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研究記事

環状RNA ZBTB46 は、リポ多糖損傷を受けたヒト内皮細胞におけるアポトーシスおよび酸化ストレスをERBB2-AKTシグナル伝達を調節することで減幅します

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DOI:

10.3791/69765

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2026年2月13日

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

この記事について

サマリー

敗血症関連急性腎損傷(SA-AKI)はかなりの死亡率と関連しています。本研究では、LPS誘導HUVECs(SA-AKIin vitro)においてcircZBTB46がダウンレギュレーションされていることが明らかになりました。その過剰発現はHUVECの生存率を高め、ERBB2/AKTシグナル伝達と関連したアポトーシス、炎症、酸化ストレスを減少させ、SA-AKIに関連する潜在的な治療標的を示唆しています。

要約

循環RNAはストレス応答の新たな調節因子として登場していますが、敗血症に関連する急性腎障害を引き起こす内皮損傷におけるその役割は完全には定義されていません。私たちは、環状RNA のZBTB46 (circZBTB46)がERBB2-AKTシグナルを作用させることで内皮保護をもたらすと仮説を立てました。ヒト臍帯静脈内皮細胞をリポ多糖で挑戦する細胞ベースモデルを用いて、 circZBTB46 の発現を定量化し、その強制発現が生存、アポトーシス、炎症メディエーター、酸化還元恒常性に与える影響を検証しました。細胞生存率アッセイとフローサイトメトリーで生存率とアポトーシスが評価されました。酵素結合免疫吸着アッセイではインターロイキン-6、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1βが測定され、活性酸素種、マロンジアルデヒド、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼは酸化損傷および抗酸化能力の指標として評価されました。メカニズムを定義するために、遺伝子セットリッチメント解析を用いたトランスクリプトームプロファイリングを行い、ウェスタンブロッティングによる経路タンパク質の確認を行い、ERBB2阻害剤AG-825を用いた必要性を評価しました。リポ多糖が抑制された circZBTB46。 CircZBTB46 の過剰発現は生存率を高め、アポトーシスを低下させ、炎症促進サイトカインおよび活性酸素種を減少させ、マロンジアルデヒドを減少させ、超酸化物ジムターゼおよびカタラーゼ活性を高めました。トランスクリプトミクスおよびタンパク質解析はERBB2-AKT軸の活性化を支持し、薬理学的ERBB2阻害は細胞保護を鈍らせ、酸化還元バランスの改善を逆転させました。これらの発見は 、circZBTB46 がERBB2-AKTシグナル伝達を通じてリポ多糖誘発性内皮損傷を抑制する内因性障害であることを特定し、 circZBTB46 を敗血症関連急性腎障害の機構的結節および治療対象として指名していることを示しています。

概要

敗血症は病原性侵襲によって引き起こされる生命を脅かす全身性炎症カスケードであり、多くの場合多臓器不全に至ります。この重要な文脈の中で、SA-AKIは集中治療室における主要かつ臨床的に重要な合併症として浮上します。全身感染と同時に腎のろ過能力が急激に低下することが特徴であり、臨床コホート2では非敗血性AKIの死亡率を38%〜42%上回る。敗血症または敗血症性ショックと診断された人の約60%がSA-AKI3を発症すると予想されます。したがって、SA-AKIは集中治療において大きな課題となり、罹患率や死亡率に大きく寄与しています4.現在、SA-AKIのメカニズムは完全には解明されていません。前臨床研究では微小循環機能障害、細胞代謝の変化、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)の不均衡、ミトコンドリア機能障害、炎症調節障害が関与していますが、SA-AKIの病態生理学的メカニズムは依然として不明瞭であり、早期診断と継続的な管理を支援する最適な対策が現時点で不足しています5,6,7,8 .SA-AKIはアポトーシスの強化、過剰な酸化ストレス、炎症9。この研究枠組みの中で、リポ多糖(LPS)はin vitroシステムで用いられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)における敗血症関連AKIの症状を模倣し、予備的標的探査に用いられた。

