストック溶液を製造・混合し、中には異なる濃度の多数の成分を含むものもあります。このプロセスは時間がかかりエラーも多いため、変換の成功に一貫性がありません。ここでは、市販のMurashigeおよびSkoog(MS)基底培地を用いてアグロバクテリウム誘導および共培養培地を準備する、P. palmivoraの効率的でシンプルかつ再現性の高いAMTプロトコルを提示します。このプロトコルはP. capsiciの転換にも成功裏に適用されており、他のフィトフトラ属にも応用可能です。

概要

卵菌類の属であるフィトフトラは、世界で最も破壊的な植物病原体を多く含み、深刻な経済的損失を引き起こしています^1,2。その中でも、フィトフトラ・パルミヴォラは広範囲に宿主を覆う病原体で、カカオやパ^パイヤ3を含む多くの経済的に重要な作物に感染します。これは、数十億ドル規模の^{チョコレート産業の}主要成分を生産する熱帯多年生樹木カカオにおけるブラックポッド腐敗の最も広範な原因^です。この破壊的な病原体の分子病原性メカニズムを理解することは、新規で効果的な疾病制御戦略を設計する上で極めて重要であり、遺伝子変換はそのような研究を可能にするための不可欠なツールです。

フィトフトラ属の形質転換には、マイクロプロジェクタイル爆撃⁷、ポリエチレングリコールおよび二塩化カルシウム(PEG/CaCl₂)媒介のプロトプラスト形質転換8,9,10,11、ズースポア電気ポレーション12,13,14、アグロバクテリウム媒介形質転換(AMT)¹⁵など、いくつかの方法が開発^{されています。16}. これらの手法の中で、AMTは通常単一コピーの^{遺伝子統合を}生成^し、専門機器を必要とせずに比較的容易に実行できるという重要な利点があります。

AMTを用いたP. palmivoraの効率的な転換プロトコルは、^{すでに開発されています}。この方法により、複数の構成要素を用いてP. palmivoraの転換に成功^{しました。}この方法は、菌類および卵菌の形質変化に一般的に用いられる最小培地(MM)塩系アグロバクテリウム誘導および共培養培地を利用します。15,16,19。MMベースの変換プロトコルはトランスポンタント生成に効果的であることが示されましたが、複数のストック溶液を準備しそれらを組み合わせてメディアを作る作業は時間がかかり、誤りも起こりやすい作業となり得ます。

ここでは、市販のMurashige and Skoog(MS)基底培地を用いて、アグロバクテリウム誘導および共^培養培地のMM塩基培地を置き換えることで、P. palmivoraのAMTをより簡略化した方法を提示します。この方法は複数の化学原料溶液を準備する必要がなくなり、プロセスの時間が少なく、再現性も高くなります。さらに、この方法は前述の方法¹⁶よりも高い変換効率をもたらすと考えられ、P. capsiciにも適用可能です。

