研究記事

取り外し可能な部分入れ歯者における赤色複合細菌DNAおよび歯周状態のリアルタイムPCR定量

DOI：

10.3791/69774

⸱

2026年1月2日

 ,  , 
1Department of Prosthodontics, Dental School, Faculty of Medicine, University of Prishtina, 2Department of Reconstructive Dentistry and Gerodontology, School of Dental Medicine, University of Bern, 3Oral Implantology Research Institute, 4School of Dental Medicine, University of Zagreb

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて、取り外し可能な部分入れ歯(RPD)装着者の赤色複合細菌DNAを定量しました。本研究は、これらの細菌がインプラント周囲炎の発症に果たす役割を考慮し、将来のインプラント補綴治療戦略に新たなアプローチをもたらすことを約束しています。

要約

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口腔内に取り外し可能な部分入れ歯(RPD)を挿入することは、時間とともに口腔内の微生物群の変化と関連しています。しかし、これらの患者に赤色複合体細菌(RCB)の存在を調べる文献はほとんどありません。RCBが歯周炎、インプラント周囲炎、さまざまな全身疾患の発症に果たしていることを踏まえ、RPDがこれらの細菌に与える影響を調査することは極めて重要です。本研究は、RPDリハビリ中の部分無顎患者のRCB-Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia、Treponema denticola-in abeta identatment歯の歯肉下負荷をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて定量化することを目的としています。副次的な目的は、アバットメント歯および非アバウント歯の歯周状態を評価し、微生物負荷と臨床歯周指標との相関関係を明らかにすることでした。

RPDを必要とする参加者は30名に登録されました。デオキシリボ核酸(DNA)は、挿入前(T0)および挿入後3か月(T3)から得られたアバットメント歯から採取された細菌サンプルから分離されました。RCB定量はRT-PCRで行われ、「Lg(ゲノム同値/サンプル)」として発現されました。臨床指標(プラーク指数(PI)、歯肉指数(GI)、プロービング深さ(PD)、歯の可動度(TM)が両時点で基台歯および非歯の歯について記録されました。

アバットメント歯は、T0からT3までの3種すべてでRCB負荷が統計的に有意に増加しました: P. gingivalis (1.99 ± 2.01 対 3.64 ± 2.21、p = 0.00003)、 T. forsythia (2.20 ± 2.17 vs 3.56 ± 2.33、p = 0.00009)、 およびT. denticola (0.82 ± 1.41 対 2.35 ± 2.21、p = 0.0001)。治療後、アバトメント歯と非アバトメント歯で歯周指標が上昇したものの、統計的な有意な差には達しませんでした。病原体の中で、 トウジロギザ は歯周指標と最も強い正の相関を示しました。

RPDの短期使用は、アバットメント歯のRCB定着が有意に増加することと関連しており、臨床的に明らかな歯周病の崩壊に先行する早期の微生物および炎症の変化が示唆されています。

概要

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口腔内には動的なマイクロバイオームが存在し、その生態学的バランスは歯周の健康維持に不可欠です。この微生物の恒常性が内因性および外因性要因によって乱されると、微生物の恒常性が乱され、ポルフィロモナス・ギンジバルス、タンネラ・フォーシチア、トレポネマ・デンティコラなどの歯周病原体(総称して赤色複合体細菌(RCB)と呼ばれる病原性細菌の増殖に適した条件が生まれます2.これらの病原体は歯周炎およびインプラント周囲炎の病因に重要な役割を果たし、宿主の防御を回避し、炎症を促進し、歯周組織の破壊を促進し、しばしば歯の喪失を引き起こす3,4。歯の喪失は食事や話す能力に悪影響を及ぼし、自信や幸福感の低下に寄与し、その結果、義歯の補償の必要性を高めます。特に高齢者の間で、さまざまな局所的および一般的な病状により一般的に用いられる方法の一つが、取り外し可能な部分入れ歯(RPD)を用いた補歯治療です。しかし、時間が経つにつれてRPDs 5はさまざまな問題を引き起こす可能性があります。

