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土壌有機物分解速度の温度応答:温度勾配ブロックの構築と応用

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DOI：

10.3791/69785

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2026年1月30日

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1Soil Biology Group, Wageningen University & Research, 2Soil Chemistry Group, Wageningen University & Research, 3Wageningen Technical Solutions, Wageningen University & Research, 4School of Science, University of Waikato

この記事について

サマリー

温度勾配ブロックを紹介し、その構造と利用方法を詳しく説明します。このブロックは22段階の離散温度を提供し、0°Cから90°Cまでのユーザー定義範囲に線形分布しています。 このセットアップから収集されたデータは、土壌有機物分解速度の温度応答に関する新しい理論の検証と開発を可能にします。

要約

土壌は地球最大の炭素(C)貯蔵庫であり、大気のほぼ2倍の炭素を保持しています。気候変動による気温上昇は土壌有機物(SOM)分解を促進し、二酸化炭素(CO2)を大気中に放出し、気候変動への正のフィードバックをもたらす可能性があります。ここで疑問が生じます:SOM分解速度の短期的な温度変化への応答をどのように定義できるのか?このデータを活用して、地球システムモデルの気候予測に機械的に定義された方程式を適合させることは可能でしょうか?これまでの研究の多くは、異なる離散温度での実験室土壌インキュベーションに焦点を当てています。しかし、これは詳細な温度応答曲線にはつながりません。これは、高分子速度理論(MMRT)など、最新の発展によって導入された新しい仮説を検証するために必要とされるものです。本論文では、以前の研究から改良・改良された温度勾配ブロックを紹介し、その構築過程を詳細に説明し、その利用方法について詳しく説明します。温度勾配ブロックはアルミニウム製のブロックで、4列に22個の離散穴があり、88マイクロコスム(60mLバイアル)を同時に培養できます。ブロックは一端で冷却され、もう一端で加熱されるため、線形の温度分布が形成されます。0°Cから90°Cの範囲内でユーザー定義範囲内の22の離散的な温度点を提供します。 3.5時間の培養後、88のミクロコスムそれぞれからCO2 生成が測定されます。結果は、このブロックがユーザー定義の温度勾配を生成し、SOM分解の温度応答曲線の構築を容易にすることを示しています。さらに、このセットアップから収集されたデータは、温度変化がSOM分解速度に与える影響に関する新たな仮説や理論の検証・開発にも活用できます。この分野は気候変動の文脈でますます重要になっています。

概要

大気中の二酸化炭素(CO2)濃度が上昇すると、地球1の気温が上昇します。この現象は1856年にユーニス・フート2によって初めて報告され、彼女はシンプルながら画期的な実験を行いました。彼女は1本のシリンダーに外気を、もう1本にCO2を入れ、両方の温度を記録しました。結果は明確で、CO2濃度が高いシリンダーはより高い温度を示し、大気中のCO21増加による温暖化効果を示しました。この観察は気候変動に大きな影響を与えます。現在、フートの初期の知見は現代の気候科学に引き続き役立っており、CO2濃度の上昇が地球温暖化やさまざまな生態系に与える影響の研究を導いています。

土壌は1メートル目の大気のほぼ2倍の炭素(C)を蓄えており、地球規模のCサイクル3で重要な役割を果たしています。土壌Cのストックに影響を与える重要なプロセスは土壌有機物(SOM)分解であり、これはCが大気中に放出される速度を決定します4,5。気候変動による年間平均気温の上昇は、土壌有機物(SOM)の分解を促進し、CO2の大気中放出を加速させる可能性があります。これは気候変動に対する正のフィードバックメカニズムを示しており、特に高温が光合成のC入力を刺激するよりもSOM分解によるC損失を加速させる場合に顕著です6。このテーマに関する広範な研究にもかかわらず、いわゆる土地・炭素・気候フィードバックの大きさと方向性は依然として広く議論されています。この不確実性は主にSOM分解速度の温度応答に関する基本的な知識のギャップに起因しています。これらのギャップに対処することは、地球システムモデルの洗練とSOM分解速度の温度応答の理論的根拠に基づく表現を取り入れるために不可欠です。

SOM分解速度の温度応答は、一般的にQ10値とアレニウス方程式で表されます。Q10値は、温度が10°C上昇したときに速度を掛ける係数として定義されます。 妥当性12、13、14、15に異議が唱えられるものの、Q10は異なる処理や土壌の温度応答を比較する際のデフォルト手法となっています。アレニウス理論は、SOM分解のようなプロセス速度が温度16の上昇とともに指数関数的に増加することを示唆しています。しかし、実際の酵素活性は単一の形態をたどり、熱最適状態が明確で、高温17,18,19で低下します。アレニウスベースの方程式は、熱最適条件6を超えた酵素の変性を示唆することでこの低下を説明しようとします。しかし、酵素の変性は土壌中に一般的に見られる温度よりも高温で起こり、酵素は変性が起こる前に熱最適状態に達することを示しています19,20。さらに、変性による呼吸率の崩壊を説明するためにアレニウス方程式に第二の関数を追加するだけでは、呼吸変化率が最大となる変折点温度(21,22)の推定はできません。したがって、アレニウスに基づく方程式は、土壌で一般的に観察される温度範囲内でSOM分解速度の全体的な温度応答の形状が一般的に測定されていることを十分に捉えきれていません。

アレニウス理論の限界に対処するため、生物学的プロセスの温度感受性を表す複数の方程式が開発されました。しかし、生物学的理論に根ざしたり、土壌に適用されたものはほとんどありません。生物学的アプローチの中で、高分子速度理論(MMRT)は、酵素26のような生体高分子の熱力学的性質を取り入れることで、アレニウス方程式の限界の一部を克服しています。同様に、酵素支援アレニウス理論(EAAR)は、酵素が反応の活性化エネルギーを低下させる上で温度依存的役割を説明しています。両方程式は土壌および微生物の生化学反応の温度応答の研究に成功裏に適用されています。これらの方程式は、SOM分解の温度応答やその基礎となる反応ステップに関する貴重なメカニズム的洞察を提供します。しかし、その広範な採用やパラメータ化は実験的な課題によってしばしば妨げられています。

フィールド研究と実験室の両方に、SOM分解速度の温度応答を理解する上で利点と限界があります。現地実験はSOM分解速度の長期的な温度応答に関する貴重な洞察を提供します。しかし、現場でのCO2フラックス測定の解釈は、自己栄養呼吸、湿度変動、基質アクセス性(29,30,31,32,33)などの交絡変数のため困難です。これらの相互作用は現実世界のプロセスを定量化するために不可欠ですが、これらの研究は一般的に短期的なメカニズム的プロセスの測定よりも長期的な生態系の反応に焦点を当てています。短期温度応答を理解することは、MMRTやEAARのような最近の理論で定義された方程式のパラメータ化に不可欠であり、そのためには実験室での研究が重要です。多くの実験室では、培養期間や温度処理に加わる基質枯渇の交絡効果が一般的です。さらに、ほとんどの実験室実験では温度処理が限られている37,38,39,40のみが使われているため、より高度な方程式ではなく単純な指数関数式のフィッティングやQ10比の計算が行われ、より高度な方程式はより多くの離散温度で測定する速度を必要とします41.これらの課題に対処するためには、より広い温度範囲にわたるSOM分解速度の正確な測定を可能にする新たな実験的手法の開発が不可欠であり、これにより温度反応に関するSOM分解理論の厳密な検証と発展を支えることが不可欠です。