近年、環状RNA(circRNA)は、最近特定された非コードRNA分子のカテゴリーであり、さまざまな疾患における役割について注目を集めています。CircRNAは安定した円状構造を持ち、細胞の生理学的および病理学的プロセスに関与し、マイクロRNA(miRNA)の分子スポンジとして機能したり、遺伝子転写を調節したり、タンパク質相互作用に関与したりします11。研究により、circRNAは炎症、酸化ストレス、アポトーシス経路の調節に重要であり、その結果、敗血症や急性腎障害を含む関連疾患への潜在的な影響に関する研究の焦点が高まっています。例えば、hsa_circ_0072463はSA-AKI13の有望な診断マーカーおよび治療標的として特定されています。Circ_001653 BUD13のリクルートを通じてSA-AKIを緩和すると報告されています。しかし、SA-AKIにおけるcircRNAの機能的意義は、依然としてほとんど解明されていません。

本研究は、in vitroのSA-AKIシステムを用いてcircZBTB46が内皮細胞機能、酸化ストレス、炎症反応に与える影響を調べることを目的としています。LPS誘導HUVECモデルを構築し、エンドトキシン刺激下での内皮損傷を調査しました。LPS挑戦型HUVECは、敗血症関連急性腎損傷の多因子病態生理に関連するが、同等ではない還元主義的な内皮毒性/TLR4駆動のストレスモデルであることに注意すべきである。このモデルは主にTLR4介護による炎症活性化、酸化ストレス、アポトーシス関連の内皮反応を捉え、血行動態の変化、補体および凝固カスケード、損傷関連分子パターン、異質な微生物刺激などの主要なin vivo要素は省略しています。この実験枠組みの中で、circZBTB46がERBB2シグナル伝達経路を調節することでLPS誘発性の酸化ストレスやアポトーシスを緩和し、内皮細胞の機能を保護するかどうかを調査しました。私たちの知る限り、本研究は敗血症関連急性腎障害の文脈におけるcircZBTB46と内皮ストレス応答の関連を示す初の証拠を提供しています。circZBTB46媒介による内皮保護の分子メカニズムを解明することで、本研究はSA-AKIの病原性メカニズムの理解を深め、circRNAを中心とした革新的な治療アプローチへの道を開く可能性があります。

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プロトコル

本プロトコルは、 circZBTB46 調節がHUVECにおける炎症シグナル伝達、酸化ストレス、ERBB2-AKT経路活性化に与える影響を調査するための実験的手法を説明しています。

細胞培養
本研究で使用されたHUVECsセルは市販の供給源から入手されました。HUVECは、その広範な入手可能性、再現性のある培養条件、高いトランスフェクション効率から、炎症ストレス下での内皮シグナル伝達経路の遺伝子操作や機構的調査を容易にするため、代表的な内皮細胞モデルとして用いられました15,16。HUVECはDMEMで培養し、10%(v/v)胎児用牛血清および1%濃度の抗生物質・抗菌薬カクテルを補足しました。すべての細胞培養は標準的な生理条件下で加湿チャンバー(37°C、5%CO2)で維持され、持続的な細胞増殖を促進しつつ、トリパンブルー排除アッセイで>95%の生存率が確認されました。内皮特異的培地(例:EGM-2やM199に内皮成長サプリメントを補完)は長期的なHUVEC維持に一般的に推奨されますが、本研究ではDMEMを用いて実験的治療間の一貫性やLPS刺激および薬理学的阻害剤アッセイとの適合性を確保しました。AG-825阻害剤アッセイでは、10μM AG-825を含む新鮮なDMEMでHUVECを1時間インキュベートします。その後、LPS溶液をウェルに加え、最終濃度10 μg/mLにし、24時間培養を続けます。表現型ドリフトの可能性を最小限に抑えるため、HUVECは低パス数で使用され、DMEMベースの実験条件に短期的なアッセイのみを用いました。すべての機能的実験は、長時間の培養期間中ではなく、定められた治療期間内で行われました。

