マウス皮下脂肪組織由来間質血管分画を用いた脂肪細胞インスリン抵抗性のモデリング

サマリー

本研究は、マウスの皮下脂肪組織から得られた間質血管分画を用いてデキサメタゾン処理を行い、インスリン抵抗性を模擬した実験プロトコルを提示します。脂肪組織の複雑さを保持することで、メカニズム研究のための生理学的に信頼できるプラットフォームを提供します。

要約

脂肪組織におけるインスリン抵抗性は、2型糖尿病などの代謝疾患の中心的特徴ですが、多くの in vitro モデルは、ネイティブ脂肪組織の細胞複雑さを完全に反映しない不死化細胞株に依存しています。このプロトコルの目的は、マウス皮下脂肪組織の間質血管分数(SVF)由来の一次脂肪細胞を用いて、脂肪細胞インスリン抵抗性を再現可能かつ実験的に利用可能にモデリングする方法を確立することです。このプロトコルは、酵素によるSVF細胞の分離、脂質を含む成熟脂肪細胞への脂肪生成分化、そしてその後のデキサメタゾンを用いたインスリン抵抗性の誘導について説明しています。インスリン抵抗性は、機能的および分子的な指標によって定義され、PI3K-AKT経路における主要なインスリンシグナル伝達タンパク質のリン酸化の低下などが含まれます。SVF由来の細胞異質性を保持することで、このアプローチは一次細胞ベースのシステムを提供し、従来の細胞株よりも脂肪組織の生理学により近い条件下での脂肪細胞インスリンシグナル伝達の研究を支援します。このプロトコルは、脂肪細胞インスリン抵抗性のメカニズムを研究したり代謝介入を評価したりするための標準化されたプラットフォームを求める研究者を対象としており、測定結果は精製された脂肪細胞集団ではなく、混合SVF由来培養からの反応を反映していることを認識しています。

概要

2型糖尿病(T2DM)は、世界的に最も急速に増加している非感染性代謝疾患の一つとなり、患者数は現在5億3700万人を超え、2045年までに7億8300万人を超えると予測^{されています。}その主要な病態生理的特徴は末梢組織インスリン抵抗性(IR)として現れ、進行性のβ細胞機能障害を伴います^。IRの本質は、標的臓器に生理的に濃縮されたインスリンによって引き起こされる生物学的効果の著しい減少にあり、その結果、グルコースの取り込みが減少し、肝臓のグルコース量が増加し、リポリシス阻害が低下するという点にあります^。脂肪組織はインスリンの最も重要な標的器官の一つです。肥満は脂肪細胞をインスリンに鈍化させ、グルコースの取り込みを減少させ、トリグリセリド合成を阻害する一方で、リポリシスを増加させ自由脂肪酸を増やし、全身性インス^{リン抵抗性}を悪化^{させます。}

生理学的条件下では、インスリンはPI3K-AKT経路を活性化し、グルコーストランスポーター4(GLUT4)を細胞膜に移動させ、脂肪細胞におけるグルコースの取り込みとトリグリセリド合成を促進します。同時に、インスリンは脂滴表面の脂肪トリグリセリパーゼ(ATGL)およびホルモン感受性リパーゼ(HSL)の活性を阻害し、脂溶を遮断^します。IRが起こると、インスリンシグナル伝達が障害され、リポリシス阻害が弱まり、大量の遊離脂肪酸(FFA)が血流に放出されます。これによりFFAが大量に血流中に放出され、肝臓、骨格筋、膵臓などの臓器に異所性トリグリセリド沈着が起こります。これにより唇毒性や慢性炎症が誘発され、最終的にT2DM⁷の発症と進行に寄与します。したがって、in vivo のIR特性を再現する成熟した脂肪細胞モデルの確立は、IRの分子メカニズムを解明し、新しい介入戦略を開発するために極めて重要です。