本論文では、温度勾配ブロックの構築と利用について説明し、これは現在の実験的限界に対処するだけでなく、SOM分解が温度に短時間で応答する最先端の研究も提供します。ここで提示される設計は、Thomasら(1963)42 によって最初に開発され、その後Robinsonら(2017)41によって修正された方法論を応用したものです。主な違いは、1) 冷却システムの改良、2) ブロックをCO2 分析装置と連結してCO2 濃度を直接測定することで動作時間を短縮したこと、3) 実験中にバイアルを運搬する必要が不要になったことが含まれます。以前の報告21、41、43 は温度ブロックの広範な説明を提供していましたが、詳細な設計、施工方法、試験は最小限であり、他の研究者がこの手法を活用することは制限されていました。ここでは設計と施工の詳細を詳細に示し、複数の試験結果を提示して、異なる土壌サンプルに対するセットアップの適切な機能性を示します。

プロトコル

ここでは、温度勾配ブロックの詳細な構造と詳細な利用方法を紹介します。すべての材料とその仕様は補 足表1 および 材料表で確認できます。温度勾配ブロックの建設および組み立て費用は、ガス分析装置の費用を除いて約€20,000でした。この温度勾配ブロックはユーニス・フートにちなんで「ユーニス」と名付けられています。

1. 温度勾配ブロックの構成

  1. 温度勾配ブロックのボディ設計については 図1 を参照してください。
  2. アルミニウムブロックの構築
    1. 生のアルミニウムブロックを汎用フライス盤に配置し固定します。各穴の測定値と位置を機械のソフトウェアに入力します。 図2 はセットアップのための各穴の位置と直径を示しています。
    2. 加熱棒用の穴を開けてください。ブロックの一端に直径16mm、深さ133mmの穴を2つ開けます。これらの穴の中心は上端から25mm、側面から36.25mmの位置に位置します(図2)。
    3. 冷却剤用のキャッスルパターンを作成します。ブロックの反対側の端には、長さ180mmのキャッスルパターンをドリルで開けます(図3A)。キャッスルパターンの厚さは16mm、奥行きは140mmであることを確認しましょう。城のパターン内に直径10mm、深さ140mmの穴を12個追加で掘ります。これらの穴の正確な位置と分布については 図3B を参照してください。
      注:キャッスルパターンは冷却剤とブロックの接触を増やすために作られており、12の穴は溢れを防ぐ役割を果たしています。
    4. キャッスルパターン用のガスケットを作りましょう。冷却剤をブロック内に閉じ込めるためにアルミガスケットを切り取り、キャッスルパターンの上に置きます。これは冷却剤の漏れを防ぐために使われます。
    5. クーラー接続用の穴を開けてください。ブロックの前後に直径15mmの穴を開けてクーラー接続部を設置します(図4)。穴の中心を75mmの深さに位置させます。前面の穴は端から18mm、裏側の穴は端から162mm離れていることを確認してください。この2つの穴が城のパターンの始まりと終わりをつなぐことを確認してください。
    6. 温度センサー用の穴を開けてください。直径3mm、深さ150mmの穴を8個掘ります。これらのセンサーはブロックの中央に位置し、長さに沿って均等に配置されています。最初のセンサー穴の中心が端から940mm、最後のセンサー穴が端から205mm離れていることを確認しましょう。
    7. 60mLのバイアル用の穴を開けてください。直径28mm、高さ144mmの穴を88個作ります。これらの穴はブロック全体に均等に分布しています。最初と最後のバイアル穴の中心は、最初と最後のセンサー穴の中心と一致します。
  3. 断熱材の準備
    注:断熱材は厚さ40mmのポリイソシアヌレート製です。
    1. 丸ノコギリを使って断熱材を台形に135°の角度で切ります。アルミブロックの4つの長い辺を覆うために、断熱材を1080mm×230mmの長方形に切り出します。この長方形の四辺をそれぞれ135°の角度で切り、ブロックにぴったり合うようにします。そのうちの1面はブロックの蓋に接着されます。ブロックの蓋の断熱材を保護するためにアルミテープを使いましょう。
    2. ブロックの短い両辺については、断熱材を230mm×230mmの正方形にカットします。再び、正方形の各辺を135°の角度で切り、適切なフィット感を確保します。
  4. 冷却システムの接続(図5)
    注:この構成で使用されている冷却システムはコンパクトで省エネです。この冷却システムは、最大-30°Cまでの冷却能力を持つ自然冷却剤を循環させることで動作します。
    1. 膝継ぎとホースバーブをブロックに取り付けます(図5C)。次に、冷却剤をクーラーに導くホースを接続します。
    2. ホース全体を覆うために柔軟な断熱材で覆いましょう。これにより冷却剤は望ましい温度に保たれます。柔軟な断熱材を切断し、ホースにしっかりとフィットさせ、接着シーラントで断熱材を固定します。
  5. ヒーターロッドとセンサーをブロックに挿入して、適合を確認する(図5D)。
  6. 上記のステップの概要については 図5 を参照してください。

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図1:本体設計と温度勾配ブロックの一部。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2:複数の用途で使用される穴の位置と直径を示す温度勾配ブロック。 「S」はセンサーを示します。寸法はミリメートル(mm)で表されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3:冷却剤に使用されるキャッスルパターンの設計と測定。 (A) キャッスルパターンの厚さ、長さ、直径の測定、および (B) 溢れ防止のために使用された12個の穴の距離と位置。寸法はミリメートル(mm)で表されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図4:温度勾配ブロックの側面図で、各穴の深さと冷却器接続の位置を示しています。 「S」はセンサーを示します。寸法はミリメートル(mm)で表されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図5:温度勾配ブロックの構成概要。 (A) 60 mLバイアルを設置するための穴を開けること;(B) アルミニウムブロックを覆う断熱材の製作;(C) 冷却剤の接続および筐体;(D) 加熱棒とセンサーをブロックに挿入すること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

2. ステンレス製ハウジングの製作。

  1. 長辺のステンレススチールを1080mm x 230mm x 230mmの寸法でカットしました。短辺の場合は、230mm×230mmの寸法でステンレスをカットします。冷却ホース、センサー、ヒーター、ハンドル用の穴を必ず開けてください。
    注:長辺の一つはブロックの蓋として使われています。
  2. ハンドル、蓋のヒンジ、そしてステンレス製のハウジングへの閉鎖部を熱で接続します。

3. 電子ユニットの建設

注意:電子ユニットの製作は資格を持つ電気技師のみが行えます。ここで示すプロトコルは、オランダおよびEUの法律に従って開発されました。以下は使用される主な部品の概要です。詳細な配線手順は 補足ファイル1に記載されています。