プロトコル

1. 変換に必要なストック溶液、培地、その他の材料の準備

1. 抗生物質のストック溶液
   1. カナマイシン(50 mg/mL)、G418(15 mg/mL)、セフォタキシム(100 mg/mL)のストック溶液を準備します。適切な量の抗生物質を水に溶かし、溶液をろ過滅菌し、1 mLのアリコットを準備して-20°Cで保存します。
   2. リファンピシンのストック溶液(15 mg/mL)を準備します:適切な量のリファンピシンをDMSOに溶かし、1 mLのアリコートを準備してホイルで包み、-20°Cで保存します。
      注意:DMSOで調製された化学溶液は、ナイロンやPTFE(テフロン)などのDMSO適合材料製のシリンジフィルターを使用して必ずフィルター滅菌してください。
2. アグロバクテリウム成長用培地
   1. ルリア・ベルターニ(LB)液体培地:250 mLの培地を準備するには、6.25 gの粉末を250 mLの水に加え、溶液をオートクレーブして室温(RT)で保存します。
   2. LB寒天培地:250mLの培地を準備するには、6.25gのLB粉末と3.75gの寒天を250mLの水に加え、溶液をオートクレーブしてRTで保存します。プレートを作る前に、溶かしたLB寒天に適切な抗生物質を加えます。プレートは抗生物質を添加して4°Cで保存してください。
3. P. palmivoraの成長と変質
   1. 10% V8寒天:500mLを準備するには、オリジナルの100%野菜ジュース50mLを450mLの水に加えます。次に、懸濁液に_CaCO3 を0.5g加え、よく混ぜるようにかき混ぜます。溶液をオートクレーブして皿に注ぎます。
      注意:必要に応じて適切な抗生物質を追加してください。プレートは抗生物質を添加して4°Cで保存してください。
   2. 半濃度のムラシゲ・スクーグ(1/2 MS)液体培地:ムラシゲとスクーグ基底培地(MS)を2.15gの水に950 mLの水に加え、pHを5.6に調整し、1 N KOHを加えて最大1リットルの水を加えます。直接使用して1/2 MSの寒天(ステップ1.3.3)を作り、残りの1/2 MS液体をオートクレーブしてRTで保存します。
   3. ア グロバクテリウム-ズースポア共培養寒天(AZCA)用1/2MS寒天:AZCAを600 mL調製するには、ステップ1.3.2の1/2 MS液体567 mLと9gの寒天を混ぜます。溶液をオートクレーブしてRTで保存してください。
   4. 50%グリセロール:50 mLのグリセロールを50 mLの水と混ぜ、溶液をオートクレーブしてRTで保存します。
   5. 1M MES(pH 5.6):200 mLを準備するには、39.048 g MES ハイドレートを160 mLの水に加え、その後NaOH溶液でpHを5.6に調整します。次に、最大200mLの水を加え、溶液をろ過して滅菌し、暗い環境でRTで保存します。
      注意:MESはpHが上がるにつれて徐々に溶解します。最初は10N NaOHを使ってpHを5.6に近づけ、粉末をほぼ溶かします。次に、1 N NaOHを加えてpHを正確に5.6にします。
   6. 20%グルコース:10gのグルコースを40mLの水に溶かし、最大50mLの水を加えてろ過滅菌し、RTで保存します。
   7. 200 mMアセトシリンゴン(AS):4'-ヒドロキシ-3,5'-ジメトキシアセトフェノン40 mgを1 mL DMSOに溶かし(注1.1.2参照)、溶液をホイルで覆います。変身の日に新鮮に仕上げましょう。
   8. アグロバクテリウム誘導培地(AIM):40 mLの培地を準備するには、50%グリセロール400 μL、20%グルコース400 μL、1 M MES(pH 5.6)1.6 mL、200 mM AS 40 μLから1/2 MS液体(pH 5.6)37.6 mL(ステップ1.3.2で調製)を加え、無菌50 mLチューブに加えます。溶液をよく混ぜ、チューブをホイルで覆い、数時間以内に新鮮に使いましょう。
   9. アグロバクテリウム-ズースポア共培養寒天(AZCA):600 mLの寒天を調製するには、50%グリセロール6 mL、20%グルコース3 mL、1 M MES(pH 5.6)24 mL、200 mM AS 600 μL を加え、567 mL 1/2 MS 寒天(pH 5.6)(ステップ1.3.3で調製)を溶解します。溶液を皿に注ぎ、光から守るために黒い布で覆います。
      注意:温度が55〜60°Cのときに、化学溶液を溶かした1/2 MS寒天(ステップ1.3.9)に加えます。 ASは光に敏感なので、ステップ1.3.7から1.3.9の間はボンネット内のライトを消してください。変身当日にこれら3つのステップを実行してください。
   10. プリチアガル:1リットルのアガーを950 mLの水に調製するには、0.5 g KH₂PO₄、0.25 g MgSO₄·7H₂O、1 g L-アスパラギン、5 gグルコース、0.5 g酵母抽出物、10 μLチアミン(100 mg/mL 水で4°Cで保存)、10 mg β-シトステロール(3 mLのエタノールに溶けてから加え)。溶液をかき混ぜてすべての材料を溶かし、次に水を加えて1リットルまで増やします。溶液を500mLに分け、それぞれ500mLに7.5g寒天を加えます。溶液をオートクレーブし、温度が55°Cまで下がったら適切な抗生物質を加え、皿に注ぎます。
   11. Hybond N+膜:保護シートを5cm×6cmの塊に切り、アルミホイルで包んでオートクレーブします。オートクレーブ膜をAZCA培地に置く際は、滅菌鉗子で扱い、保護シートは捨てます。

