ヒト脂肪細胞における脂質滴の蓄積の分化と誘導を、in vitroで肥満を研究するためのモデルとして

サマリー

本プロトコルは、人間の肥満を模倣する細胞モデルの開発を目指しています。これを実現するために、ヒト脂肪由来の幹細胞は脂肪細胞に分化され、その後選択された脂肪酸の混合物で肥大化されます。

要約

肥満に関連する脂肪組織の変化は局所的な分泌プロファイルを変化させ、がん細胞を含む周囲の他の細胞との相互作用に影響を与えます。栄養素の継続的な供給は脂肪細胞の代謝を変え、脂質の貯蔵庫として機能させます。通常、肥満メカニズムの研究は動物モデルに依存していますが、細胞レベルでの代謝過程の解析は可能ではありません。したがって、肥満脂肪細胞の機能変化を、瘦削型と比較して探るのに役立つ信頼性の高い in vitro 肥満モデルの開発が必要です。本研究は、インスリン、イソブチル-1-メチルキサンチン、デキサメタゾン、インドメタシンの混合物を用いて、ヒト脂肪細胞とその前駆体(脂肪由来幹細胞)からの分離プロトコルを提示します。その後、分化した脂肪細胞に亜鉛酸、パルミ酸酸、オレ酸などの脂肪酸を併用して脂質蓄積を促進しました。その結果、肥満条件下での肥大細胞を模倣する貴重なモデルが確立され、今後の研究に活用される可能性があります。

概要

肥満は筋骨格系疾患、心血管疾患、インスリン抵抗性、代謝症候群、糖尿病、特定のがんなど、幅広い疾患の主要なリスク要因と考えられています^1。肥満は最も目立ち、過小評価されている公衆衛生問題の一つであり、原因は多要素的です。簡単に言えば、肥満は摂取カロリーと消費カロリーのバランスが崩れ、脂肪蓄積の増加によって引き起こされます^。過剰なカロリーは、体のエネルギー恒常性を制御する重要な要素である脂肪組織(AT)の病理的な膨張と機能障害を引き起こします。

脂肪細胞は^AT3の主要な細胞構成要素です。肥満条件下でのAT増殖の主な要因は細胞肥大、すなわち脂質滴(LD)の形で細胞質に蓄積される脂肪の増加により脂肪細胞の体積が増加^{することです4。}肥満が複雑な病理的障害であっても、脂肪細胞の生物学的機能に関する研究は、その原因を分析し新たな治療戦略を模索するモデルとなり得ます。これは、肥満関連疾患を標的とした新たな治療戦略を開発するために、脂肪細胞機能の変化を引き起こす分子メカニズムのより深い理解の必要性を浮き彫りにしています。

動物モデルは生理学的状態を最も反映しており、肥満の生体内研究に広く用いられています。しかし、このような多層システムでは細胞レベルで基本的な生物学的プロセスの結論を導き出すのは非常に困難であり、このためin vitroの脂肪細胞モデルの利用が有利です。in vitro研究は主にマウスの3T3-L1細胞モデルに基づいており、適切な条件下で脂肪細胞様表現型⁶を獲得します。しかしながら、その起源のため、このモデルはヒト細胞との共培養条件のようなより複雑な解析には用いられず、結果が必ずしもヒトの脂肪細胞に直接翻訳できるわけではありません。これらすべての理由から、ヒトの肥満を模倣するモデルが探索されており、ヒト脂肪由来幹細胞(ADSC)とその後の分化を組み合わせて利用することは合理的と考えられます。このモデルは、その複雑さが低いため、ヒト脂肪細胞肥大をin vitroで研究するのに最も適しています。これは、脂肪組織内に複数の細胞タイプが存在するため、生体内では達成不可能な単一の細胞培養タイプのパラメータを異なる条件下で比較することを可能にします。

この^組織の機能障害を研究する最も一般的な例は、ATから分離されたヒト前脂肪細胞および脂肪由来幹細胞です。これらの細胞は分化後、脂肪細胞のLDレベルを肥大化することで調節する魅力的なモデルとなります。それにもかかわらず、ヒ^ト細胞の肥大を調査した研究は比較的少なく、多くはLD蓄積を誘導するために脂肪酸(FA)を一種類のみ使用しています。

このプロトコルは、ヒト脂肪細胞にファルミッテ酸塩、オレ酸塩、亜硝酸塩の混合物を補給し、肥満環境を模倣することを提案します。これにより、脂質を過剰に含んだヒト脂肪細胞に基づくツールの実現が可能となり、対照(ナイーブ)脂肪細胞と直接比較できます。このモデルは、正常および肥大性脂肪細胞の表現型および機能的変化の研究や、必要に応じて共培養条件を用いた実験に用いられます。

プロトコル

無菌技術を用いて、層流細胞培養フード内でプロトコルのすべての工程を行います。すべての試薬および装置の詳細については「材料表」を参照してください。以下に述べる分化プロトコルはヒト脂肪由来幹細胞に適しており、他の細胞タイプや起源によって異なる場合があります。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 微分のためのADSCの調製