強力な証拠は、RPDの使用が歯垢の蓄積や歯肉および歯周組織の炎症の発生を引き起こす可能性を示唆しており、特に6,7,8,9,10の橋台に関わる歯です。しかし、このような口腔障害の発生は、患者の口腔衛生への取り組みや入れ歯のケア・維持にも依存します。バッシらは研究の中で歯垢の制御の重要性を強調しました。彼らは6年から12年間RPDを装着していた患者を調査し、定期的な口腔衛生を行っている場合、橋台歯の歯周病状態が非牙台歯と類似していることを発見しました。対照的に、口腔衛生のフォローアップと維持を重視しない患者群では歯周病が悪化しました。

RPDの機能的利点にもかかわらず、口腔内に挿入されると唾液の自由な流れが妨げられ、義肢表面にペリクル層が形成され、細菌の定着につながる可能性があります。PRPD患者にはさまざまな種類の有害細菌が確認されています15。最近の研究では、Streptococcus mutans mutans16やStaphylococcus aureus17などの歯虫に関連する感染を引き起こす病原体レベルが、入れ歯装着後に有意に増加する可能性があることが示されています。口腔粘膜の状態を示す指標として機能するだけでなく、RPDの使用による細菌レベルの変化は、残存歯に歯病の発症を引き起こすこともあります18。したがって、患者がRPDの適切なメンテナンスを怠ると、義歯の基部の下に嫌気性の状態が生じ、病原性細菌の過剰増殖につながる可能性があります。特定の種類の歯周病原体は口咽門を通って一般血流に侵入し、さまざまな全身疾患の発症リスク要因となる可能性があります(19,20)。

しかし、RPD21,22,23,24の患者の橋台歯の歯肉溝における微生物学的変化に関する研究はまだ乏しいです。このテーマに関する数少ない研究の中で、BANA-ZymeTM検査や培養法など、歯周病原体検出のための従来の方法が用いられています。ほとんどの歯周病原体は兼性嫌気性菌であるため、このような方法の使用は培養に困難をもたらす可能性があります。なぜなら、この文脈では高還元強度の条件と酸素が有毒である条件が必要だからです。さらに、利用可能な歯科文献は、これらの病原体とこの視点における異なる歯周指標との関係について、まだ十分に解明されていません。

したがって、従来の微生物培養の限界を克服し診断精度を向上させるために、本研究ではリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて、RPD装着者の基座歯における赤色複合細菌(RCB)負荷を定量化しました。同時に、基盤付き歯と非支持性歯の両方の歯周状態を標準化された臨床指標を用いて評価しました。さらに、細菌負荷と歯周パラメータの相関を調査し、義肢使用と微生物の不安定な生態系との生物学的相互作用をより明確にしました。

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プロトコル

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本研究には、2021年9月から2022年3月までの間にコソボ大学歯科臨床センターの歯科補綴クリニックで補綴治療を受けた部分無歯突起の患者30名を対象としました。倫理的承認は機関審査委員会(承認番号378/19)から得られ、すべての手続きはヘルシンキ宣言の原則に則った。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが取得されました。

サンプル数は先行研究に基づいて決定されており、11人から30人の参加者だけで、RPD着用者の間で微生物および歯周のパラメータで有意な結果が得られることが示されています(21,23)。アルファレベル0.05の両側対t検定を仮定すると、28人のサンプルサイズでこの統計的に有意な差を検出するのに80%の検出力が得られると推定されました。中退の可能性を考慮し、30名の参加者を登録しました。さらに、3か月の追跡期間でこれらの患者に細菌量の増加が観察されました。

対象患者は義歯を初めて使用し、隣接する自然歯と拮抗性の両方を呈していました。除外基準には、プロービング深度>4mm、免疫不全状態(例:化学療法)、過去90日以内の抗生物質使用、重度喫煙(1日>25本)、RPD手技の理解を妨げる認知障害が含まれていました。