現在、3T3-L1マウス胚性線維芽細胞株は、短い誘導サイクルと良好な再現性(^8,9)により、脂肪細胞IRのin vitro研究における古典的なツールとなっています。しかし、3T3-L1細胞の胚起源、均一な遺伝的背景、長期経過後の表現型ドリフトに対する感受性は、成体の原所脂肪細胞と比べて代謝行動に有意な違いをもたらし、翻訳医学的価値を制限しています^10,11。対照的に、齧歯類の皮下脂肪組織から分離された間質血管画率(SVF)は多能性脂肪幹細胞(ASC)を豊富に含んでいます。これらのASCから分化した成熟脂肪酸は、形態学的、機能的、転写的特徴を持ち、広く使われている3T3-L1細胞株よりも、ネイティブの白い脂肪細胞により近い特性を示します。これにより、SVF由来の脂肪細胞は、一次組織の^{複雑性により}近似できる文脈でインスリンシグナル伝達と抵抗性を研究するための補完的なモデルとなります。

このプロトコルは、不死化細胞株よりも組織の異質性が高い一次脂肪細胞モデルにおけるインスリン作用を研究する研究者に最も適しています。ただし、SVFは内皮細胞と免疫細胞を含む混合集団であることに注意が必要です。したがって、データ結果は脂肪細胞が主要な要素であるが排他的ではない文化の行動を反映しています。このモデルは、純粋で同期した脂肪細胞集団を必要とする研究にはあまり適さない場合があります。

本研究は、SVF由来の成熟脂肪細胞を用いてインスリン抵抗性細胞モデルを構築するプロトコルを提案します。プロトコルは、SVFの分離、培養、分化、誘導の全過程を詳細に記述し、 生体内で脂肪細胞のインスリン抵抗性状態を成功裏に模倣しています。モデル評価は、グルコース消費量、細胞形態、分子メカニズムのレベルで行われます。これは、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性の分子メカニズムを調査するための技術的基盤を提供します。

プロトコル

すべての動物実験は新疆医科大学動物実験倫理委員会(倫理承認番号:IAGUC-20240228-41)によって承認されました。

1. SVF絶縁

1. 実験動物:4〜6週間前のSPFグレードC57BL/6Jマウス、体重9〜11gを使用します。飼育は22±2°Cで12時間の明暗サイクルを行い、餌と水は自由に提供してください。
2. 滅菌準備:すべての器具と消耗品を121°Cで30分間オートクレーブします。実験前に、層流フードに75%エタノールを噴霧し、UV光で≥15分間照射します。すべての手順はクラスIIのバイオセーフティキャビネット内で実施してください。滅菌手袋とマスクを着用してください。
3. 脂肪組織採取:マウスを二酸化炭素吸入後、子宮頸部脱臼で安楽死させます。すぐに75%エタノールに10分間浸して表面消毒します。無菌眼科ハサミを使い、胸部と腹部の中央線に沿って円形の切開を開けます。鈍的解離を行い、内腿部に位置し精巣部に向かってV字型に伸びる両側の鼠径部白色脂肪組織を露出させます。目に見えるリンパ節は慎重に取り除いてください。脂肪組織を事前に冷却したPBSに集め、3回の速い洗浄を行います。
4. コラーゲン酵素の消化:洗浄した脂肪組織を直ちに無菌培養皿に移し、1〜2 mm³の断片にミンチします。組織の1.5倍から2倍の体積で、タイプIIコラーゲンナーゼ(Dulbecco's PBSに溶解、pH 7.4、37°Cに予備加熱)を0.2%を加えます。定温シェイカーで37°C、100rpmで10分間孵育します。消化過剰を防ぐために、3分ごとに優しく逆さまにしてください。
5. 終了とろ過:消化完了後、同じ量の予温された完全培地(DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% ペニシリン-ストレプトマイシン)を37°Cで加えて反応を終了させます。1mLのピペットチップで5〜8回優しくピペットを送り込みます。70μmの細胞ストレーナーを通して未消化の組織断片や成熟した脂肪細胞を除去します。
6. 遠心分離と洗浄:ろ液を300 x g で25°Cで5分間遠心分離します。 成熟した脂肪細胞を含む上澄液は慎重に捨ててください。ペレットを完全な培地に再懸浮させます。再び300 x g で25°Cで5分間遠心分離機にします。 この洗浄工程を2回繰り返し、残留コラーゲナーゼと成熟した脂肪細胞を除去します。
7. シーディングと培養:最終ペレットを1mLの完全な培地に再懸浮させます。10cm細胞培養皿あたり4マウスの鼠径脂肪サンプルの密度で種子を採取します。37°Cで5%のCO₂で培養します。24時間後に最初の培地交換を行い、非接着細胞を除去します。その後、48時間ごとに培地を交換してください。細胞が80%〜90%の合流に達したら通過させます。
   注意:コンフルーションが90%を超えた場合は、細胞が接触阻害に達し増殖能力が低下しているため、パスジングしないでください。