  1. 電子図(図6)を設計します。
  2. 接続ボックスを取り付けてください。
    注意:接続箱は外部の物体や損傷から電気部品や接続を保護するために設置されています。
    1. 取り付けネジを使って3つのジャンクションボックスをステンレス製のハウジングにしっかりと取り付けます。
    2. ケーブルの入口を用意しました。メインの接続箱にはケーブルグランド用の穴を6つ開けてください。2つの小さなボックスには、ケーブルグランド用の穴を2つ開けてください。一方のボックスには2ウェイスイッチ、もう一方にはヒーターロッドケーブルの接続が入ります。
      注意:2ウェイスイッチはユニットのオン・オフに使われ、ミニ回路ブレーカーへの電力供給を行っています。
    3. メインの接続ボックスには、緑色のLED用に上部に穴を開けてください。
      注意:このLEDランプはユニットがオンになっていること、そしてすべての部品に電力が供給されていることを示します。
    4. DINレールを切断してメインの接続ボックスに取り付けます。次に、DINレールを固定するネジを取り付けるための穴を3つ開けます。DINレールをメインの接続ボックスに取り付けてください。
      注:DINレールは電気部品の取り付けを容易にするために使われます。できればメインの接続ボックスのほぼ中央に設置してください。
  3. 電気部品の設置。
    注意: 図7 を参考にして、各電気部品を取り付けてください。
    1. 2ウェイスイッチの接続ボックスを見つけてください。スイッチの上半分を外して、カバープレートを通して送る部分を探してください。スイッチ接続ボックスのカバープレートに穴を開けて、スイッチをしっかりと取り付けてカバープレートに取り付ける必要があります。スイッチの取り付け説明書を使いましょう。
    2. メイン接続箱内で、PE/GND端子をDINレール上に設置します。次に、ミニチュア回路ブレーカー(MCB)をDINレールに設置します。
      注:PE/GND端子はエンドトップとして使用されます。MCBは小型の回路ブレーカーであり、故障や短絡が発生した場合の主要な安全ブレーカーです。MCBがオンになると、AC/DC電源に電力が供給されます。
    3. DINレールに2つのトリプルフィードスルー端子を設置します。給電端子の上下に2つの端子ダブルブリッジ端子を接続します。
      注意:2本以上の線を接続するにはフィードスルー端子を使用し、複数のフィードスルー端子を接続するにはブリッジを活用してください。フェルールコネクターを使用して、安全で信頼性の高い接続を確保しましょう。
    4. 写真のように直流電源をDINレールに置きます。
      注:この研究では24V、2.5Aの交流直流電源を使用しました。この電源は交流電源を利用し、他の部品の入力電力要件に応じて24VDCに変換します。
    5. 写真のようにDINレールにサーモスタットを設置します。ケーブル接続モジュール( 図7の緑)を失わないように注意してください。
      注意:温度の制御と監視にはサーモスタットが使用されました。これはウェブブラウザベースのソフトウェアシステムで、ユニットのIPアドレスがログインして加熱棒の温度を設定し、データを記録する必要があります。これはキャンパス内のどのコンピューターからでも接続できるように、ローカルエリアネットワーク(LAN)に接続されていました。
    6. 写真のようにDINレールに7つのトリプルフィードスルー端子を設置します。3つの五重橋を使い、最初の5つのフィードスルーを上部、中部、下部のフィードスルー端子でつなげます。
    7. 上部と下部のフィードスルーをつなぐために、2つの5重橋を使います。
    8. 写真のようにDINレールにヒューズホルダーを1つ取り付けます。
      注:ショートや電力サージ時にユニットの部品を損傷から保護するために630 mAヒューズが使用されました。
    9. 写真のようにDINレールに2つの単端子接続ユニットを設置します。
    10. 写真のように、ソリッドステートリレーをDINレールに設置します。
      注意:ソリッドステートリレーはヒーターのオン・オフに使用されます。
    11. エンドストップとしてPE/GND端子を1つ設置します。
  4. 電気ワイヤー接続手順については補 足図1を参照してください。
  5. 電子ユニットの概要については 図7を参照してください。

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図6:電子ユニットの図。 配線の色は以下の通りです:茶色=電圧交流(VAC)線、青=VAC中性線、緑と黄色=GND(接地/アース)、赤=電圧直流(VDC)正、黒=VDC負。データワイヤーは白色ですが、識別しやすいため、この図では緑色で示されています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図7:温度勾配ブロックに接続された電子ユニットのメインジャンクションボックス。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

4. 温度勾配ブロックの組み立て

  1. 断熱材をステンレス製のハウジングに接着するために、接着シーラントを使いましょう。一晩乾かします。
  2. センサーと加熱棒をアルミブロックの中に差し込みます。
  3. アルミニウムブロックをステンレス製の筐体内に収め、ケーブルをそれぞれの穴を通して電子ユニットに接続します。
  4. ヒンジを使って断熱されたステンレス製の蓋をブロックに取り付けます。
  5. 冷却システムをアルミブロックに取り付けてください。
  6. 温度勾配ブロックを実験室に設置し、すべての接続が確実かつ機能していることを確認します(図8A)。実験室には少なくとも2mの頑丈なテーブルを設置してください。イーサネットや電気接続へのアクセスがあるか確認してください。最適な動作のためには、制御された周囲温度が望まれます。

5. フラッシュシステムの構築

注:洗浄ラインは、培養開始時に各バイアルのCO2 濃度を標準化するために設計されました。温度勾配ブロックを用いたフラッシュシステムを可視化するには 図8B を参照してください。

  1. 直径の小さい柔軟なチューブを10個に切り、それぞれの長さは15cmです。10本の小さな管の端に針をつなぎます。
  2. 直径の大きいチューブを1mの長さの一つのピースに切り分けます。このチューブの一端にストッパーを置き、もう一端を実験室の空気導体に接続します。
  3. 大きな管の長さに沿って5cm間隔で測定し、印をつけます。各区間ごとに、小さな管の一つに接続された針を挿入します。

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図8:温度勾配ブロック。 (A) 蓋を閉じた状態で実験室に設置した温度勾配ブロック、(B) フラッシュシステムを表示した状態で開いた状態。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

6. ガスアナライザー注入ユニットの説明

注:このセットアップのガス分析装置は、60mLガラスバイアル内のCO2 濃度を直接測定することが可能です。このガス分析装置の温度範囲は0ppmから10000ppmの範囲で、400ppm時の精度は0.04ppmです。ガスアナライザーには流量削減キットが付属しており、1.17 mL/sの速度で測定されます。

  1. ガスアナライザーの注入チューブを外部に0.45μmフィルターと注入針を追加して改造します(図9)。
    注:0.45μmフィルターは、ガス分析装置への水の侵入を防ぐための追加措置として追加されました。針のサイズは18G、寸法は1.2 mm x 25 mmです。針は直径に基づいて選ばれ、60mLガラスバイアルのゴム隔膜への損傷を最小限に抑えました。
  2. ガス分析装置の注入管を機器の接続入口に接続します。
  3. インジェクションチューブの端にオスのルアーロックコネクターを取り付けます。内径1/4の柔軟なチューブを使い、ルアーロックを注入チューブに固定します。その後、柔軟な管を使って0.45μmフィルターを取り付けて気密性を保ちます。
  4. 0.45μmフィルターのネジ端では、オスとメスのコネクターを使って針をしっかりと固定します。

