本記事では、成マウスにおけるCNS標的治療薬の鞘内投与方法を詳述し、プロトコルの精度と繰り返し注射の可能性に焦点を当てています。この研究には、反センスオリゴヌクレオチドがSOD1-ALSモデルマウスにおける変異SOD1発現を低減させた検証研究の結果が含まれており、神経変性疾患の前臨床研究におけるこのアプローチの有用性を支持しています。
方法論記事
ヒトSOD1-G93AALSマウスにおける中枢神経系の正確な標的化と予測効果のためのSOD1-ASOsの腰椎鞘内注射
この記事について
サマリー
要約
中枢神経系(CNS)標的治療薬の鞘内(IT)投与は、脳脊髄液(CSF)への直接薬物送達を低侵襲で提供し、特異性と標的結合の向上を促進します。ラットでの持続的な投与にはITカテーテル挿入が標準ですが、マウスでの適用は解剖学的制約や脊椎損傷や感染症などの手術関連合併症のリスクが高いため制限されています。これらの制約を克服するため、成マウスにおけるIT薬物送達に急性針穿刺技術を用い、単回または反復投与と両立可能な再現性が高く侵襲性の低い代替方法を提供しました。SOD1-G93A変異を持つ筋萎縮性側索硬化症(ALS)のトランスジェニックマウスモデルにおいて、SOD1遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の効率的なIT送達を実現しました。このアプローチは、変異 SOD1 の発現を効果的にダウンレギュレーションし、疾患の表現型を有意に改善したことが電気生理学的およびバイオマーカーの評価によって示されています。これらの結果は、IT投与方法と治療効果の両方を検証し、脳内心室内投与(ICV)と同等のアウトカムを示しています。最も重要なのは、この手法がヒト臨床試験で用いられる手法を反映しており、CNS指向介入の前臨床評価において強いトランスレーショナル関連性と有用性を持っていることです。一貫性を確保し、オフターゲット効果を避けるためには技術的専門知識が必要ですが、このIT提供戦略は小動物モデルにおける治療開発を前進させるための堅牢で再現性が高く臨床的に関連性の高い方法論を示しています。
概要
本研究では、腰椎鞘内注射(IT)プロトコルを記述し、脳内室内(ICV)投与と比較し、中枢神経系(CNS)標的治療薬の開発を導くための薬理力学的アウトカムと耐容性を評価します。RNA標的療法、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)は、転写後の遺伝子発現調節を可能にすることで、CNS疾患に対する有望なモダリティを示しています。これらのアプローチは特に神経変性疾患において重要であり、進行性の神経細胞喪失が、病の進行を修正するために正確で局所的かつタイムリーな介入の必要性を強調しています。ここでは、IT注射プロトコルの有効性をASO治療薬におけるICV投与と直接比較します。
前臨床研究では、成マウス(オスまたはメス、生後30〜70日、体重13〜20g)を対象に腰椎鞘内注射を用い、中枢神経系統1,2を標的とする薬理学的薬剤や生物学的ベクターを脳脊髄液(CSF)に直接送達しました。5〜10μLの注射量は通常、一時的な脳脊髄液圧の上昇と逆流を抑えるためにゆっくりと投与され、L5-L6椎間隙を通じて鞘内アクセスが行われます1,2。手技の成功は神経障害を避ける慎重な技術に依存しており、年齢や体重が脳脊髄液の容積や取り扱いに影響を与えます。細かいゲージの針(例:27〜30Gの針と25μLのハミルトン注射器を組み合わせる)を使用することで、信頼性の高い投与が可能です。主な技術的課題には、デッドスペース損失の最小化、硬膜外誤注射や漏出の防止、投与精度やCSF分布に影響を与える操作者依存の変動性の低減が含まれます。
CNS障害に対する効果的な治療法の開発は、構造的複雑さと細胞の多様性のため、依然として大きな課題となっています。これらの特徴は標的薬物の送達を妨げ、複数の解剖学的・生理学的障壁を越えた生体分布を制限するため、専門的な投与戦略を必要とします。重要な障害は、中枢神経系全体に存在する生理学的・解剖学的な障壁であり、薬物の浸透を制限しています。脳と脊髄は、硬膜、くも膜、神経膜の3つの髄膜層に包まれており、血脳関門(BBB)と合わせて、血液中の治療薬や他の血液分子に対する強力な防御力を提供します。これらの障壁は中枢神経系の安定性維持に不可欠ですが、ASOs、モノクローナル抗体、ウイルスベクター1,2,3,4などの大型親水分子の送達を著しく妨げます。IT管理は、くも膜下腔の脳脊髄液に直接治療薬を注入することで、これらの制限を回避する手段を提供します。この投与経路により、薬剤の中枢神経系統区画間での分布が促進され、より広い組織への浸透が促進され、CNS内の多様な細胞型で発現する標的への効果的な関与が可能になります。1980年にHyldenとWilcoxがマウスでのモルヒネ送達に初めて使用して以来、IT注射は小分子、生物製剤、遺伝子治療ベクター、ASO5、6、7、8、9、10など多様な治療薬の送達においてより広く使われる方法となっています。