2. タイプIIコラーゲナーゼ作動溶液の調製

1. 試薬および消耗品:タイプIIコラーゲン(活性≥120 U/mg)を取得;BSA(脂肪酸フリー≥98%)、ヘペス;ダルベッコ氏PBS(Ca²⁺ 1.8 mmol/L、Mg²⁺ 0.9 mmol/Lを含む)、pH 7.2-7.4;0.22μmの無菌低タンパク質結合フィルター。
2. 0.2%タイプIIコラーゲン酵素溶液の調製:タイプIIコラーゲン酵素粉末60mg、BSA800mg、HEPES48mgを50mL遠心分離機チューブに重みます。40mLまで薄めて、ダルベッコのPBSで使います。1 M NaOHまたはHClを使ってpHを7.4±0.1に調整します。0.22 μmフィルターでろ過して滅菌します。1本あたり5mLを分けて-20°Cで保存します。 繰り返される凍結融解のサイクルは避けてください。
3. 細胞が通過後に100%合流に達したときに分化を誘導します。最適な分化状態は、渦状の形態を示す細胞によって示されます。最初の48時間は誘導溶液Iを使用し、その後誘導溶液IIに切り替えます(表1参照)。
4. 以下の基準で分化の成功を確認する:誘導4日目までに、オイルレッドO染色によりほとんどの細胞で脂質滴の蓄積(約50%)が明らかになり、主要な脂肪形成マーカーの発現が統計的に有意に増加(p < 0.05)見られる。

3. インスリン抵抗性モデルの確立

1. インスリン抵抗性を誘発する起点として分化4日目を選びます。顕微鏡ですべての細胞が紡錘形から丸形への形態的遷移を示し、ほとんどの細胞の細胞質は高屈折率の脂質滴で満たされていることを確認してください。
2. 培地を1μmol/LのDexを含む誘導培地IIに交換し、48時間培養を続けます(表1参照)。この手順の後、インスリン抵抗性脂肪細胞モデルが確立されたと考えます。これらの細胞はそれ以上の形態変化を示しません。これらの細胞は、グルコースの取り込み・摂取アッセイやインスリンシグナル伝達経路タンパク質の検出に直接用いられます。
3. インスリン抵抗性モデル確立の成功基準:デキサメタゾン治療48時間後、100 nMインスリンで刺激されたほとんどの細胞でグルコース取り込み能力が約40%低下することが確認されました。また、主要なインスリンシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化レベルが統計的に有意に低下していること(p < 0.05)を確認しましょう。
   注:このプロセスには誘導維持培地IIの継続的な添加が必要です。