細胞トランスフェクション
circZBTB46の生物学的役割を明らかにするため、過剰発現プラスミド(oe-circZBTB46)およびマッチドネガティブコントロール構成体(oe-NC)を合成し、GenScriptによって検証されました。HUVECは1 x 10⁵細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートにシードされ、一晩培養してトランスフェクション時の約70%〜80%のコンフルエンスを達成しました。各ウェルごとに、2.5μgのプラスミドDNA(oe-circZBTB46またはoe-NC)を125μLの還元血清培地で希釈し、2.5μLのP3000試薬(チューブA)と混合しました。並行して、リポフェクタミン300033.75μLを還元血清培地125μL(チューブB)に希釈しました。その後、チューブAとチューブBを組み合わせて優しく混合し、室温で15〜20分間培養して複合体形成を可能にしました(最終複合体体積:250 μL/well)。複合体は抗生物質フリーの完全培地で細胞に滴下的に添加されました。37°C、5%CO2で6時間の培養後、トランスフェクション培地を新鮮な完全増殖培地に置き換えました。細胞はその後のアッセイの48時間にわたり培養されました。すべての手順はメーカーの指示に従って行われました。

LPS誘導モデル
in vitroのSA-AKIモデルを生成するために、OE-circZBTB46またはNCをトランスフェクトしたHUVEC(5×105細胞/ウェル)を96ウェルプレートにシードし、80%のコンフルエンスが得られるまで24時間維持しました。その後、これらの細胞は10 μg/mLのLPSで24時間処理を受けました。対照群はLPS処理なしのHUVECが行われました。

qRT-PCR
HUVECからの総RNA抽出は市販試薬を使用していました。市販試薬キットを用いてcDNA合成のための逆転写が行われました。定量PCR(qPCR)はリアルタイムPCRシステムとマスターミックスを用いて三つずつ実行されました。標的遺伝子の発現量はU6に対して較正され、2−ΔΔCT法17,18で解析が行われました。circRNA発現解析では、U6の小さな核RNAが正規化の内部基準として用いられました。これは小型非コードRNAの定量に一般的に用いられ、短期のin vitro実験条件下で比較的安定した発現を示すことが報告されています。本研究で適用されたプライマー配列は以下の通りです。

circZBTB46-フォワード:5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-リバース:5'-CGCCTCTTACAGACTGGG-3'

U6-フォワード:5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-リバース:5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTCTG-3'。

CCK-8アッセイ
HUVECの有効性は市販のCCK-8を用いて評価されました。簡単に言うと、細胞は96ウェルのプレートにシードされ、細胞は24時間の接着培養を受けました。その後、各ウェルに10μLのCCK-8溶液を加え、さらに37°Cで2時間培養しました。マイクロプレートリーダーを用いて、450 nmの波長で光学密度(OD)を測定しました。予備的観察では、10 μg/mLのLPSがHUVECの生存可能性を有意に低下させることが示され、この濃度が後の実験プロセスで選択されることになりました。

フローサイトメトリー
当初、HUVECは標準手順に従ってEDTAフリートリプシンで剥離されました。製造元のAnnexin V-APC/PI Apoptosis Assay Kitのガイドラインに従い、酵素解離後に細胞懸濁液を1,000 x gで4°Cで5分間遠心分離しました。ペレット化された細胞は同じ条件下で氷冷PBSで2回洗浄され、100μLの1x結合バッファーに再懸濁されました。各サンプルは5μLのAnnexin V-FITC共役液と5μLのヨウ化物プロピジウム染色液で処理され、その後室温(20-25°C)の暗闇で10分間の培養が行われました。最後に、すべてのサンプルに400μLの1x結合バッファーを追加し、フローサイトメーターを用いて1時間以内にアポトーシスを解析しました。イベントは最初にFSC/SSCによって破片を排除するためにゲートが設けられました。アポトーシス解析のために、適切な対照群(染色なしおよび単染色/補償対照群)を用いて、アネクシンV-FITC vs PIプロットにクアドラントゲートを適用し、生体(Annexin V-/PI-)、初期アポトーシス(Annexin V+/PI-)、後期アポトーシス(Annexin V+/PI+)、および壊死(Annexin V-/PI+)集団を定義しました。すべてのサンプルに同じゲートテンプレートと閾値が適用されました。