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図9:ガスアナライザー注入ユニット。 (A) ガス分析装置の注入管。(B) 外部0.45μmフィルターと注入針。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

7. 潜伏処理の設計

  1. 土壌サンプルを選びましょう。
    注:本稿で選ばれた土壌サンプルは、プロトコルの機能性を示し、このセットアップで収集可能なデータの種類を示しています。
  2. ブロックインキュベーションの温度範囲を0°Cから90°Cまでユーザーが定義した範囲を選択します。
    注:この原稿の温度範囲は4°Cから60°Cでした。 この範囲を超えて使用する場合は、高温や氷点下の温度を取り扱う際には実験室の安全プロトコルを遵守してください。
  3. サンプルのランダム化を計画しましょう。
    注:本稿では、サンプルは温度ブロック(位置A-D)内でランダム化されました。本研究は当初、インキュベーション後のサンプル読み取りをランダム化したものの、読み取り過程でラベル付けの誤差が生じました。したがって、一貫した測定順序(すなわち高温から低温への順)が優先されました。

8. 前培養のためのサンプル準備

注:土壌微生物群集の変化を抑えるために、土壌サンプルはできればサンプリング後できるだけ早く新鮮な状態で培養されるべきです。しかし、実験上の制約や物流によっては、培養前に輸送や保管のために土壌サンプルを自然乾燥させる必要がある場合があります。この原稿では、培養前のサンプル処理のための自然乾燥手順が標準化されました。

  1. 新しい土は2mmのふるいでふるいにかけます。ふるいにかけた土を40°Cで24時間乾燥させます。この空気乾燥土壌は、さらなる加工まで保存できます。
  2. 土壌サンプルを金属製の缶に入れてよく混ぜます。混合土を22個のラベル付き60 mLガラスバイアルに分散します。計量用紙を使って、60mLのバイアルごとに3±0.03gの土を加えます。
  3. ピペットを使い、漏斗法に基づいて土壌を望む保水能力(WHC)に調整します。水分含有量を目標%WHCに調整した後、各バイアルの正確な重量を記録します。
    注:本稿で選ばれた土壌サンプルはWHCを60%に調整しています。
  4. バイアルのキャップは綿で覆い、空気交換を促します。
  5. サンプルは20°Cの温度管理された実験室で10日間プレキュベートします。

9. 抱卵前のWHC調整

  1. 7日間のプレインキュベーション後、バイアルの重量を記録し、目標WHCに合わせて調整します。ピペットを使って正確に使い、必要に応じて水を加えてください。各バイアルに加える水を式 1で計算します。
    加える水 = 重量T0 (g) - 重量T7 (g) (1)
    ここで 、重量T0は時刻ゼロ時のバイアルの重さを表し、 重量T7 は7日経過後のバイアルの重量を表します。

10. 温度勾配ブロックの初期化

注:冷却システムは計器前面のパネルで制御されます。暖房システムは、計器の背後にあるスイッチとオンラインインターフェースで制御されます。

  1. メーカーの指示に従って冷却システムをオンにしてください。電源ボタンを一度押してください(項目A、 補足図2)。温度°Cと回転数の数値が点滅し、 OFFのメッセージが表示されるようにしてください。これはシステムがオンですが現在は非アクティブであることを示しています。
  2. ポンプを起動するには OK/ポンプ ボタン(項目E、 補足図2)を押し、 + または - ボタン(項目GとF、 補足図2)を押して回転数を3500に設定します。冷却システムを作動する前に、液体レベルが緑色のランプになっているか確認してください(項目L、 補足図2)。液体レベルが赤色の場合は、冷却剤が不足していることを意味します。ラボマネージャーに連絡するか、メーカーの取扱説明書を参照してください。
  3. 冷却システムを起動するには 、温度( 項目B、 図S2)を押し、 + または - ボタン(項目DおよびC、 補足図2)を押して温度°Cを-1.6°Cに設定します。 設定点(項目O、 補足図2)は点滅しているはずです。これは冷却システムがまだ設定ポイントに達していないことを示しています。
    注意:冷却システムの設定温度はブロック内の温度とは異なります。
  4. ブロックの後ろのスイッチを ON に入れてください(補足図3参照)。緑色のランプが点灯していることを確認してください。これは暖房システムがオンで温度制御が作動していないことを示します。
  5. 暖房システムの温度制御を起動するには、ブラウザでIPアドレス10.75.117.227を入力して温度勾配ブロックのオンラインインターフェースを開きます。提供されたユーザー名とパスワードでログインすると、各センサーの温度を確認できます(補足図4参照)。このインターフェースはセンサーの値を示し、3秒ごとに更新されます。
  6. 設定温度を60.00°Cに調整するには、上下矢印を押してください。ONボタンを押して暖房システムを起動してください。
    注:ブロックが安定した線形温度勾配に達するまでには約1時間かかります。
  7. ブロックをオンにしてから10分後に、ヒーターの制御装置が正常に動作しているか確認してください。センサーごとに温度が異なる場合、機器は動作しています。

11. ガス分析装置の設置

  1. メーカーの取扱説明書に従い、電源ボタンを一度押してガス分析装置を起動します。楽器が温まるまで45分待ちます。
  2. PCをガス分析装置のWi-Fiネットワークに接続し、固有のホスト名(TG15-XXXXX)で識別され、パスワードで接続します。
  3. ウェブブラウザでホスト名またはIPアドレスを入力し、 エンター キーを押して接続します。次に、設定セクションを開き、 流量を減らす選択をします。すでにオプションが選択されている場合は、ソフトウェア内で何も変更しないでください。

12. サンプルの積み込み準備

  1. インキュベーション開始の1時間前にプロトコルの第6節に従ってWHCを調整してください。
  2. サンプルをブロックに入れる10分前に、加熱器の制御装置を確認して、所定の温度に達しているか確認してください。
  3. ラボにある環境導体をオンにしてください。
  4. フラッシュシステムを接続し、ガスアナライザーをコンピューターに接続してください。

13. 空欄を回収する

  1. 次の2つの手順に従って空欄を記録します:
  2. フラッシュラインをガス分析装置の注入システムに接続し、フラッシュラインのCO2 (ppm単位)を直接記録します。
  3. 空のホルダーに60mLのガラスバイアルを5本入れます。各バイアルごとに1本のフラッシュラインを設置します。1分後にフラッシュラインを取り出し、バイアルのキャップを閉めます。バイアル内のCO2 を測定する前に4時間待ちます。

14. 温度勾配ブロックへの試料のロード

注意:ブロック内にはブロック位置A、B、C、Dがあります。同じサンプルをブロックの同じブロック位置に配置します(図10)。例えば、サンプル番号175はブロック位置Aに1から22に、サンプル番号45はブロック位置Bに1から22まで配置されます。

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図10:ブロック内のバイアルの位置。 「S」はセンサーを示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