4. 培養上清液中の残留グルコース検出

1. 指定された時間点で細胞培養上清液を採取します。細胞を4°C、300 x g で遠心分離して5分間取り出します。
2. グルコースオキシダーゼ-ペルオキシダーゼ(GOD-POD)アッセイキットを用いて上清液中のグルコース濃度を測定してください。濃度は次の式で計算します:
   グルコース濃度(mmol/L)=(_{A(サンプル)} - _A(空白))÷ (_A(標準) - A_(空白))* C_(標準値)
   グルコース消費量(mmol/L)=細胞遊離培地中のグルコース濃度(mmol/L)- 細胞上清中のグルコース濃度(mmol/L)
   正規化グルコース消費量(mmol/mgタンパク質)=生グルコース消費量(mmol/L)÷細胞内総タンパク質濃度(mg/L)

5. ウエスタン・ブロット

1. 指定された時刻に、100 nMインスリンを完全培地中に37°Cで10分間刺激し、PI3K-AKT経路を活性化します。その後、各3.5cmの細胞培養皿に200μLの細胞溶解バッファーを加えます。氷で30分間孵化します。遠心分離機で13,040 x g で10分間、4°Cで加熱します。 上清液を新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。BCAの作業液を使ってタンパク質濃度を定量します。
2. サンプルを8%のSDS-PAGゲルにロードします。ゲルを80Vで走らせ、サンプルが積み重ね/分離ゲル界面に達するまで続けます。電圧を120Vに上げ、マーカーバンドが完全に解消されるまで運転します。200 mAの定流で2時間転送を行います。
3. 膜を室温で5%の脱脂乳またはBSAと2時間孵育してブロッキングします。膜はTBSTで3回洗ってください。その後、一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。 一次抗体(希釈):AKT:1:1000、p-AKT(Ser473):1:1000、βアクチン:1:1000、PI3K p110α:1:1000、リン-PI3K p110:1:1000、C/EBPα:1:2000、FABP4:1:2000。
4. 膜はTBSTで3回洗ってください。その後、室温でHRP結合した二次抗体と1時間インキュベートします。二次抗体(希釈):ヤギ抗マウスIgG-HRP:1:5000、ヤギ抗ウサギ抗体IgG-HRP:1:5000。
5. ECL化学発光法を用いて信号を検出します。ウエスタンブロットイメージャーを使って実験結果を可視化し記録します。
6. ImageJソフトウェアを使って得られたバンドのグレースケール値を解析します。

6. グルコース取り込み染色アッセイ

1. 2つの指定された時間点で、基底グルコースからの干渉を除去するために、1%のFBSを含むRPMI 1640を用いて12時間別々に細胞を飢えさせます。
2. 100 nMインスリンで10分間刺激した後、各ウェルに1mLの1x 2-NBDG溶液を加えます。プレートは37°Cで1時間、光から保護して孵化させます。
3. 細胞は2〜3回洗いましょう。各ウェルに1mLのすぐに使えるホエスト染色液を加えます。プレートを37°Cの暗闇で10分間孵化します。染色液は培養容器の側面壁に沿ってゆっくりと加え、細胞層に直接接触しないよう細胞剥離を防ぎます。
4. 細胞を2〜3回洗い、その後PBSを加えます。逆型蛍光顕微鏡を用いて細胞の蛍光画像を撮影します。
5. ImageJソフトウェアを使って画像の定量分析を行います。ImageJを使って各チャネルを分離し、グルコース取り込み信号(緑のチャンネル)を核蛍光信号(青チャンネル)から分離します。
6. すべての画像を8ビットグレースケール画像に変換してください。Default 自動閾値アルゴリズムを適用して正の信号領域を定義します。
7. これらの指定領域内の平均蛍光強度を測定します。緑チャネルの平均蛍光強度を青チャネルの平均蛍光強度で割ることで、グルコース取り込み蛍光信号を正規化します。

