本プロトコルは、人間の肥満を模倣する細胞モデルの開発を目指しています。これを実現するために、ヒト脂肪由来の幹細胞は脂肪細胞に分化され、その後選択された脂肪酸の混合物で肥大化されます。
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この記事について
サマリー
要約
肥満に関連する脂肪組織の変化は局所的な分泌プロファイルを変化させ、がん細胞を含む周囲の他の細胞との相互作用に影響を与えます。栄養素の継続的な供給は脂肪細胞の代謝を変え、脂質の貯蔵庫として機能させます。通常、肥満メカニズムの研究は動物モデルに依存していますが、細胞レベルでの代謝過程の解析は可能ではありません。したがって、肥満脂肪細胞の機能変化を、瘦削型と比較して探るのに役立つ信頼性の高い in vitro 肥満モデルの開発が必要です。本研究は、インスリン、イソブチル-1-メチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシンの混合物を用いて、ヒト脂肪細胞とその前駆体(脂肪由来幹細胞)からの分離プロトコルを提示します。その後、分化した脂肪細胞に亜鉛酸、パルミ酸酸、オレ酸などの脂肪酸を併用して脂質蓄積を促進しました。その結果、肥満条件下での肥大細胞を模倣する貴重なモデルが確立され、今後の研究に活用される可能性があります。
概要
肥満は筋骨格系疾患、心血管疾患、インスリン抵抗性、代謝症候群、糖尿病、特定のがんなど、幅広い疾患の主要なリスク要因と考えられています1。肥満は最も目立ち、過小評価されている公衆衛生問題の一つであり、原因は多要素的です。簡単に言えば、肥満は摂取カロリーと消費カロリーのバランスが崩れ、脂肪蓄積の増加によって引き起こされます。過剰なカロリーは、体のエネルギー恒常性を制御する重要な要素である脂肪組織(AT)の病理的な膨張と機能障害を引き起こします。
脂肪細胞はAT3の主要な細胞構成要素です。肥満条件下でのAT増殖の主な要因は細胞肥大、すなわち脂質滴(LD)の形で細胞質に蓄積される脂肪の増加により脂肪細胞の体積が増加することです4。肥満が複雑な病理的障害であっても、脂肪細胞の生物学的機能に関する研究は、その原因を分析し新たな治療戦略を模索するモデルとなり得ます。これは、肥満関連疾患を標的とした新たな治療戦略を開発するために、脂肪細胞機能の変化を引き起こす分子メカニズムのより深い理解の必要性を浮き彫りにしています。
動物モデルは生理学的状態を最も反映しており、肥満の生体....
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プロトコル
無菌技術を用いて、層流細胞培養フード内でプロトコルのすべての工程を行います。すべての試薬および装置の詳細については「材料表」を参照してください。以下に述べる分化プロトコルはヒト脂肪由来幹細胞に適しており、他の細胞タイプや起源によって異なる場合があります。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 微分のためのADSCの調製
- ADSCs成長培地(ADSCs GM)を準備する:1 g/Lのグルコースを含むDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%胎児用牛血清(FBS)、2 mMグルタミン、および抗生物質(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)を補完します。
- ADSCのGM、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリプシン/EDTA溶液を37°Cに温めます。
注意:ADSCは商業的な情報源から入手可能です。初期の通路でセルを使いましょう。複数回通はADSCsの分化電位を低下させます。 - 細胞培養専用のT75フラスコでADSCを培養するADSCから無菌的にGMを除去します。
- 残留ADSCを洗い流すために、....
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結果
ここで述べる方法は、ヒトADSCを成熟脂肪細胞に分化させ、その後脂質蓄積を促進し、肥満条件下で観察される肥大細胞を模倣することを可能にします。ヒトADSCの分化の時間経過は 図1に示されています。細胞が100%の合流に達する日目(図1A)に、ADSCは細長い紡錘状の形態を示します。この時点で、DMを含む脂肪生成誘導剤を用いて分化プロトコルを適用できます。24時間後、細胞は形態学的変化を遂げ、小さなLDを持つ単細胞が確認されます(図1B)。7日目には、DMを新しいものに置き換えるべき時には、複数の小さなLDを持つ細胞が観察されます(図1C)。細胞分化14日目に、細胞分化の14日目に複数のLDが蓄積された脂肪細胞が確認できます(図1D)。
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ディスカッション
本プロトコルは、ADSCの分化を再現可能な2段階手順として行い、その後FAsを用いたインキュベーションで肥満を模倣した細胞モデルを実現します。その効果を決定する重要なステップは、分離後のADSC通過回数です。複数回の通過により、これらの細胞の分化電位は低下します10。
脂肪細胞の分化過程では、ADSCは分裂細胞から成長停止細胞へと移動します。前脂肪細胞の成長停止は分化誘導の前提ステップです。100%コンフルエンスでの接触阻害によって達成可能な成長停止細胞でのみ、ホルモン療法(インスリン、インドメタシン、デキサメタゾン、IBMX)が脂肪細胞の分化を誘導します。IBMXはデキサメタゾンと併用することで、脂肪形成の重要な調節因子であるPPARγ(ペルオキシソーム増殖活性受容体ガンマ)の発現を刺激します。IBMXは競合性のある非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤であり、細胞内のcAM.......
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開示事項
著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係は既知のものではないと述べています。
謝辞
この記事はポーランド国立科学センターの資金提供を受け、ドロタ・ノヴァク(OPUS 22, No. 2021/43/B/NZ3/01458)およびアレクサンドラ・シミチイェフ(SONATA, 2020/39/D/NZ5/02330)が助成金を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX) | メルク | I5879 | ||
| 0.25%トリプシン/0.05%EDTA、pH 7.2 | IITD PAN、Wroc 96ウェルプレート | 熱力学 | 130188 | |
| 抗生物質-抗菌液 | シグマ・オルドリッチ | A5955 | ||
| 牛血清アルブミン(BSA) | シグマ・オルドリッチ | A3294 | ||
| セルカウンター | 該当なし | 該当なし | ||
| 遠心分離機 | 該当なし | 該当なし | ||
| デキサメタゾン | シグマ・オルドリッチ | D4902 | ||
| ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム(DMEM) | IITD PAN、Wrocダルベッコ改良鷲の培地:栄養混合物F12 | ギブコ | 11320-033 | |
| エタノール | チェンプール | 113964200#1L | ||
| 胎児用牛血清(FBS) | ギブコ | A5256701 | ||
| hADSC ヒト脂肪由来幹細胞 | ロンザ | PT-5006 | ||
| インキュベーター | 該当なし | 該当なし | ||
| インドメタシン | シグマ・オルドリッチ | I8280-5G | ||
| インスリン | シグマ・オルドリッチ | I9278 | ||
| 逆立顕微鏡 | 該当なし | 該当なし | ||
| L-グルタミン | シグマ・オルドリッチ | 25030-024 | ||
| リノール酸ナトリウム塩 | シグマ・オルドリッチ | L8134 | ||
| LipidSpot蛍光 | バイオティウム | 70065 | ||
| リン酸緩衝生理食塩水(PBS) | 熱力学 | 10010023 | ||
| ソドゥイム・オレアット | シグマ・オルドリッチ | O7501 | ||
| ソドゥイム・パルミテート | シグマ・オルドリッチ | P9767 | ||
| T75細胞培養フラスコ | 熱力学 | 130190 | ||
| トリパンブルー | シグマ・オルドリッチ | 95896HJ |
参考文献
- Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
- Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7
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