  1. ブロックを開け、コンピュータとフラッシュシステムをブロックの蓋の上に置きます(図11)。可動式テーブルの上にサンプルを入れた箱を置きます。
    注意:サンプル内のCO2 変動を最小限に抑えるためにKN95マスクを着用してください。これによりCO2 が呼吸でバイアルを汚染するのを防ぎます。
  2. 各バイアルの閉鎖時間(1時間:分)を記録するスプレッドシートを作成し、同時にガスアナライザーの時間を可視化します。
    注:各バイアルの閉鎖時間はデータ処理中のレート正規化に使用されます。
  3. 温度勾配ブロック内のサンプルの読み込みを開始してください。8サンプルずつのバッチで作業します。キャップのないサンプルをブロックの中に入れ、冷たい側から始めます。つまり、最初の8つのサンプルはA1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2です。
  4. フラッシュラインを8本のバイアルに入れて1分待ちます。洗浄ラインを外してすぐにバイアルを閉じてください。スプレッドシートに、各バイアルがキャップされた正確な時刻を記録します。
    注意:洗浄ラインを各バイアルに慎重に挿入し、土壌に触れないように注意してください。これにより交差汚染を防ぎ、サンプルの完全性を維持するのに役立ちます。
  5. 最初の8本のバイアルがフラッシュされている間に、次のサンプルを温度勾配ブロックに詰めます。例えば、フラッシュサンプルは以下の通りです:A1、B1、C1、D1、A2、B2、C2、D2です。次に追加されるサンプルのロットは、A3、B3、C3、D3、A4、B4、C4、D4です。
  6. 次のサンプルのバッチにフラッシュラインを入れます。
  7. これらの手順をブロックが完全に積み込むまで繰り返します。
  8. ブロックを閉じて、最後のサンプルが閉じられた瞬間から3.5時間待ちます。
  9. ガスアナライザーを スリープモードに設定し、3秒以内に電源ボタンを2回押します。
  10. 壁にある赤いバルブを使ってフラッシュシステムを オフ にしてください。

figure-protocol-11
図11:荷重温度勾配ブロックのセットアップ。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

15.CO2 測定から始める

  1. CO2測定を始める1時間前に電源ボタンを押してスリープモードからガス分析器を解除してください。セクション8に示されているアナライザーの設定を確認してください。
  2. フラッシュシステムをONにし、ガスアナライザーを可動テーブル(図12)に置きます。
    注意:可動テーブルはガス分析装置の注入システムがすべてのサンプルに届く高さでなければなりません。
  3. ガス分析装置の診断セクション(補足図5)を確認してください。機器の状態がすべての部品で緑色であることを確認しましょう。ここには二つの可能性があります。
    1. すべて正常なら分析を開始します。
    2. 赤色または黄色の部品がある場合は、ガス分析装置の取扱説明書を確認し、必要に応じて技術的な助けを求めてください。誤差が修正されれば、CO2 の測定を進めます。誤差が修正されなければ、実験を中止します。
  4. ガスアナライザーのグラフセクションを開くと、リアルタイムの測定値を可視化できます。機器は常に空気中のCO2 を測定していることを覚えておいてください。
    注:測定表示は~3〜5秒遅れます。
  5. 3.5時間の潜伏後、サンプルの測定を開始します。まずは高温から始めましょう。例えば、最初に読み取るサンプルはA22、B22、C22、D22です。
    注意:<15°Cの温度で試料を測定する際はKN95マスクを着用してください。 これによりデータのノイズが減少します。
  6. アナライザーの注入針を試料間のフラッシュラインに接続します。これによりデータのクリーニングがより容易になります。
  7. 画面上部にはガス分析ソフトの REMARK 機能があります。サンプルを測定するたびに、 ユニーク で シンプルな 注釈を作成しましょう。各サンプルを実行する前に REMARK を押すのを忘れないでください。
    注意:サンプルの一意番号または一意IDを注釈として使用してください。REMARKに誤りがあれば、サンプルが測定された時間を記録してください。例えば、遅延注射やREMARKの終了が早いか遅いかなどをメモしておくと良いでしょう。
  8. 針を60mLのサンプルバイアルに20秒間挿入します。数秒が経ったら、針をバイアルから取り出します。
    注意:針が60mLのバイアル内に38秒以上放置されると、ガス分析装置の圧力に問題が生じます。ガス分析装置は数分間動作を停止し、圧力が再び安定するまでこの方法を避けるべきです。
  9. ガス分析装置でサンプルと5つのブランクを読み取る際は、以下の手順に従ってください。
    注意:コメントを開始・終了するには、ガス分析装置のオンラインソフトウェアで「 REMARK 」ボタンを押してください。
    1. コメントは hh:mm:00 から始めてください。
    2. 針を小瓶に挿入します。hh:mm:10の位置で。
    3. hh:mm:30でバイアルから針を抜きます。
    4. コメントを止める:hh:mm:45。
  10. 分析器注入針に接続された0.45μmフィルターを16サンプルごとに交換します。このフィルターは水分を捕捉し、分析装置内のフィルターの詰まりを防ぐことを目的としています。
  11. これらの手順をすべてのサンプルで繰り返します。

figure-protocol-12
図12:ガス分析装置を可動テーブルに置く。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

16. 温度勾配ブロックからのサンプルの降ろし

  1. 一つずつサンプルをブロックから取り出し、箱に入れます。以下のいずれかの選択肢を選びましょう:
    1. CO2を測定しながら荷降ろし。
    2. 最後のCO2 サンプルを測定した後の荷降ろし。
      注意:ブロック培養後の将来のサンプル解析の要件または検査スケジュールに基づいて、2つの選択肢のいずれかを選択してください。例えば、ステップ16.1.1では一部のサンプルの培養期間が変更され、それが後の分析結果に影響を与える可能性があります。ラボのスケジュール(例:開館・閉鎖時間)も制約要因になることがあります。
  2. サンプルを処理し、将来の分析のために保管します。
    注:この場合、88サンプルすべてがブロック培養後に保存されました。ヘラを使い、60mLのガラスバイアルから全サンプルをあらかじめラベル入りのビニール袋に移しました。

17. データのダウンロード

  1. ガスアナライザーで収集されたデータを抽出するには、ガスアナライザーのオンラインソフトウェアにアクセスしてください。 設定 をクリックしてから ダウンロード アイコンを押してください。
  2. 最初と最後のサンプルが測定された具体的な時刻を選択します。 ダウンロードをクリックします。
  3. 新しいスプレッドシートを開き、 ファイルを開く。ファイル検索を 「すべてのファイル」(*.*) に変更し、前のステップで保存した文書を探してください。新しいウィンドウが開き、その後 「終了」を選択します。

18. 楽器の電源を切る

  1. ガス分析装置は電源ボタンかソフトウェアインターフェースで電源を切ります。ボタンで楽器の電源を切るには、5秒以内に電源 オフ ボタンを3回押します。
  2. 冷却システムを オフ にしてください。 ロック ボタン(項目I、 補足図2)と OK/ポンプ ボタン(項目E、 補足図2)を押します。ホワイトノイズは止まるべきです。ホワイトノイズが完全に消えたら、 OFF ボタンを押します。
  3. 暖房システムを 止め てください。機器の背後にあるスイッチを使って温度勾配ブロック制御システムをオフにします。緑色のランプが消灯していることを確認してください(補足図3)。