7. オイルレッドO染色

1. オイルレッドOのストック溶液をRNaseフリーの水で3:2の比率で希釈します。溶液をフィルターペーパーと0.22μmフィルターで順次ろ過し、作業液を準備します。
2. 培地を吸引し、PBSで優しく2回洗います。各ウェルに4%のパラホルムアルデヒドを加え、室温で30分間固定します。
3. 固定液を加え、細胞を二重蒸留水で洗います。各井戸にオイルレッドO作業液1mLを加えます。プレートは室温の暗闇で25分間孵化します。
4. 染色後、染め液を吸引します。セルを蒸留水で徹底的に洗浄し、背景や汚れのアーティファクトを取り除いてください。細胞を覆うために蒸留水1mLを加えます。逆立顕微鏡で即座に明視野画像を撮影してください。

8. ボディピー

1. BODIPYストック溶液を無菌水で1:200の体積比で希釈し、作業液を準備します。
2. 独房のカバースリップは無菌PBSで洗いましょう。各カバースリップに4%パラホルムアルデヒド溶液30μLを加え、室温で30分間固定します。
3. 固定剤を吸引し、PBSで3回洗います。各細胞カバースリップに30μLのBODIPY作動液を加えます。室温の暗い環境で30分間培養します。
4. カバースリップはPBSで3回洗ってください。各カバースリップに30μLのDAPI染色を加えます。室温の暗い環境で10分間培養して細胞核を標識します。
5. カバースリップはPBSでさらに3回洗ってください。マウントを進める:クリーンな顕微鏡スライドに10μLのアンチフェードマウントメディウムを加えます。鉗子を使って、セルカバースリップ(セル面を下に)優しく逆さに取り付けて取り付け培地に貼ります。マウントを暗闇で乾かします。
6. レーザー走査型共焦点顕微鏡で画像を即座に撮影してください。

9. 統計分析

1. 各実験には3つの生物学的複製が含まれていました。GraphPad Prism 10.0ソフトウェアを使ってデータを解析します。標準偏差(平均±±標準偏差)として正規分布の基準を満たす定量データを提示します。正規性と分散均一性を満たす2つのグループに対して、独立サンプルt検定を適用します。複数のグループでは一方向ANOVAを行い、p<0.05が統計的に有意とみなされます。

10. 安全と廃棄物処理

1. 動物組織の取り扱い
   1. クラスIIバイオセーフティキャビネット内の一次細胞を含むすべての手順を無菌条件下で実施してください。
   2. すべての動物組織廃棄物、未使用臓器、汚染された消耗品を生物有害廃棄物として分類してください。そのような廃棄物は指定されたバイオハザードバッグに入れ、オートクレーブ処理を経て最終的に処分してください。
2. デキサメタゾンの取り扱い
   1. デックスパウダーを計量する際は手袋、医療用マスク、白衣を着用してください。化学煙幕内で溶液の調製を行います。
   2. Dexに汚染された廃棄物は別途回収し、化学廃棄物として処分してください。
3. 生物有害物質の取り扱い
   1. 実験手順を開始する前に、作業面およびバイオセーフティキャビネットの内部を70%エタノールで徹底的に消毒してください。
   2. 細胞培養から生成されるすべての液体廃棄物は、廃棄前に感染性を防ぐためにオートクレーブ処理を行ってください。

結果

C57BL/6JマウスのiWATから分離したSVF細胞は、培養皿での初期シード時に点状懸濁を示しました。約40%の細胞は種子授種後18時間後に一次付着を完了しました。種まき後5日目には細胞が完全に広がり、合流率は95%に達しました(図1A,B)。細胞が合流し、特徴的な渦状の配置を示すと、分化培地が置き換えられました。誘導4日目には、細胞内に多数の屈折脂質滴が確認され、成熟した脂肪細胞は人口の約3^分の1を占めていました(図1C,D)。

Oil Red OおよびBODIPY実験では、SVF細胞は誘導脂肪生成分化の4日目に豊富な脂質滴を蓄積し始めたことが明らかになりました(図2A,B)。同時に、転写因子C/EBPαの発現はこの段階でピークを迎え、主要な脂肪形成マーカーであるFABP4は有意...