2. P. palmivoraの培養

1. 形質転換の7〜8日前に、P. palmivoraパパイヤを新たに作った10% V8寒天^{プレートに、}培植皿の中央に既に培養したフィトフトラ培養物(または株から)の寒天プラグを1つ置いて培養します。
   注:より高濃度の動物化胞子を得るには、新鮮に調製した未精製の10%V8寒天を使用することが重要です。
2. プレートを25°Cで12時間の光と12時間の暗いサイクルで7〜8日間培養し、変質が起きるまで続けます。

3. アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの製剤

1. 形換えの3日前に、ストリークA . tumefaciens がLB寒天プレート上でpCB301TOR-GFP¹⁶ を運ぶEHA105株を、リファンピシン(15 μg/mL)とカナマイシン(50 μg/mL)を補足しました。プレートを28°Cで2日間孵育します。
   注: アグロバクテリウムの初期調製(ステップ3.1)は、形質転換の1週間前に行え、2日間の潜伏後は4°Cで保存できます。
2. 形質転換前日に少量の アグロバクテリウム 細胞を取り、抗生物質を補足した新しいLB寒天プレートに、無菌1.5mLマイクロ遠心分離チューブの底部と平らな底部を用いて広げます(ステップ3.1で説明されています)。広げやすくするために、LB寒天プレートの中央に20μLの液体培地を加え、細菌細胞とLB培地を混ぜて均等に広げます。プレートを28°Cで約16〜18時間、一晩キュベートします。
3. 1 mLのピペットチップで一晩培養した細胞をすくい、上下にピペットして1 mLの アグロバクテリウム 誘導培地(AIM)に再懸浮させます。無菌の50mLチューブで、ホイルで覆われた無菌チューブで細胞をOD₆₀₀ = 0.4に希釈します。P . palmivora zoosporesとの共潜用として最低5mLを作ってください(ステップ5.1)。
   注:OD₆₀₀ は0.1から0.8の範囲であれば、変換に成功します。OD₆₀₀ = 0.4は、最小媒体(MM)塩系 アグロバクテリウム 誘導および共培養培地を用いた形質転換¹⁶において、最も効率的な変換効率を生み出したため、日常的に使用されます。
4. RTで暗い環境で1.5〜2時間、プラットフォームシェーカーで約70rpmの優しく攪拌しながら培養します。
   注意:ステップ3.3中はフードライトを消し、インキュベーション中は50mLチューブのキャップを緩めることが推奨されます(ステップ3.4)。

4. 遊走胞子の放出

1. ア グロバクテリウム・トゥメファシエン スの1時間の培養後(ステップ3.4)、7〜8日経過した P. palmivora プレートに4°Cで予冷した10mLの水を注ぎ、ピペットチップで優しく叩いて培地表面の気泡を除去し、4°Cで15分間培養し、その後光の下でRTで15分間培養します。
2. 放出された遊童胞子(約7〜8 mL)を、菌糸体や胞子嚢を乱さずにピペットで15mLの滅菌遠心分離管に優しく移します。
3. ズースポア濃度を測定するには、一部のズースポア懸濁液(例:20μL)を1.5mLのマイクロ遠心機チューブに移し、水で10倍(20μLの動物性ポザに対して180μL、_H2O)希釈します。チューブを1分間渦巻いて動物胞子を嚢胞状にし、数えやすくし、その後顕微鏡でヘマサイトメーターを使って動物胞子の数を数えます。カウント数に10倍をかけて、ステップ4.2で準備したズースポア懸濁液の濃度を算出します。
   注:動物化効率の計算にはズースポア濃度が測定されます。通常、1.5 × 10⁶ mLから5 ×^{10 6} zoospores/mLの濃度を用い、形質転換に成功しています。