1. ADSCs成長培地(ADSCs GM)を準備する:1 g/Lのグルコースを含むDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%胎児用牛血清(FBS)、2 mMグルタミン、および抗生物質(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)を補完します。
2. ADSCのGM、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、トリプシン/EDTA溶液を37°Cに温めます。
   注意:ADSCは商業的な情報源から入手可能です。初期の通路でセルを使いましょう。複数回通はADSCsの分化電位を低下^{させます。}
3. 細胞培養専用のT75フラスコでADSCを培養するADSCから無菌的にGMを除去します。
4. 残留ADSCを洗い流すために、細胞培養皿を5mLのPBSで洗い流します。
5. フラスコからPBSの全量を取り除きます。
6. トリプシン/EDTAを2mL加え、37°Cで細胞が剥離されるまで培養します。この過程は逆立顕微鏡で監視してください。
   注意:培養皿をタップすると細胞剥離が早まります。
7. トリプシン活性を6mLの新鮮ADSCs GM添加で阻害します。
8. 培養皿から細胞懸濁液の全体を遠心分離に適したチューブに移します。
9. セルを室温(RT)で300 x g で5分間遠心分離します。
10. 上清液を取り除きます。
11. 新たに追加されたADSCs GMを2mLに細胞を懸濁させます。
12. ヘモサイトメーターや自動細胞計で細胞密度と生存率を計算します。
    注:細胞の生存率はトリパンブルー染料染色法で評価できます。
13. 細胞を所定数のウェルに種付けします。100μLのADSC成長培地に15,000セル/ウェル、96ウェルのプラスチックプレートを設置します。
    注意:種子細胞は常に二重にして、脂肪酸の条件下で制御および培養を目的とした脂肪細胞を取得してください。実験の種類によって、ADSCは異なる種類のプラスチック製プレートや皿にシードされることがあります。推奨される種まき密度は30,000〜60,000個/^cm²です。その後の解析や下流実験に必要な細胞数に応じて、6ウェルまたは12ウェルプレート用に培養皿のフォーマットを調整してください。
14. 細胞は5%の_CO2を含む加湿大気で37°Cで培養します。
15. 細胞が100%の合流に達したら(通常はプレートから24〜48時間)、以下の指示に従って脂肪細胞への分化を誘導します。
    注意:分化誘導前に高い細胞結合レベルに達することが重要です。他の場合には微分の効率に影響を与えることもあります。プレート細胞で高いコンフルエンスに達するまでに48時間以上かかる場合は、新鮮なADSCの培養培地を3〜4日ごとに交換してください。

2. 脂肪生成分化の誘導

1. 分化培地(DM)を準備する:DMEM/F12培地に10%FBS、2 mMグルタミン、抗生物質-抗菌剤溶液(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)、インスリン5 μg/mL、0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、5 μM デキサメタゾン、200 μM インドメタシンを補足します。
   注意:DMは直接使用に必要な量だけ準備してください。長時間保存せず、必ず淹れたてのDMを使ってください。使用前にDMを水浴で37°Cまで温めてください。IBMXやインドメタシンは、37°Cより低い温度で培地に加えると沈殿する可能性があります。 溶解させるには、水浴で37°Cまで温めます。
2. 無菌的に、合流したADSCから培地全体の体積を取り除き捨てます。
   注意:DMを追加する前にADSCの培地を完全に除去してください。
3. 96ウェルプレートで増殖する細胞に100μL/ウェルのDMを慎重に加えます。
   注意:培地を変える際に細胞が乾燥しないよう注意してください。
4. 細胞を37°C、_CO25 %の温度で7日間インキュベーターで培養します。
5. ADSCからDMのボリューム全体を削除・破棄してください。
6. 96ウェルプレートで増殖中の細胞に、新鮮なDMを1ウェルあたり100μL慎重に加えます。
7. 細胞はインキュベーター内で37°C、_CO25 %で7日間培養します。
   注:脂肪形成分化の進行は、誘導細胞内に出現する脂質液胞の明視野観測によって検出できます。

3. 脂肪細胞の肥満

1. 脂肪酸を補足した脂肪細胞培養培地を準備します:DMEM/F12培地に10%FBS、2 mMグルタミン、抗生物質-抗菌剤溶液(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)、0.33 mMリノル酸塩、0.17 mMパルミ酸塩、0.17 mMオレ酸塩を補足します。
2. 対照アディポサイト培養培地を準備します:DMEM/F12培地に10% FBS、2 mMグルタミン、抗生物質 - 抗菌溶液(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)、0.44%牛血清アルブミン(BSA)、0.26%エタノール(後者2つはFA溶媒としても使用)を補足します。
   注意:コントロールを準備し、直接使用可能な量のFAs脂肪細胞培養培地のみを補足してください。長時間保存せず、常に新鮮に作られた培地を使用してください。使用前に、培地を水浴で37°Cまで温めてください。
3. 合計14日間の分化後、96ウェルプレート上で分化した脂肪細胞からDM培地の全体積を慎重に取り除き、廃棄します。
4. 96ウェルプレートで細胞を増殖させたウェルの半分に、FAを補足した脂肪細胞培養培地100μLを慎重に加えます。
5. 96ウェルプレートで細胞を増殖させたウェルの後半に、1ウェルあたり100μLの対照脂肪細胞培養培地を慎重に加えます。
   注意:培地を変える際に細胞が乾燥しないよう注意してください。
6. 細胞を37°Cの加湿大気で、_CO25 %を含む48時間にわたり培養します。
7. 48時間後は、対照細胞およびFAと培養された細胞を次の実験に使用します。
   注:この段階で、肥満化された脂肪細胞は細胞染色、細胞代謝解析、他の細胞との共培養など、複数の実験目的に使用できます。