ELISAアッセイ
培養HUVECの上清液中の炎症因子(腫瘍壊死因子α(TNF-α)、インターロイキン6(IL-6)、インターロイキン1β(IL-1β)の濃度を市販のELISAキットを用いて測定しました。具体的には、製造元の指示に従い、ヒトTNF-α ELISAキット、ヒトIL-6 ELISAキット、ヒトIL-1β ELISAキットが使用されました。各アッセイごとに、1ウェルあたり50μLの希釈されていない細胞培養上清液が充填されました。標準曲線は、提供されたシリアル希釈(TNF-αを用いて生成されました:0-1000 pg/mL;IL-6:0-500 pg/mL;IL-1β: 0-200 pg/mL)。サンプルと標準添加の後、プレートは37°Cで90分間インキュベートされ、その後ウォッシュバッファーを使った5回の洗浄が行われました。その後、ビオチン結合検出抗体を追加し、37°Cで60分間インキュベートしました。さらに洗浄工程を経て、ストレプタビジン-HRPを加え、37°Cで30分間培養しました。最終洗浄後、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)基質を加え、37°Cで暗闇で15分間培養しました。反応は停止溶液で終了し、直ちに450 nmで630 nmの基準波長で吸収が測定されました。各サンプルと標準物質は重複分析され、すべての実験には3つの独立した生物学的複製が含まれていました。上清液中の酸化ストレスマーカーであるマロンジアルデヒド(MDA)、スーパーオキシドジムターゼ(SOD)、カタラーゼ(CAT)のレベルは、MDA ELISAキット、SOD ELISAキット、CAT ELISAキットを用いて、提供されたプロトコル19、20、21に従って評価されました。MDAおよびSODアッセイでは、1ウェルあたり希釈せずに40μLの上清液を使用しました。CATでは、サンプルをアッセイバッファーで1:10で希釈してからローディングしました。標準曲線はキット仕様に従って作成されました(MDA:0-60 nmol/mL;SOD:0-100 U/mL;CAT:0-100 U/mL)。インキュベーション手順は以下の通りです:MDA - 37°Cで60分;SOD - 37°Cで60分;CAT - 37°Cで30分。 主要なインキュベーションの間隔で皿は4回洗われました。色現は、それぞれの基質を加え、37°C(MDA:15分)で培養することで実現されました。SOD:20分;CAT:15分)。吸収度はSODとCATで450nm、MDAで532nmで測定されました。すべての測定は重複井戸で行われ、3つの独立した生物学的複製にまたがって繰り返し行われました。

RNAシーケンス
製造元の指示に従い、市販試薬を用いてHUVECから総RNAを抽出しました。RNA純度と濃度は分光光度計を用いて260 nmおよび280 nm(A260/A280)で吸収を測定し、RNAの完全性はバイオアナライザーで評価されました。その後のライブラリ調製には、RNA完全性番号(RIN)≥7のRNAサンプルのみが使用されました。リボソームRNAは商業企業による標準的なrRNA除去手順を用いてライブラリー調製中に除去されました。該当する場合、ライブラリ構築前にRNase R処理を用いて線状RNAを選択的に消化し、環状RNA種を濃縮しました。その後、RNAライブラリー調製キットマニュアルの標準プロトコルに従い、高温条件下で適切なサイズのRNA断片を生成するためにRNA断片化を行いました。シーケンスライブラリは、製造元の指示に従いRNAライブラリープレミュレーションキットを用いて準備され、Illuminaプラットフォーム上でペアエンドシーケンス戦略(読み取り長150 bp(PE150)でシーケンスされました。シーケンスの深さはトランスクリプトーム全体の解析を支持するのに十分でした。生のシーケンスリードは標準的な品質管理手順を用いて処理され、アダプター配列や低品質リードを除去しました。クリーンリードはヒト参照ゲノムにアラインメントされ、遺伝子発現レベルはそれに応じて定量されました。LPS刺激下でcircZBTB46過剰発現HUVECとNC処理HUVEC間の差異発現遺伝子(DEGs)を特定しました。遺伝子セット濃縮解析(GSEA)を実施し、circZBTB46過剰発現に関連するシグナル伝達経路を特定しました。遺伝子は実験群間の発現差異に基づいてランク付けされました。Molecular Signatures Database(MSigDB)から選出された遺伝子セットが濃縮解析に使用されました。濃縮有意意は正規化濃縮スコア(NES)および偽発見率(FDR)に基づいて評価され、FDR<0.25は統計的に有意とされました。CircRNAシーケンシングおよび関連するすべてのバイオインフォマティクス解析は外部委託されました。