すべての参加者は、コバルト・クロム金属フレームとアクリル樹脂(ポリメチルメタクリレート)で製作された留め具式RPDを受け取りました。各RPDの設計は、無突起症の分類、残留リッジの質、生体力学的配慮に基づいてカスタマイズされました。

サンプル採取手順

サンプル採取は、T0からT3の時刻間の脱出可能部分義歯(RPD)の基台歯のみで行われました。参加者はまず、残った食べ物の残りを取り除くために水でしっかりうがいをするよう求められました。サンプル採取前に、選ばれた支持歯は綿巻で分離され、乾燥した作業環境を維持しました。2つの滅菌ペーパーポイント(番号35;04テーパード)が歯の頬面の内側および遠位の歯肉溝に挿入され、1分間そのまま放置されました。その後、ペーパーポイントは1.5mLの生理食塩水を含む無菌マイクロチューブに移され、指定された微生物学検査室へ運ばれました。サンプルはDNA分離プロセスまで-20°Cで保管されていました。

細菌DNAの製備と増幅:

RT-PCR26を用いてT. denticola、T. forsythia、P. gingivalisの同定にはパロドントスクリーンテスト(材料表)が用いられました。検査の内容は以下の通りです:DNA調製;特定の試薬を用いたリアルタイムPCR増幅(汎用細菌増幅用混合物、機会主義細菌増幅用混合物、ヒトゲノムDNA増幅用混合物);増幅結果の記録と解釈。

DNA抽出は、製造元のガイドラインに従い、最適なDNA品質を確保するためにDNA抽出キット(材料表)を使用して行われました。この検査はパラフィン封入PCR混合物を用いたリアルタイムPCR定性解析を使用します。この混合には、PCRランの妥当性を検証する内部コントロールと、抽出品質を評価し正確な増幅に必要な十分なDNAを確認するためのサンプル摂取コントロール(SIC)が含まれます。

PCR増幅は、タックポリメラーゼ溶液、パラフィン層下のマスターミックス、DNAサンプル、鉱物油などの試薬を用いた特殊なストリップとキャップを使用して行われました。PCRプログラムは以下の通りです:(i) 80°Cで30秒の初期変性、(ii) 94°Cで1分30秒の変性、(iii) 94°Cで30秒5サイクル(変性)、64°Cで15秒(プライマー結合と伸長、蛍光検出)、(iv) 94°Cで10秒45サイクル(変性) 64°Cで15秒(プライマー結合と伸長、蛍光検出)、(v)94°Cで5秒(最終変性)。

蛍光検出はFamおよびHex検出チャネルで行われましたが、マーカーを含んだ管No5(蛍光はFamおよびRoxチャネルで検出)のみ行われました。増幅プロセスはリアルタイムの熱サイクラー(材料表)を用いて実施されました。機器用のソフトウェアRealTime(バージョン7.9)は、PCR増幅データの自動登録、解釈、定量解析に使用され、正確な病原体負荷推定が可能となりました。

微生物負荷は「Lg(ゲノム当量/サンプル)」として表されていました。結果は、各患者のパロドントスクリーニング検査報告書で、細菌負荷レベルに基づいて以下の3つの範囲で示されました: P. gingivalis (正常<5.0;中等度≥5.0;重度>6.0); トロンギシア (正常<5.0;中等度≥5.0;重度>5.5);および T. denticola (正常 <3.5;中等度≥3.5;重症>5.0)。

臨床検査

臨床検査では、T0およびT3における牙台と非牙台歯の歯周状態の詳細な検査が含まれていました。プラーク指数(PI)はSilness-Loe基準(0-3)27に従って歯科プローブを用いて評価されました。歯肉の状態は歯面の6箇所で歯肉指数(GI)を用いて以下の基準で評価されました:0、炎症なし;1、軽度の炎症;2、プロービング中の歯肉出血を伴う炎症;3、重度の炎症と自発性歯肉出血の可能性28.