19.CO2 ppmを呼吸率(μg C/kg土壌/時間)に換算

  1. ガス分析装置のデータを後処理ソフト(Rを使用)にインポートし、REMARK、TIME、CO 2、H2Oの変数を抽出します。
  2. 新しいカラムを作成して、興味のある秒を抽出します。具体的には>30秒から<35秒までの間です。
  3. 気圧低下に関連する問題がある観測データは削除してください。実験中、圧力低下によりCO2の測定値が予想よりやや低くなった可能性があります。これらのわずかな減少(前後の値より3〜5%低く)は、CO₂の実際の変化ではなく、圧力低下によるアーティファクト(誤差)です。したがって、前回または次のCO2値と比べてわずかに減少したCO2値は(~3〜5%)除外してください。
  4. 残りのデータポイントの平均CO2 濃度(ppm)を計算します。各サンプルごとに、測定した5つのブランクの平均を差し引きます。
  5. ラボデータを後処理ソフトウェア(例:R)にインポートし、REMARK、乾燥土壌重量、閉鎖時間の変数を抽出します。
  6. 分析装置で測定されたCO2 ppmをμg C/g土壌に換算するには、式2を適用します。
    figure-protocol-13
    ここで、ガス分析装置で測定されたCO2濃度はppmで表されます。CO2の分子量は44.01 g·mol-1に等しいです。Pは気圧であり、1に等しく、気圧で表されます。Rは気圧・mol-1·で表される0.082058の普遍気体定数です。K-1;ヘッドスペースは、60 mLのガラスバイアルのヘッドスペース(mL単位で表される)に基づいて計算されます。Tは機器の仮定内部温度で、293.15でKで表されます。乾燥土壌重量はgで表されます。
  7. 次に、潜伏時間(時間単位)で割り、1000に掛けてグラムを土のキログラムに換算します。
  8. 最後に、CO2とCの分子量を用いてμgのCO2をμgの炭素に変換します。これにより、呼吸率は1時間あたり1キログラムの土壌μgCで表されます。
  9. 処理済みデータを保存またはエクスポートしてさらなる分析を行ってください。

結果

ブロック温度の安定性と分布
このプロトコルの開発中、私たちはブロック内の温度の線形性と時間的安定性をテストしました。冷却システムとヒーターをオンにすると、ブロックの初期化時間は約1時間で、その間に8つの均等分布温度センサーのほとんどが目標温度に達し、オーバーシュート後も一定の温度を維持します(図13A)。この期間を経て、8つのセンサーで記録された温度は、アルミニウムブロックに沿った温度の完全な線形分布を確認します(図13B)。

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図13:温度勾配ブロック内の線形性と時間的安定性。 (A) 潜伏期間中のブロック内の温度の時間的安定性、および (B) 潜伏開始時にセンサーが記録した温度。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

ブロック温度と土壌温度
私たちは、ブロック内の土壌サンプルが8つのセンサーで記録された温度に達するまでの時間をテストしました(図14)。本研究では、ブロック内のセンサー近くの8つの異なる位置で土壌サンプルの温度を測定しました。ブロック内に設置されたセンサーは、目標温度で事前に安定化されていました。上記のプロトコルに従い、ブロックの温度が安定すると、土壌サンプルをブロック内に投入しました。このテストでは、ブロックから分離された追加のセンサーを使用しました。15gの土を使い、センサープローブが土と完全に接触するようにしました。土壌サンプルは蓋を開けずに放置され、温度は1分ごとに記録され、合計30分間行われました。この試験中、温度変動を最小限に抑え、実際の利用条件をできるだけ再現するためにブロックはやや閉じられました(完全に閉じた状態で)。土壌サンプルが目標温度に安定するまでに約12分かかることがわかりました。この安定化期間は、潜伏期間が最低3.5時間続くことを考えると許容範囲内であると判断しました。さらに、12分間のブロック培養後の土壌温度の線形性も評価しました。結果は、土壌温度が線形関係を示し、8つのセンサーで観察された線形性と密接に一致していることを示しています(図15)。

figure-results-2
図14:異なる温度で培養された記録された土壌温度。 サンプルA、B、C、Dは対応するセンサーの近くに設置されたバイアルで培養されました(参照は 図10 参照)。土壌温度は熱電対を土壌サンプルに直接挿入して記録しました。各センサーが監視する具体的な温度は以下の通りです:(A) センサー1(S1)4.1°C、(B) センサー2(S2)12.5°C、(C) センサー3(S3)20.1°C、(D) センサー4(S4)28.1°C、(E) センサー5(S5)36.1°C、(F) センサー6(S6)43.8°C、(G)センサー7(S7)51.9°C, および(H)センサー8(S8)を60°Cで設置しました。 土壌サンプルをブロックに置くと、目標温度に達するまでに約12分かかります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-3
図15:土壌温度とセンサー温度の強い線形相関。 4つの土入りバイアルが8つのセンサーの近くにブロック位置A、B、C、Dに配置されました。土壌温度は熱電対を土壌サンプルに直接挿入して記録しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

温度と水分の相互作用
潜伏期間中には温度と湿度の相互作用が避けられず評価が必要です。例えば、高温は蒸発を加速させ、低温は水の結露を引き起こすことがあります。この試験では、異なる質感を持つ4つのランダムに選ばれた土壌サンプルを使用しました(補足表2)。プロトコルによれば、各土壌サンプルは22の温度すべてで同じブロック位置に配置されました。結果は、平均潜伏時間3.5時間後、土壌の質感に関わらず、気温が高いほど低温よりも水分損失が大きくなることを示しています(図16)。60°Cで孵化した土壌は、平均して添加された総水の12%を失いましたが、4.1°Cで培養された土壌は平均して1.88%しか失われませんでした。つまり、3.5時間のブロック孵化期間中、土壌は最適な水分条件、すなわち50%から60%の水分保持能力の間で、培養温度44.45に関わらず維持されていたことを意味します(補足図6)。

figure-results-4
図16:4つの異なるサンプルにおけるブロックインキュベーション中の土壌水分の相対的損失。 水分損失は、WHCを補正するために添加された総水量に対して計算されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

CO2濃度測定
ガスアナライザーの精度と精度を検証するため、認証された基準ガス(413 ± 5 ppmCO2)を4回測定し、分析装置は413.71 ± 0.60(ppmCO2、平均± SD)を記録しました。これにより、ガス分析装置で記録されたCO2 測定の高精度と精度が確認されました。さらに、メーカーの仕様に準拠するために、認証済みリファレンスガスを用いた年次試験を行うべきです。

注入ラインとガス分析装置への流量削減キットによる遅延を考慮し、最適な測定時間を決定するために複数の試験が行われました。結果は、注入ラインが約5秒の遅延を引き起こすことを示しています。このセットアップでは、理想的な測定時間は20秒であり、CO2 検出ユニットを満たし、5秒で平衡状態に達するのに十分な時間が確保されます(図17)。流量削減キットが1.17 mL/sの速度を測定していることから、この測定時間は60 mLバイアルの空気含有量の39%をサンプリングしたに相当します。さらに、ガス分析装置を閉鎖システムとして使用すると圧力低下が起こることも観察されました。この滴は、針がバイアルから抜かれる1秒間の空気注入がない間に発生します。データ処理中の圧力低下を考慮し、前回または次の数値よりわずかに低いCO2 値(3%から5%)は除外しました。