DEGの識別
DEGをスクリーニングするために、DESeq(2012)Rソフトウェアパッケージを通じて、2つの異なるグループ間の発現レベルを比較しました。統計的有意の閾値は p < 0.05 と定義され、|log2FC|値が0.58を超える。ヒートマップはpheatmap Rパッケージで生成され、火山プロットはGoplot2 Rパッケージを使って描画しました。

機能豊化解析
線形転写産本から導出されたGOおよびKEGG濃縮解析はオンラインプラットフォームEnrichRを用いて行われ、バブルチャートはGOplot Rパッケージに基づいて作成されました。GSEAソフトウェアは、MSigDBデータベースが提供する発現行列および遺伝子セットファイルに基づき、解析パラメータ(例:置換数や統計手法)を設定した上で利用されました。遺伝子セットの濃縮は正規化濃縮スコア(NES)、P値、FDR値を用いて評価され、差異発現遺伝子の機能と潜在的な生物学的メカニズムを詳細に探求しました。

ウェスタン・ブロット
RIPA溶解バッファーにプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を補足し、HUVECs(約1×10⁶細胞)から総タンパク質を抽出しました。タンパク質濃度はBCAタンパク質定量キットを用いて測定されました。同量のタンパク質(1レーンあたり20μg)を、10%ナトリウムドデシル硫酸塩ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を80Vで30分間、続いて120Vで60分間電気泳動で分離しました。その後、タンパク質は100Vの湿式トランスファーシステムで4°Cで90分間ポリビニリデンフッ化物(PVDF)膜に移されました。 膜は、トリス緩衝食塩水に0.1%トゥイーン-20(TBST)を含み、5%無脂肪ミルクで室温で1時間ブロッキングし、その後同じブロッキングバッファー(標的タンパク質は通常1:1000、GAPDHは1:5000)で希釈した一次抗体を4°Cで一晩培養しました。使用された一次抗体は、ERBB2、p-AKT、AKT、GAPDHです。培養後、膜をTBSTで3回(洗車1回10分)洗浄し、その後ホースラディッシュ過酸化酵素(HRP)結合ヤギ抗ウサギ用IgG二次抗体(ブロッキングバッファーに1:5000)を室温で1時間培養しました。さらに3回のTBST洗浄(各10分)を行った後、強化化学発光(ECL)ウェスタンブロッティング基質キットを用いてタンパク質バンドを可視化し、イメージングシステムで画像化しました。バンド強度はソフトウェアで定量化されました。

統計解析
統計評価はGraphPad Prism 10を用いて実施されました。データは平均標準誤差(SEM)±表示されます。p値<0.05が統計的有意性を示すために定義されました。

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結果

in vitro SA-AKIモデルにおけるcircZBTB46発現のqRT-PCR解析
この一連の実験は、 circZBTB46 の発現がLPS刺激下で変化し、 circZBTB46 の調節がin vitro SA-AKIモデルにおける内皮細胞の生存率およびアポトーシスに影響を与えるという仮説を検証するために実施されました。当初、 circZBTB46 の発現は対照条件下および in vitro SA-AKI系で調査されました。 図1Aに示すように、LPS処理済みHUVECsでは未処理対照細胞と比較して circZBTB46 の発現が著しく減少しました。この結果は、LPS治療下で ci...