5. アグロバクテリウムと遊行胞子の共存

1. 5 mLの アグロバクテリウム(ステップ3.4で調製)を、5 mLのズースポア懸濁液(ステップ4.2で準備)を加え、無菌の50 mLチューブにホイルで覆われます。チューブを優しく混ぜてRTで暗闇で2時間孵化します。蓋を緩めておき、共孵化中はチューブを揺らさないようにしてください。
2. 共潜伏期間(ステップ5.1)中にAZCAプレートを準備します(ステップ1.3.9)。培地が固まったら、各AZCAプレートに滅菌されたHybond N⁺ 膜(ステップ1.3.11で準備)を1枚置き、プレートは暗闇に保ちます。
3. アグロバクテリウムと動物性ポアの共培養を2時間行った後(ステップ5.1)、ピペットチップでAZCAプレートの上に置かれた各Hybond N⁺膜に300μLの混合物を塗布し(ステップ5.2)、マージンを液体から自由にします。
4. ペトリ皿を蓋を外したまま、混合物をフード内で約10分間自然乾燥させます。膜の溶液が流れなくなったらすぐにプレートを覆いましょう。
   注意:ステップ5.1から5.4の間は、ボンネットのライトを消しておいてください。必要に応じて、混合物を膜に塗り広げる際にライトを使いましょう(ステップ5.3)。
5. 自然乾燥後、プレートを25°Cの暗闇で2日間孵化させます。

6. G418耐性トランスポルタントの選択

1. 共培養48時間(ステップ5.5)後、滅菌鉗子を使ってHybond N⁺ 膜を逆さまに移植し、G418(30 μg/mL)およびセフォタキシム(100 μg/mL)を補足したPlich AGAR プレートに移します。プレートに膜を置く際は、培地表面に引きずらないように注意してください。
   注:各 P. palmivora 分離株のトランスポント選択におけるG418濃度は、分離株ごとに感度が異なるため、測定する必要があります。これを行うには、Plich 寒天プレートの中央に直径0.5cmの菌糸プラグを置き、ゼロから5 μg/mLの段階でG418濃度を補足します。各濃度ごとに3枚のレプリケートプレートを用意します。プレートは25°Cで7日間培養します。 フィトフトラ 分離株の成長を完全に抑制する最低G418濃度を特定し、それを変換体の選択に用いてください。
2. 1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブの平らな底面を使い、膜の表面を優しく押し、滑らせて培地に密接に接触させてください。プレートの裏側を観察し、膜と培地の間に気泡の有無を確認してください。同じマイクロ遠心分離機チューブの平らな底面で、もし気泡があれば優しく押し出します。
3. プレートを25°Cで12時間の光と12時間の暗いサイクルで2〜3日間孵育させます。
4. 3日間の培養後、無菌鉗子で膜を除去し、同じ条件下で引き続き培養を続けます。プレートに目に見えるコロニーが現れた場合は、2日後に膜を除去できます。
   注:変質体は通常、膜除去後1〜3日以内に現れますが、一部の菌株はその後に現れることがあります。より多くのトランスポルマントを得るために、膜除去後約1週間プレートを観察してください。
5. トランスフォーマントを、同じ濃度のG418または30%低減した10%のV8寒天プレートに移します。

結果

このプロトコルに従い、pCB301TOR-GFP¹⁶を運ぶA. tumefaciens EHA105を用いてP. palmivoraの形質転換に関する2つの独立した実験を実施しました。予想通り、遊童胞子とアグロバクテリウムの共潜伏により、30 μg/mLのG418を補足したプリッチ寒天プレート上でG418耐性コロニーが得られましたが、対照プレートではアグロバクテリウム感染なしのコロニーは認められませんでした(図1A)。これら2つの実験で生成された¹⁰⁷個の動物胞子あたりのG418耐性トランスポタントの数はそれぞれ55個と50個であった(表1参照)。これは以前のプロトコル¹⁶で得られた27個±5個のほぼ倍の数字である。

真のトランスポルマントは2つの方法で検証されました。第一に蛍光顕微鏡を用いたGFP蛍光の観察、第二に、プライマーペアEGFP-F2(5'- GACGTAAACGGCCACACACAGTTC-3')およびEGFP-R2(5'-GGGTGCTCAGGTAGTGTG-3')を用いてTaq 2Xマスターミックス(NEB)を用いた EGFP 遺伝子の550塩基のPCR増幅です。実験(実験)1では18個のG418耐性トランスポンタントのうち15個、実験2では21個中17個がGFP蛍光を示しました(表1、 図1B)。両実験で蛍光を示さなかった7つのG418耐性トランスポルタントのうち、3つはPCRにより真のトランスポルタントであることが確認されました(図1C)。総算で真の変容者率は90%と推定されています。