ASOは、RNase Hによる分解、スプライス調節、翻訳の立体阻害などの機構を通じて、補完的なRNA配列に結合し遺伝子発現を調節するために化学的に設計された一本鎖オリゴヌクレオチドです。ホスホロチオエイト骨格修飾、2'-O-メトキシエチル(2'-MOE)置換、抑制エチル残基などの化学的強化は、それらの安定性、結合親和性、ヌクレアーゼに対する耐性を高めます6。これらの特性により、神経遺伝性疾患に関与する病原性遺伝子の標的化への応用が支持されています。ASOベースの治療は、脊髄性筋萎縮症(SMA)や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの疾患において臨床的利益が示されています12,13,14,15。例えば、Nusinersen(Spinraza)はSMN2転写産物におけるエクソン7の包含を強化し、SMA7,14におけるSMN1の損失を補います。変異したハンチンチン転写物を標的とした類似の戦略は、ハンチントン病12,13でも探求されました。これらの試験は16日の初めに終了しましたが、CNS主導のASOアプローチへの関心が依然として存在していることを示しています。
ALSは、上部および下部の運動ニューロンが進行性に変性する致命的な神経変性疾患です。この病気は、世界中の人口10万人あたり6人から9人に影響を及ぼし、約10万人年に2件の発症率で発生します。筋肉の筋力低下と痙縮が徐々に悪化し、ほとんどの患者は症状が始まってから2〜3年以内に神経筋呼吸不全に陥ります。17歳以内です。ほとんどの症例は散発的(sALS)ですが、約10%は家族性(fALS)であり、遺伝的要因についての洞察を提供しています。最も研究されている遺伝子の一つにCu/Zn超酸化ジムミューターゼ1(SOD1)があり、これはfALSの約15〜20%、sALSの2%未満を占め、常染色体優性で遺伝します18。SOD1は細胞質抗酸化酵素をコードし、超酸化ラジカルを過酸化水素に変換して活性酸素種を解毒します。G93A、A4V、H46RなどのSOD1の変異型は立体構造の不安定性を示し、タンパク質の凝集や毒性の増強を引き起こし、酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、興奮毒性に寄与します。19,20,21,22,23,24,25.さらに、ALSの病理は、ミクログリアやアストロサイトに関与する非細胞自律的メカニズムによって悪化し、慢性的な炎症環境や進行性の神経障害に寄与しています(26,27,28,29)。したがって、ASOsを用いたSOD1発現の沈黙は、疾患の病因を緩和する有望な治療的道筋を示しています。
SOD1-G93A遺伝子移行マウスモデル(Jax Strain #: 004435)は、内因性ヒトSOD1プロモーターの制御下でヒトG93A変異型SOD1を発現し、ALSの臨床的特徴である早期運動障害、脊髄神経変性、生存期間短縮をほぼ再現しています30。これまでの前臨床研究では、SOD1-G93Aラットを出生後65日目に浸透圧ポンプを用いた持続的な心室内投与でSOD1特異的ASOを1日100μgを28日連続投与することで、SOD1レベルの有意な抑制、神経炎症反応の減少、臨床症状の出現遅延、運動能力の改善が示されています31.さらに、SOD1-ALS患者におけるASO介在によるSOD1のノックダウンは、軸索損傷を示す血液ベースのバイオマーカーである神経フィラメントライトチェーン(NfL)レベルの低下と関連しています32。本研究では、SOD1-G93AマウスにIT注入によるSOD1標的ASOを投与し、分子、電気生理、バイオマーカーの指標全体でその影響を評価しました。脊髄組織の定量解析ではSOD1 mRNAレベルの有意な減少が認められました。複合筋活動電位(CMAP)の電気生理学的評価により、神経筋機能が保持されることが示されました。同時に、血清NfL値も低下し、進行中の神経障害の緩和を反映しています。