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ディスカッション

敗血症の間、病原体から放出されるLPSなどの病原体関連分子パターン(PAMPs)がToll様受容体(例:TLR4)を活性化し、全身性炎症反応を開始する26。この過程はTNF-α、IL-6、IL-1βなどの複数の炎症促進メディエーターの分泌を引き起こし、サイトカインストーム27を引き起こします。同時に、LPSは血管内皮細胞を直接損傷し、微小循環障害、血管透過性の増加、血栓症を引き起こし、最終的には腎血流を妨げます27。さらに、LPS誘発の酸化ストレスは過剰なROSを生じ、腎管上皮および内皮細胞をさらに損傷させ、ミトコンドリア依存性経路を通じて細胞のアポトーシスを促進します。これらの過程は総じて、管機能障害、糸球体ろ過率の低下、そして最終的には急性腎障害を引き起こします9。したがって、SA-AKIの核心的なメカニズムは、炎症反応、内皮機能...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。著者らは、本原稿で提示された主な成果はこれまでに発表されておらず、他の出版を検討しているわけではないと述べています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AG-825(ErbB2阻害剤)メドケムエクスプレスHY-1019710 & mu;Mは経路封鎖のMです
Agilent 2100バイオアナライザーアジレントG2939BARNA完全性(RIN≥7)
AKT抗体プロテインテック60203-2-IgWB(1:15000)
アネクシン V-APC/PI アポトーシスキットエラブサイエンスE-CK-A327アポトーシス検出
抗生物質-抗菌薬ギブコ152400621%の濃度
BCAタンパク質定量キットビヨタイムP0012タンパク質濃度
キャット・エリサ・キットメイミアンMM-0897H2抗酸化酵素
CCK-8キット道津島CK04細胞生存率アッセイ
CircRNAセクシーキュー福州華融科輝バイオテクノロジー有限公司PE150CircRNAシーケンシングおよび関連するバイオインフォマティクス解析
CytoFLEXフローサイトメーターベックマン・カウルターB53000アポトーシス解析
DMEMGibco(インビトロジェン)11965092細胞培養培地
ECL基板キットミリポールWBKLS0100タンパク質検出
ERBB2抗体シノ・バイオカル100271-T32WB(1:10000)
胎児用牛血清(FBS)バイオカル・インダストリーズ04-001-1ACS10%(v/v)サプリメント
GAPDH抗体プロテインテック60004-1-IgWB(1:50000)
HUVECs(フーベック)プロセルシステムCP-H082細胞株の起源
IL-1とベータ;ELISAキットメイミアンMM-0181H2炎症因子
IL-6 ELISAキットメイミアンMM-0049H2炎症因子
イルミナ・ノヴァセクティック 6000イルミナ20012850RNAシーケンス
リポフェクタミン3000インビトロジェンL3000008トランスフェクション試薬
LPS(大腸菌 O111:B4)シグマ・オルドリッチL263010 & mu;SA-AKIモデルのg/mL
MDA ELISAキットメイミアンMM-2037H2酸化ストレスマーカー
ナノドロップ2000サーモ・フィッシャーND-2000RNA定量化
NEBNext Ultra II RNAライブラリキットNEBE7770SRNA-seqライブラリープレップ
oe-circZBTB46プラスミドジェンスクリプトカスタム合成circZBTB46 過発現ベクター
OE-NCプラスミドジェンスクリプトカスタム合成負のコントロールベクトル
p-AKT(Ser473)抗体プロテインテック66444-1-IgWB(1:1200)
PrimeScript RT Reagent Kit宝RR047AcDNA合成
PVDF膜ミリポールIPVH00010ウェスタンブロット転移
QuantStudio 5システムサーモ・フィッシャーA28137リアルタイムPCR
リボヌクレアーゼRルシゲンRNR07250rRNA除去
RIPA溶解バッファービヨタイムP0013Bタンパク質抽出
RNAiso Plus宝9109全RNA抽出
SOD ELISAキットメイミアンMM-25469H2抗酸化酵素
TBグリーン・プリミックス Ex Taq宝RR420AqPCR試薬
TNF-およびα;ELISAキットメイミアンMM-0122H2炎症因子

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