4. 脂質滴の染み

1. 脂肪細胞培養培地を準備する:DMEM/F12培地に10%FBS、2 mMグルタミン、抗生物質(ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100 μg/mL、アンホテリシンB0.25 μg/mL)を補足します。
2. 蛍光染料を希釈して、脂肪細胞培養培地中のLDを1:1000の希釈で染色します。
3. 96ウェルプレートで増殖する細胞からFAを補足した対照脂肪細胞培養培地の全体積を除去・廃棄します。
4. 蛍光染料を含む脂肪細胞培養培地を1ウェルあたり50μL慎重に加えます。
   注意:培地を変える際に細胞が乾燥しないよう注意してください。
5. 細胞を37°Cの加湿大気で5%_CO2 を含む環境で15分間培養します。
6. 蛍光染料は100μL/ウェルの脂肪細胞培養培地に置き換えて洗い流します。
7. 蛍光顕微鏡による緑色蛍光検出チャネル(例:427 nm/Em 585 nm)での画像取得。
   注意:これは生細胞染色のプロトコルです。染色は細胞のホルムアルデヒド固定後に行うこともできます。

結果

ここで述べる方法は、ヒトADSCを成熟脂肪細胞に分化させ、その後脂質蓄積を促進し、肥満条件下で観察される肥大細胞を模倣することを可能にします。ヒトADSCの分化の時間経過は 図1に示されています。細胞が100%の合流に達する日目(図1A)に、ADSCは細長い紡錘状の形態を示します。この時点で、DMを含む脂肪生成誘導剤を用いて分化プロトコルを適用できます。24時間後、細胞は形態学的変化を遂げ、小さなLDを持つ単細胞が確認されます(図1B)。7日目には、DMを新しいものに置き換えるべき時には、複数の小さなLDを持つ細胞が観察されます(図1C)。細胞分化14日目に、細胞分化の14日目に複数のLDが蓄積された脂肪細胞が確認できます(図1D)。

ディスカッション

本プロトコルは、ADSCの分化を再現可能な2段階手順として行い、その後FAsを用いたインキュベーションで肥満を模倣した細胞モデルを実現します。その効果を決定する重要なステップは、分離後のADSC通過回数です。複数回の通過により、これらの細胞の分化電位は低下します¹⁰。

脂肪細胞の分化過程では、ADSCは分裂細胞から成長停止細胞へと移動します。前脂肪細胞の成長停止は分化誘導の前提ステップ^です。100%コンフルエンスでの接触阻害によって達成可能な成長停止細胞でのみ、ホルモン療法(インスリン、インドメタシン、デキサメタゾン、IBMX)が脂肪細胞の分化を誘導します。IBMXはデキサメタゾンと併用することで、脂肪形成の重要な調節因子であるPPARγ(ペルオキシソーム増殖活性受容体ガンマ)の発現を刺激^します。IBMXは競合性のある非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤であり、細胞内のcAM...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)	メルク	I5879
0.25%トリプシン/0.05%EDTA、pH 7.2	IITD PAN、Wroc96ウェルプレート	熱力学	130188
抗生物質-抗菌液	シグマ・オルドリッチ	A5955
牛血清アルブミン(BSA)	シグマ・オルドリッチ	A3294
セルカウンター	該当なし	該当なし
遠心分離機	該当なし	該当なし
デキサメタゾン	シグマ・オルドリッチ	D4902
ダルベッコ改良型イーグル・ミディアム(DMEM)	IITD PAN、Wrocダルベッコ改良鷲の培地:栄養混合物F12	ギブコ	11320-033
エタノール	チェンプール	113964200#1L
胎児用牛血清(FBS)	ギブコ	A5256701
hADSC ヒト脂肪由来幹細胞	ロンザ	PT-5006
インキュベーター	該当なし	該当なし
インドメタシン	シグマ・オルドリッチ	I8280-5G
インスリン	シグマ・オルドリッチ	I9278
逆立顕微鏡	該当なし	該当なし
L-グルタミン	シグマ・オルドリッチ	25030-024
リノール酸ナトリウム塩	シグマ・オルドリッチ	L8134
LipidSpot蛍光	バイオティウム	70065
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	熱力学	10010023
ソドゥイム・オレアット	シグマ・オルドリッチ	O7501
ソドゥイム・パルミテート	シグマ・オルドリッチ	P9767
T75細胞培養フラスコ	熱力学	130190
トリパンブルー	シグマ・オルドリッチ	95896HJ