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図17:3つの異なる温度で培養した個々の土壌サンプルの最適測定時間。 このグラフは針の注入と抽出時間、5秒間のCO2 の平衡、そして選択した時間枠に関連する圧力損失を示しています。Incubation_IDブロックの位置(C)とバイアルの位置(5、10、15)を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコル全体のテスト
プロトコルの機能性と再現性を評価するため、4°Cから60°Cまでの22段階の離散温度で、それぞれ4つの技術的複製を持つ2つの異なるサンプルをインキュベートしました。 これらの土壌サンプルは、このセットアップで生成されるデータの種類と性能を示すために選ばれました。具体的なサンプル特性は 補足表2に記載されています。温度勾配ブロックは各温度点における異なる土壌試料の土壌呼吸速度を確実に捉え、温度応答曲線を可視化することができました。さらに、すべての複製の温度応答曲線はほぼ同一であり、これはすべての温度における平均呼吸率の標準偏差が小さいことからも明らかです(図18)。これらの結果は高い再現性を示し、プロトコルの精度を裏付けています。

figure-results-6
図18:2種類の土壌の代表的なSOM分解率(Rs)を、全温度勾配にわたって4つの技術的複製を培養して測定した。 ポイントは各温度での呼吸率の平均を表し、誤差バーは技術的な複製間の標準偏差を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

プロトコルの科学的適用性を示すために2回目のテストが行われました。私たちは土壌呼吸率を全温度勾配で測定し、アレニウスモデルまたはMMRTモデルを用いてデータを適合させました(図19)。これらの土壌サンプルは、温度応答曲線の対比に対するシステム性能を示すために選ばれました(試料特性は 補足表2に記載)。結果は、温度勾配ブロックで収集されたデータは、SOM分解速度の温度感受性に関するさまざまな理論を検証することでさらに解析可能であることを示しています。しかし、どんな実験でも新鮮な土壌を扱う際には課題が生じます。潜伏前の10日間の間に、代表サンプルの範囲を超えた土壌サンプルのバイアル内で菌類群落が増殖しているのを観察しました。土壌を乱さずに菌類群集を慎重に除去しようとしたにもかかわらず、この成長は一部のサンプルの結果に影響を与えました(図20)。そのため、真菌の被害を受けた個々のバイアルだけでなく、影響を受けたサンプル全体を除去して、影響を受けたサンプルを廃棄することにしました。

figure-results-7
図19:温度勾配ブロックでキュベートされた4つの異なる土壌サンプルの代表的な結果と呼吸率(Rs)。 赤い線は(A,B)アレニウスフィット、青いラインは(C,D)MMRTフィットを表します。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

figure-results-8
図20:真菌の増殖の影響を受けた一部のサンプルの呼吸率パターン。 これらの結果は、(A,B)2つの汚染サンプルの例であり、さらなる分析から除外されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:基本的なNO/NC回路。 「C」は「COM」と表記されることもあります。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:冷却システムの制御パネル。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図3:システムスイッチとライトインジケーター。 (A) 温度勾配ブロック制御システムスイッチ;(B)センサーと暖房システムが点灯していることを示す緑色ランプ。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図4:オンラインインターフェースにおける温度勾配ブロックヒーター制御。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図5:ガス分析装置の診断セクション。 すべてが緑色なら、機器が測定の準備ができていることを意味します。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図6:異なる温度で培養した土壌の水分保持容量、ブロック孵化3.5時間後に記録された測定値。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足ファイル1:詳細な配線説明書。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表1:必要な量の材料一覧。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足表2:水分損失試験および全プロトコルに使用される土壌サンプルの特徴。 これらのサンプルはプロトコルの機能性を示すために選ばれました。テクスチャー分類はUSDAのシステムに従い、粗粒、粘土、シルト、砂がパーセンテージで表されます。OCは有機炭素含有量(g・kg-1 土壌)を指し、pHは水中で測定され、CaCO3 は炭酸カルシウム含有量(g·kg-1)を表します。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

SOM分解速度の短期的な温度応答を測定するために温度勾配ブロックを使用することは、特に低温での呼吸速度検出において課題を伴います。低温は細胞内および細胞外酵素の触媒活性を直接阻害することがあります46,47。したがって、温度範囲の低限での低い呼吸率がガラスバイアル内のCO2の十分な蓄積を確保できるよう、培養時間はガス分析装置の検出範囲内に収まるよう十分に長く設定する必要があります。この実験装置では最低温度が4.1°Cでした。これらのサンプルは最初にブロックに積み込まれ、最後に分析されるため、追加の培養時間が与えられました。約3.5時間のブロック培養時間は、試料中のCO2濃度に検出可能な変化をもたらすのに十分であることが判明しました。この潜伏期間は土壌の種類、特に有機物の含有量によって異なると考えられます。例えば、有機物含有量の少ない砂質土壌は、炭素豊富な土壌よりも長い培養時間を必要とする場合があります。しかし、ここでの試験では、3.5時間の潜伏時間がほとんどの土壌タイプや有機物含有量に対して一般的に十分であることが判明しました。

低温でのCO2検出のための潜伏時間の最適化に加え、温度勾配の高端での水分損失を最小限に抑えることも同様に重要です。土壌水分は基質の微生物群落への輸送、拡散、溶解において重要な役割を果たします例えば、土壌水分は低湿度では基質の拡散を制限し、高湿度では酸素供給を減少させることで呼吸速度を制限します(45,49)。したがって、高温での水分損失を最小限に抑えることが、微生物の基質へのアクセスを制限するのを防ぐために重要です。このプロトコルのバイアルは完全に密封されていましたが、キャップや内壁に水が凝縮していました。この結露は土壌からの水分の損失と考えられていました。したがって、潜伏時間をRobinsonら 201741年のように4時間から3.5時間に短縮しました。すべての温度処理で完全に一定の水分レベルを維持することは不可能でしたが、3.5時間の潜伏期間中は土壌の水分レベルを最適な状態に保ちました。高温下でも土壌のWHCは50%以上を維持し、水分の利用が基質への微生物のアクセスを制限しないようにしました。

もう一つ重要な考慮点は、孵化の温度範囲です。冷却システムは-30°Cまで、暖房システムは最大320°Cまで上昇しますが、断熱材の耐熱温度は-183°Cから148°Cです。 このセットアップで使用されるガラス製バイアルは500°Cに耐えられます。 これらの範囲は広いものの、100°C以上の培養サンプルは操作者にとって安全上の懸念があります。過熱を防ぐために、熱抵抗器が追加され、アルミニウムブロックが90°Cに達すると自動的に暖房システムが停止するようになった。 この熱抵抗器の包含は、初期化のオーバーシュートが観察されているため非常に重要です(図13A)。初期化時の温度が90°Cを超えるとシステムは無効化されます。これらの制限を考慮すると、安全かつ信頼性の高い性能のために最大60°Cの運用を推奨します。0°C以下の土壌サンプルを培養する場合には、結露やそれに伴う水分変動が氷点下での測定に影響を与える可能性があるため、CO2 検出の信頼性を確保するために追加の検査が必要です。このプロトコルでは、凝縮が観察されない4°Cという低い温度制限を選びました。より広い温度範囲で使用される場合は、追加の熱安全ガイドラインの導入を推奨します。