さらに、P . capsici の単離株PC2024-14szを、PCB301TOR-GFPを搭載した A. tumefaciens EHA105を用いて、プロトコルに従い、ズースポア懸濁液の準備にわずかな修正を加えました(7日生の P. capsici プレートを予冷水で浸水した後の4°Cでの潜伏期間を30分に延長しました)。単一の^実験で 10 7個あたりのG418(30 μg/mL)耐性トランスポレンタントの数は13個でした。蛍光顕微鏡で9種類のトランスポレントが観察され、すべて蛍光を発揮しました(補足ファイル1)。これにより、それらが真のトランスポマントであることが示唆されています。

図1:P. palmivoraの形質転換:A. tumefaciens EHA105を用いたpCB301TOR-GFPを搭載。(A) 30 μg/mL G418を補足したPlich agar上でのG418耐性P. palmivoraトランスポラントの出現。 (B) 代表的なトランスポンタントおよびP. palmivora野生型(WT)株における蛍光顕微鏡下でのGFP発現検出。画像は明視野(BF)およびGFP蛍光チャネルの両方で撮影されました。(C) GFP蛍光検出可能な4種のトランスポントと、GFPを検出しない7種のトランスポントからEGFPのPCR増幅。汎用プライマーペアITS4/ITS5²⁰を用いて、DNAの完全性を確認するために内部転写スペーサー(ITS)領域を増幅しました。GFP蛍光を持たないトランスポルタントは太字で下線付きテキストで強調表示されます。略称:M = NEB 100 bp DNAラダー;WT = 野生型P. palmivora P1分離株;N = H₂Oをテンプレートとした陰性対照PCR。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

実験	アグロバクテリウムのOD600	ズースポア濃度(/mL)	ズースポア体積(mL)	G418耐性トランスポンタントの数	検出可能なGFP信号を持つトランスポマントの数(検出/観測)	G418耐性トランスポンタントの数/107 遊走胞子
1	0.4	1.8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2.9 x 106	4.6	67	17/21	50

表1: PCB301TOR-GFPを運ぶA. tumefaciens EHA105 を用いた P. palmivoraのアグロバクテクテリア介在型形質転換の効率。

補足ファイル1:野生型(WT)P. capsiciおよびPCB301TOR-GFPを運ぶA. tumefaciens EHA105 を用いた代表的なトランスポジェントにおける蛍光顕微鏡下のGFP発現。画像は明視野(BF)およびGFP蛍光チャネルの両方で撮影されました。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、半強度のムラシゲおよびスクーグ基礎培地(1/2 MS)を用いて、アグロバクテリウム誘導や共培養培地で一般的に用いられる最小培地(MM)の成分を代替します。MM塩ベースの培地を調製するには、多数の個別の化学物質から複数のストック溶液を作り、それらを組み合わせ^{る必要があります。}1/2 MSには多くの化学成分も含まれています。しかし、MSはプレミックス粉末として広く市販されているため、培地の調製は粉末を水に溶かすことに簡素化されます。この改造により、メディアの準備時間が大幅に短縮され、人為的ミスの可能性も最小限に抑えられます。さらに、このプロトコルは変換効率を向上させ、先に述べたAMT法¹⁶と比較してより多くのトランスフォーマントを生成します。また、P. capsiciの形質転換にも効果的であり、他のフィトフトラ種にも応用可能である可能性が高いです。さらに広範な応用可能性を裏付けるとして、MSベースの培地は過去にAtVIP1(アラビドプシス・タリアナ・VirE2相互作用タンパク質1)およびP. infestansの動物性胞子を発現するAgrobacterium tumefaciens株の共培養に使用されており、P. infestans²¹の成功した形質転換を可能にしています。

このプロトコルは誤陽性率が低い可能性があることに注意が必要です。GFP蛍光観察またはPCRで試験された39のG418耐性トランスポランタントのうち、4つは蛍光もEGFPの増幅も示さなかった(表1、図1C)。アグロバクテリウム媒介の形換形中にT-DNAが部分的に統合されることは珍しくないため^(22,23)、P. palmivoraゲノムに統合されたのはプラスミドpCB301TOR-GFP¹⁶のNPTII遺伝子を含む部分のみである可能性があります。また、偽陽性は膜と選択培地の接触不足によりG418選択から逃げることが原因かもしれません。したがって、膜が培地と完全に接触していること(ステップ6.2)が不可欠です。

