敗血症関連急性腎損傷(SA-AKI)はかなりの死亡率と関連しています。本研究では、LPS誘導HUVECs(SA-AKIin vitro)においてcircZBTB46がダウンレギュレーションされていることが明らかになりました。その過剰発現はHUVECの生存率を高め、ERBB2/AKTシグナル伝達と関連したアポトーシス、炎症、酸化ストレスを減少させ、SA-AKIに関連する潜在的な治療標的を示唆しています。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
研究記事
敗血症関連急性腎損傷(SA-AKI)はかなりの死亡率と関連しています。本研究では、LPS誘導HUVECs(SA-AKIin vitro)においてcircZBTB46がダウンレギュレーションされていることが明らかになりました。その過剰発現はHUVECの生存率を高め、ERBB2/AKTシグナル伝達と関連したアポトーシス、炎症、酸化ストレスを減少させ、SA-AKIに関連する潜在的な治療標的を示唆しています。
循環RNAはストレス応答の新たな調節因子として登場していますが、敗血症に関連する急性腎障害を引き起こす内皮損傷におけるその役割は完全には定義されていません。私たちは、環状RNA のZBTB46 (circZBTB46)がERBB2-AKTシグナルを作用させることで内皮保護をもたらすと仮説を立てました。ヒト臍帯静脈内皮細胞をリポ多糖で挑戦する細胞ベースモデルを用いて、 circZBTB46 の発現を定量化し、その強制発現が生存、アポトーシス、炎症メディエーター、酸化還元恒常性に与える影響を検証しました。細胞生存率アッセイとフローサイトメトリーで生存率とアポトーシスが評価されました。酵素結合免疫吸着アッセイではインターロイキン-6、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1βが測定され、活性酸素種、マロンジアルデヒド、スーパーオキシドジムターゼ、カタラーゼは酸化損傷および抗酸化能力の指標として評価されました。メカニズムを定義するために、遺伝子セットリッチメント解析を用いたトランスクリプトームプロファイリングを行い、ウェスタンブロッティングによる経路タンパク質の確認を行い、ERBB2阻害剤AG-825を用いた必要性を評価しました。リポ多糖が抑制された circZBTB46。 CircZBTB46 の過剰発現は生存率を高め、アポトーシスを低下させ、炎症促進サイトカインおよび活性酸素種を減少させ、マロンジアルデヒドを減少させ、超酸化物ジムターゼおよびカタラーゼ活性を高めました。トランスクリプトミクスおよびタンパク質解析はERBB2-AKT軸の活性化を支持し、薬理学的ERBB2阻害は細胞保護を鈍らせ、酸化還元バランスの改善を逆転させました。これらの発見は 、circZBTB46 がERBB2-AKTシグナル伝達を通じてリポ多糖誘発性内皮損傷を抑制する内因性障害であることを特定し、 circZBTB46 を敗血症関連急性腎障害の機構的結節および治療対象として指名していることを示しています。
敗血症は病原性侵襲によって引き起こされる生命を脅かす全身性炎症カスケードであり、多くの場合多臓器不全に至ります。この重要な文脈の中で、SA-AKIは集中治療室における主要かつ臨床的に重要な合併症として浮上します。全身感染と同時に腎のろ過能力が急激に低下することが特徴であり、臨床コホート2では非敗血性AKIの死亡率を38%〜42%上回る。敗血症または敗血症性ショックと診断された人の約60%がSA-AKI3を発症すると予想されます。したがって、SA-AKIは集中治療において大きな課題となり、罹患率や死亡率に大きく寄与しています4.現在、SA-AKIのメカニズムは完全には解明されていません。前臨床研究では微小循環機能障害、細胞代謝の変化、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系(RAAS)の不均衡、ミトコンドリア機能障害、炎症調節障害が関与していますが、SA-AKIの病態生理学的メカニズムは依然として不明瞭であり、早期診断と継続的な管理を支援する最適な対策が現時点で不足しています5,6,7,8 ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
本プロトコルは、 circZBTB46 調節がHUVECにおける炎症シグナル伝達、酸化ストレス、ERBB2-AKT経路活性化に与える影響を調査するための実験的手法を説明しています。
細胞培養
本研究で使用されたHUVECsセルは市販の供給源から入手されました。HUVECは、その広範な入手可能性、再現性のある培養条件、高いトランスフェクション効率から、炎症ストレス下での内皮シグナル伝達経路の遺伝子操作や機構的調査を容易にするため、代表的な内皮細胞モデルとして用いられました15,16。HUVECはDMEMで培養し、10%(v/v)胎児用牛血清および1%濃度の抗生物質・抗菌薬カクテルを補足しました。すべての細胞培養は標準的な生理条件下で加湿チャンバー(37°C、5%CO2)で維持され、持続的な細胞増殖を促進しつつ、トリパンブルー排除アッセイで>95%の生存率が確認されました。内皮特異的培地(例:EGM-2やM199に内皮成長サプリメントを補完)は長期的なHUVEC維持に一般的に推奨されますが、本研究ではDMEMを用いて実験的治療間の一貫性やLPS刺激および薬理学的阻害剤アッセイとの適合性を確保しました。AG-825阻害剤....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
in vitro SA-AKIモデルにおけるcircZBTB46発現のqRT-PCR解析