この方法のもう一つの潜在的な制約は、比較的短い潜伏期間が微生物群集が温度変化に適応できないことです。持続的な温暖化にさらされた土壌の温度応答は多くの研究の焦点であり、特に微生物適応理論27,43,47,50,51の検証を目的としています。実験的温暖化が土壌呼吸率に与える効果の減少を説明するために、微生物の適応が提案されています(47)。しかし、ここで提示された手法は、SOM分解速度の短期温度応答を測定するために開発されました。微生物の適応が短期間で起こる可能性は低いですが、最近の研究では、地熱勾配から土壌を培養することで微生物適応速度を定量化する類似の方法論が用いられています。本研究では、MMRTを適合させて、温度最適や転折点などの主要パラメータを推定しました。地熱勾配の土壌間でこれらのパラメータを比較した結果、微生物の適応速度は温暖化速度より有意に低いことが示されています。本研究は、特に生物学的土壌プロセスにおける最適温度と転折点を捉えること(図19C,D)を捉えることの重要性を強調しています。これらの発見を踏まえ、ブロック培養中に複数の温度点で微生物群集をサンプリングし、微生物群集の組成や機能が呼吸率や温度感受性パラメータとどのように相関するかを評価することを推奨します。

本論文で述べた温度勾配ブロックは、従来の手法に比べて大きな利点を提供します。大きな利点の一つは、22段階の離散温度で少量の土壌でSOM分解速度を効率的かつ正確に測定できることです。これは、土壌サンプルを数個の離散的な温度で培養するよりも方法論的な進歩であり、研究者はQ10温度係数を適用することを強いられています。多くの研究が12、13、15という方法に疑問視されています。もう一つの大きな利点は、この構成が温度応答曲線の形状や急勾配を明確に捉えたデータを収集できることです。広い温度勾配に沿った離散的な温度処理の数は、転換点温度と生物学的プロセスの最適を特定し、処理間の比較を可能にします。この論文で示された例は、2つの明確なパターン(図19A,B対図19C,D)を示しており、研究者は異なる温度感受性理論を用いてさらに分析できます。いくつかの例は、反応速度が温度とともに指数関数的に増加するアレニウス理論を支持しています(図19A,B)。対照的に、他の例はMMRT理論と一致し、明確な温度最適条件を持つユニモーダル応答を示しています(図19C,D)。これら2つの異なるパターンは、提示された温度ブロック培養プロトコルが両方の応答曲線を再現できることを示しており、SOM分解速度の温度感受性理論の検証に用いられ、熱力学、生物学、化学の理解を深めることができます。

開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

プログラミング、電子機器、ブロックのテストに協力してくれたピーテル・ファン・デ・ブロークに感謝します。電子ユニットプロトコルの作成に協力してくれたクリストファー・ウェッデに感謝します。このセットアップのための素材の注文に協力してくれたヘンク・マーテンスに感謝します。また、実験室でのブロック設置における支援とファシリテーションをいただいたタマス・サランキ氏、パオロ・ディ・ロナルド氏、ウィレケ・ファン・ティンレン氏にも感謝いたします。また、温度ブロックのパフォーマンステストとして提示された過去のサンプルへのアクセスを許可してくれた合同研究センターにも感謝します。最後に、このプロトコルを試験するための土壌サンプリングキャンペーン中にご協力いただいたアントワーヌ・モネ氏とトゥリア・カロジウリ氏に感謝いたします。このプロジェクトはワーヘニンゲン大学の土壌科学クラスターとリサーチによって資金提供されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
630 mAガラスヒューズ RS563-637https://uk.rs-online.com/web
/p/cartridge-fuses/0563637?gb=s
接着シーラント インノテック01.2451.0000https://www.innotec.nl
/producten/adheseal
アルミニウムブロック メタアルケテン96082150.1https://www.metaalketen
.com/アルミニウム/
アルミテープマヌータンA159435https://www.manutan.nl/nl/mnl/aluminiumtape
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-a159435?shoppingab=true&gad_source=
1&gclid=CjwKCAjw74e1Bh
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黒線RS361-787https://nl.rs-online.com/web
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青いワイヤーRS724-4392https://nl.rs-online.com/web
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丸ノコライオビツールRWSL1801Mhttps://nl.ryobitools.eu/elektrisch-g
Ereedschap/zaagmachines/cirkelz
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ARIsANAwM2Easx4PAZzvVYvFFUD
ZKemTdqNDXsde_NDPSB8FAlGu7
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閉鎖クランプHS491976https://www.kramp.com/shop-nl/nl/p
/verstelbare-haakvergrendeling-118-
128-typ.3--HS491976
冷却剤と自然冷却剤Dijkstra VereenigdeL035004186https://www.laboratorium-apparatuur
.nl/ika-rc2-green-basic-Koelthermo
Staat-30-c-bad-volume-4-liter-L035004186
DINレールRS648-5722https://nl.rs-online.com/web/p/din-ra
ils/6485722?cm_mmc=NL-PLA-DS
3A-_-google-_-CSS_NL_NL_Pmax
_Test-_--_-6485722&matchtype=&&g
ad_source=1&gclid=CjwKCAjw8f
u1BhBsEiwAwDrsjOqGDs92gjrJHkp
SsYmOiS0OK6tC9U_fMHEhlmvu7r
SbNp8VnmuDERoCC0UQAvD_
BwE&gclsrc=aw.ds
二重ブリッジRS803-7530https://nl.rs-online.com/web/p/din-rail
-terminal-accessories/8037530?sear
chId=11c9702f-3312-4bb0-a826-e9d
50bd91ee1&GB=s
イーサネットケーブルRS657-2090https://nl.rs-online.com/web/p/
イーサネットケーブル/6572090
フェイスマスクKN95NAhttps://www.bol.com/nl/nl/p/kn95
disposable-face-mask-ffp2-x-1-mask
S-kn95-Wegwerp-Gezichtsmasker-FFP
2-x-1mondkapjes/930000000131403
0/?Referrer=NLGOOFS&utm_source
=google&utm_medium=free_shopping
メスコネクターコシナ17642https://www.qosina.com/female-
to-female-luer-lock-connector-17642
フィルター0.45 & micro;mワットマン10462650https://us.vwr.com/store/product/1394
3097/whatmantm-puradisc-aqua-30-m
m-syringe-filter-0-45-m-whatman-
products-cytiva
フレキシブル断熱材(ホース)セルシス4600000198https://www.celsisbv.nl/k-flex-plaati
Solatie-op-ROL-ST-10E-1x10mtr-10mm
.-bl-s3-d0/4600000198?gad_source
=1&gclid=Cj0KCQjw8MG1BhCoARI
sAHxSiQknvLK3RcqgqXwR1Ma7V
PznSz8IasKUGvLo0SySzLiff2o_kK
Vjip0aAtATEALw_wcB
フレキシブルチューブアヴァントールMFLX06491-14https://www.avantorsciences.com
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