ディスカッション

広範な研究により、SVF細胞ベースのモデルは脂肪組織の病理的特徴をシミュレートする上で独自の価値を持つことが示されています。しかし、これらのモデルの構築サイクルは通常約14日で組織分離、一次培養、誘導分化、デックス処理にかかるため、実験の連続性と細胞状態の安定性に課題をもたらします。これらの課題に対処するため、本研究は以下の主要指標を中心とした実験ワークフローを採用し最適化しました。(1) 約10gの健康な幼マウスをSVF細胞源として選択し、非常に活発な前脂肪細胞を得ること。(2) 組織処理の際、脂肪組織を約1 mm³の小さな細かい小片に細かく刻み、その後の酵素分解のために表面積を増やします。(3) 最適な細胞収量を得るために、37°C(pH 7.4)で新たに調製(保存≤3か月)のタイプIIコラーゲナーゼを使用し、消化時間を10分で確保します。(4) 分化およびデックス処理段階では、誘導剤またはデックスを完全な培地と十分に混合してから培養系に加え、バッチごとのばらつきを防ぎます。(5) インスリン抵抗性モデル確立の成功基準:デキサメタゾン治療48時間後、100 nMイン...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 & μ;Mフィルター	バイオシャープ	BSF-XS-0232-01
2-NBDG	ビヨタイム	S0561M
3-イソブチル-1-メチルキサンチン	シグマ	15879
4% ポリホルムアルデヒド	バイオシャープ	BL1278A
70 & mu;M細胞ストレーナー	バイオシャープ	BS-70-CS
反AKT	プロテインテック	10175
アンチC/EBP&アルファ;	アブクローネ	AB40764
反FABP4	細胞シグナル伝達技術	2120年代
アンチpAKT(Ser473)	プロテインテック	28731
アンチPI3K	バイオス	10657R
アンチpPI3K(p110ページ)	バイオス	6417R
抗β--ACTIN	プロテインテック	60008
BCAタンパク質アッセイキット	サーモ・フィッシャー	23225
ボディピー 493/503	インビトロジェン	D3922
BSAおよびEMSP;	シグマ	A7030
細胞攀爬のスライス、Biosharp	バイオシャープ	BS-14-RC
細胞培養皿、100mm x 20mm	コーニング	430167
細胞培養皿、35mm x 10mm	コーニング	430165
DAPIソリューション	ソーラービオ	28718-90-3
デキサメタゾン	シグマ	D2915
DMEM/F-12	ギブコ	C11330500BT
ダルベッコs PBS	シチバ	SH30264.02
エッペンドルフ管	コーニング	MCT-175-C
FBS	ライフ・アイラボ	AC03L0555
蛍光顕微鏡	ライカ	DMi8
グルコースオキシダーゼ-ペルオキシダーゼ	南京建成	F006-1-1
ヤギ抗マウス IgG-HRP	北京中山錦橋	ZB-2305
ヤギ抗ウサギ薬 IgG-HRP	北京中山錦橋	ZB-2301
GraphPad プリズム	バージョン 10.0.0	/
ヘペス	バイオフロックス	1112GR025
ホームチェスト	バイオシャープ	BL803A
イメージJ	バージョン 1.54p	/
インスリン	ソーラービオ	18040
レーザー走査共焦点顕微鏡	ニコン	ティ・エ
マウントメディアムアンチフェーディング	ソーラービオ	S2100
オイルレッドO染色液	シグマ	O0625-25G
ペニシリン・ストレプトマイシン	ハイクローン	SV30010
RIPAバッファ	サーモ・フィッシャー	89901
ロジグリタゾン	シグマ	R2408
RPMI 1640	ビバセル	C3010-0500
スキムミルクパウダー	バイオフロックス	1132GR500
TBSバッファ	ソーラービオ	T1060
タイプIIコラーゲン酵素	シグマ	C6885