この一連の実験は、 circZBTB46 の発現がLPS刺激下で変化し、 circZBTB46 の調節がin vitro SA-AKIモデルにおける内皮細胞の生存率およびアポトーシスに影響を与えるという仮説を検証するために実施されました。当初、 circZBTB46 の発現は対照条件下および in vitro SA-AKI系で調査されました。 図1Aに示すように、LPS処理済みHUVECsでは未処理対照細胞と比較して circZBTB46 の発現が著しく減少しました。この結果は、LPS治療下で ci.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
敗血症の間、病原体から放出されるLPSなどの病原体関連分子パターン(PAMPs)がToll様受容体(例:TLR4)を活性化し、全身性炎症反応を開始する26。この過程はTNF-α、IL-6、IL-1βなどの複数の炎症促進メディエーターの分泌を引き起こし、サイトカインストーム27を引き起こします。同時に、LPSは血管内皮細胞を直接損傷し、微小循環障害、血管透過性の増加、血栓症を引き起こし、最終的には腎血流を妨げます27。さらに、LPS誘発の酸化ストレスは過剰なROSを生じ、腎管上皮および内皮細胞をさらに損傷させ、ミトコンドリア依存性経路を通じて細胞のアポトーシスを促進します。これらの過程は総じて、管機能障害、糸球体ろ過率の低下、そして最終的には急性腎障害を引き起こします9。したがって、SA-AKIの核心的なメカニズムは、炎症反応、内皮機能.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。著者らは、本原稿で提示された主な成果はこれまでに発表されておらず、他の出版を検討しているわけではないと述べています。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AG-825(ErbB2阻害剤) | メドケムエクスプレス | HY-10197 | 10 & mu;Mは経路封鎖のMです |
| Agilent 2100バイオアナライザー | アジレント | G2939BA | RNA完全性(RIN≥7) |
| AKT抗体 | プロテインテック | 60203-2-Ig | WB(1:15000) |
| アネクシン V-APC/PI アポトーシスキット | エラブサイエンス | E-CK-A327 | アポトーシス検出 |
| 抗生物質-抗菌薬 | ギブコ | 15240062 | 1%の濃度 |
| BCAタンパク質定量キット | ビヨタイム | P0012 | タンパク質濃度 |
| キャット・エリサ・キット | メイミアン | MM-0897H2 | 抗酸化酵素 |
| CCK-8キット | 道津島 | CK04 | 細胞生存率アッセイ |
| CircRNAセクシーキュー | 福州華融科輝バイオテクノロジー有限公司 | PE150 | CircRNAシーケンシングおよび関連するバイオインフォマティクス解析 |
| CytoFLEXフローサイトメーター | ベックマン・カウルター | B53000 | アポトーシス解析 |
| DMEM | Gibco(インビトロジェン) | 11965092 | 細胞培養培地 |
| ECL基板キット | ミリポール | WBKLS0100 | タンパク質検出 |
| ERBB2抗体 | シノ・バイオカル | 100271-T32 | WB(1:10000) |
| 胎児用牛血清(FBS) | バイオカル・インダストリーズ | 04-001-1ACS | 10%(v/v)サプリメント |
| GAPDH抗体 | プロテインテック | 60004-1-Ig | WB(1:50000) |
| HUVECs(フーベック) | プロセルシステム | CP-H082 | 細胞株の起源 |
| IL-1とベータ;ELISAキット | メイミアン | MM-0181H2 | 炎症因子 |
| IL-6 ELISAキット | メイミアン | MM-0049H2 | 炎症因子 |
| イルミナ・ノヴァセクティック 6000 | イルミナ | 20012850 | RNAシーケンス |
| リポフェクタミン3000 | インビトロジェン | L3000008 | トランスフェクション試薬 |
| LPS(大腸菌 O111:B4) | シグマ・オルドリッチ | L2630 | 10 & mu;SA-AKIモデルのg/mL |
| MDA ELISAキット | メイミアン | MM-2037H2 | 酸化ストレスマーカー |
| ナノドロップ2000 | サーモ・フィッシャー | ND-2000 | RNA定量化 |
| NEBNext Ultra II RNAライブラリキット | NEB | E7770S | RNA-seqライブラリープレップ |
| oe-circZBTB46プラスミド | ジェンスクリプト | カスタム合成 | circZBTB46 過発現ベクター |
| OE-NCプラスミド | ジェンスクリプト | カスタム合成 | 負のコントロールベクトル |
| p-AKT(Ser473)抗体 | プロテインテック | 66444-1-Ig | WB(1:1200) |
| PrimeScript RT Reagent Kit | 宝 | RR047A | cDNA合成 |
| PVDF膜 | ミリポール | IPVH00010 | ウェスタンブロット転移 |
| QuantStudio 5システム | サーモ・フィッシャー | A28137 | リアルタイムPCR |
| リボヌクレアーゼR | ルシゲン | RNR07250 | rRNA除去 |
| RIPA溶解バッファー | ビヨタイム | P0013B | タンパク質抽出 |
| RNAiso Plus | 宝 | 9109 | 全RNA抽出 |
| SOD ELISAキット | メイミアン | MM-25469H2 | 抗酸化酵素 |
| TBグリーン・プリミックス Ex Taq | 宝 | RR420A | qPCR試薬 |
| TNF-およびα;ELISAキット | メイミアン | MM-0122H2 | 炎症因子 |
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。