このプロトコルはさらに簡略化される可能性があります。例えば、 アグロバクテリウム 誘導培地(AIM)や アグロバクテリウム-ズースポア共培養寒天(AZCA)におけるMESは省略される可能性があります。MESは生化学や分子生物学の実験でpHを安定させる緩衝剤として一般的に使用されます。pH 5.6で1 M MESのストック溶液を調製するには十分な時間がかかり、コストも増加します。スイートバジル²⁴ やパパイヤ²⁵などの植物のAMTでは、MESを伴わない同様のMSベースの アゴバクテリウム 誘導および共培養培地が用いられており、MESが P. palmivora の形質転換に必須ではない可能性を示唆しています。MESの省略が変換効率を損なわないことを確認するためにはさらなる実験が必要です。

全体として、この簡略化されたプロトコルは、 P. palmivora、 P. capsici、そして潜在的に他の卵菌類のルーチン遺伝子操作のための実用的かつアクセスしやすいプラットフォームを提供します。この研究は、感染動態を追跡する病原体の蛍光標識、細胞内局在を調べるためのタンパク質のタグ付け、遺伝子発現やタンパク質コード配列の標的変化による機能解析など、翻訳の可能性を持つ幅広い基礎研究を支援しています。CRISPRベースのゲノム編集と組み合わせることで、このプロトコルは病原性メカニズムの解明とこれらの破壊的な病原体の主要な病原性因子の特定を加速することが期待されています。その結果得られた知見は、新たなメカニズムに基づく疾病管理戦略の開発を可能にします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL マイクロ遠心分離機チューブ	VWR	525-1126
4'-ヒドロキシ-3'、5'ジメトキシアセトフェノン	TCI	D2666	アセトシリンゴン(AS)
50 mLチューブ	グライナー・バイオワン	227261
絶対エタノール	フィッシャー・バイオリエージェント	BP28184
寒天	フィッシャー・バイオリエージェント	BP1423-500
アルミニウム箔
ハイボンド-N+膜(30 cm & 時間:3 m)	シチバ	RPN303B
炭酸カルシウム	シグマ・オルドリッチ	239216-500G	CaCO3
セフタキシムナトリウム塩	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	AAJ6269006
D-(+)-グルコース	シグマ・オルドリッチ	G8270-1KG
DNeasy PowerLyzer 微生物キット	キアゲン	12255-50
鉗子
蛍光顕微鏡	ツァイス		ZEISS アクシオスコープ5蛍光顕微鏡(フィルターセット38 HE)
G418硫酸塩	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	AC329400010
グリセロール	シグマ・オルドリッチ	911046-1L
血球計(ブライトライン)	ハウサー・サイエンティフィック
カナマイシン硫酸塩	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC-257635
L-アスパラギン無水	MPバイオメディカル	ICN10079425
LBブロス、ミラー	フィッシャー・バイオリエージェント	BP1426-2
硫酸マグネシウム・ヘプタハイドレート	シグマ・オルドリッチ	63138-250G	MgSO4·7H2O
MESハイドレート	シグマ・オルドリッチ	M2933-100G
ムラシゲとスクーグ基底培地	シグマ・オルドリッチ	M5519-50L
ペトリ皿(100 mm x 15 mm)	VWR	25384-342
リン酸二水素カリウム	シグマ・オルドリッチ	1370391000	KH2PO4
リファンピシン	サンタクルーズ・バイオテクノロジー	SC-200910
Taq 2Xマスターミックス	NEB	M0270L
チアミン塩酸塩	シグマ・オルドリッチ	T4625-5G
紫外線可視光分光光度計	フィッシャー・サイエンティフィック	14-385-355
V8オリジナル 100%野菜ジュース	キャンベルスープ社
ボルテクサー	フィッシャー・サイエンティフィック	14-955-163
水			分子生物学グレード、Mill-Q水浄化システムによる精製
酵母エキス	アクロス	611805000	現在はThermo Scientific Chemicalsで入手可能です
β;-シトステロール	シグマ・オルドリッチ	85451-100G