ウィリアムズプローブを用いて、歯肉縁から臨床ポケット深さ29の端までプロービング深さ(PD)を測定しました。歯の可動性(TM)は、ミラーの基準30に従い、水平方向および垂直方向の両手触診によって決定されました。

すべての研究参加者は臨床検査前に十分な非外科的歯周治療を受けており、超音波スケーリングを用いた歯垢および歯石の除去が含まれていました。被験者には歯磨きや入れ歯の洗浄などの口腔衛生手順や、夜間の入れ歯除去に関するアドバイスも指導されました。

統計解析

データはMicrosoft ExcelおよびIBM SPSS Statistics for Windowsを用いて分析されました。年齢、微生物負荷、歯周病指標(PI、GI、PD、TMを含む)について記述的統計(平均、標準偏差、範囲)を算出しました。挿入前(T0)から挿入後3か月(T3)までの臨床および微生物学的パラメータの変化は、非パラメータデータのペアに対してWilcoxon署名順位検定を用いて評価しました。フィッシャーの厳密検定(モンテカルロシミュレーション、両側)は微生物負荷分類に関連するカテゴリ別データを評価するために用いられました。スピアマンのランク相関係数(ρ)を用いて微生物負荷と歯周パラメータの関連性を評価しました。p値は0.05で<統計的に有意とされました。

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結果

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参加者の人口統計

表1は 人口統計パラメータの分布を示しています。30名の参加者のうち、男性16名(53.3%)、女性14名(46.7%)でした。参加者の平均年齢は64.6歳で、48歳から76歳の範囲でした。社会人口統計に関する追加情報は 表1に記載されています。

臨床検査

表2は 歯周指標から得られた結果を示しています。アバットメント歯では、TMを除くほぼすべての指標がRPD挿入後3か月後に有意に高かった。一方、非支持面歯ではPIおよびGI値が有意に高いことが判明したが、TMおよびPDでは有意な差は認められなかった。

アバットメント歯と非アバトメント歯の歯周指標の違い

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ディスカッション

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免疫反応の低下や、留め具(RPD)などの義肢装置による機械的制約により、最適な口腔衛生を維持することは年齢とともにますます難しくなります。これらの条件は、特に基座歯周辺の病原性バイオフィルムの蓄積を促進します。歯台歯は重要な荷重支え構造として機能しますが、歯周病の劣化にも脆弱です。本研究は、赤色複合菌(RCB)負荷を定量化し、高齢者におけるRPD挿入後3か月間の歯周変化を評価することでこれらの懸念に対処しようとしました。これまでの研究では、PI、GI、PDなどの指標を用いてRPDが歯周病の健康に与える臨床的影響を評価してきましたが、特にRT-PCRの感度や特異性と並行して微生物プロファイルを調査した研究はほとんどありません。この二本柱のアプローチは、長期的な支持膜周囲炎症や義肢関連合併症の素因となる可能性のある亜臨床的な微生物シフトを特定します。しかし、微生物の増加は将来の劣化の初期バイオマーカーとなる可能性があり、これらは臨床疾患に先立つ可能性のある亜臨床的な変化です。

私たちの調査結果によると、全体としてRPD...

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開示事項

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著者には利益相反を主張するものはありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
安全ロック付き1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブバイオテックMT1.5/100
デンタルピンセットバーダー17/4021-1
DTprimeリアルタイムサーマルサイクラーDNA技術リアルタイム熱サイクラー
IBM SPSS IBMコーポレーションバージョン21.0 
Microsoft Excel Microsoft Office 2010
ペーパーポイント(番号35;04テーパード)ディアデントMP210-602
ParodontoScreen リアルタイムPCR検出キットDNA技術R1-P808-S3/5EU
歯周プローブメデシー548/9PT
プレップ・グラウンドプラスDNA技術P-003/2EUDNA抽出キット 
リアルタイムソフトウェアDNA技術バージョン7.9
塩化ナトリウム 0.9%バイオーザー

参考文献

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