代替CNS投与法の空間的分布と相対的有効性を評価するため、比較群として脳内室内注射(ICV)を用い、治療薬を外側心室に注入し、脳髄液流を介して室室膜および血管周囲空間に拡散する33を含みました。ITとICV投与経路を比較することで、薬理力学的アウトカムと組織標的の違いを明確にし、CNS指向ASO療法の送達戦略を洗練させることを目指しました。さらに、トランスレーショナルの実現可能性を評価するために、1株あたり最大4回のIT注射を8週間間隔で独立した耐容性研究を実施しました。すべての試験済みレジメンにおいて、明らかな苦痛や罹患の兆候は認められず、生存の文脈でITASO投与の耐容性を支持しました。これらの結果は、マウスにおける繰り返しの鞘内注射の耐容性を示す以前の報告と一致しています。
ITASO投与の臨床的関連性は、SOD1関連ALS35に対するtofersen(QALSODY®)の最近の規制承認によってさらに裏付けられています。臨床試験では、CSF SOD1タンパク質の減少と神経軸索損傷のバイオマーカーである神経フィラメントライトチェーンレベルの低下に反映される強固な標的結合が示されました。初期の第3相VALOR試験では主要評価項目が満たされなかったものの、オープンラベル延長を含む統合解析により、早期治療開始の潜在的な利益が示唆されました。
ここでのデータ全体として、SOD1-G93AマウスモデルにおけるSOD1標的ASOのITデリバリーが、効果的な分子ノックダウン、バイオマーカー改善、機能保存を良好な耐容性で達成していることを示しています。これらの結果は、IT ASOの提供をCNS遺伝性疾患に対する合理的かつ臨床的に有効なアプローチとして支持し、継続的なトランスレーショナル開発のための堅牢な前臨床的枠組みを提供します。
プロトコル
ここでのすべての手続きは、IACUC承認のプロトコルおよび機関の化学衛生・バイオセーフティガイドラインに従って承認・実施されています。
注:標準的な条件下(12時間の明暗サイクル、22〜24°C、自由に食物と水へのアクセス)を基にしたC57BL/6J(JAX #000664)およびSOD1-G93Aトランスジェニックマウス(JAX #004435)で研究を実施。
1. ヒトSOD1を標的とした化学改変ASOの適用
- 検証済みアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を用いて、ヒトSOD1遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)内のヌクレオチド613-629を特異的に標的化します(参考文献:NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*T*ToToA*T*C
- MOE(2'-O-メトキシエチル)(通常のフォントで示)、cEt(制限エチル)(斜体)、DNA(太字)、リン酸結合(o)、リン酸塩結合(*)を取り入れ、安定性と有効性を高めるための検証済み化学修飾を含める。これらは以前に報告された36。補足ファイル1には ASO化学と対応する色分けが示されています。
- ヒトや齧歯類ゲノムと相補性を持たず、同じ修飾スキームに従って制御用の非標的対照ASOを準備します:C*CoToAoT*G*G*A*A*T*C*C*AoGoGoA*A
2. 無菌条件下でのASO溶液の調製および取り扱い
- 無菌人工脳脊髄液(aCSF;表1)無菌条件下で10 mg/mL濃度に設定し、最終注射量は1匹あたり10 μL(100 μg)を目標としています。
- 分子の完全性を保つために滅菌ピペットで溶液を優しく混ぜ、その後5〜10秒ほど軽く渦を巻いてよく混色させます。
- 希釈した溶液を無菌の0.2mmシリンジフィルターでろ過し、粒子や汚染物質を除去します。
- 最終溶液を無菌マイクロ遠心分離機管に無菌で分離し、監視下の温度管理されたユニットで最大1週間保存します。凍結融解サイクルを避けて安定性を維持します。
3. 鞘内注射前のマウス準備
- デジタルテンプを使って各マウスの体重を0.1gに近づけ、鼻のコーンに移して酸素濃度2〜2.5%のイソフルランで麻酔を誘導します。深度を継続的にモニタリングし、足の反射を失って手術面を確認しましょう。
- サーモスタット制御のヒーターパッドを用意し、37°Cに設定して、準備と回復中のマウスをサポートします。
- 麻酔誘導直後に両眼に眼用潤滑剤を塗布し、角膜乾燥を防ぎます。その後、マウスを温熱パッドの上に腹側横たわりさせ、低体温症を防ぎ、生理的ストレスを最小限に抑え、処置中は正常な心血管および呼吸機能を支えます。
- 処置前に、無菌注射器と25Gの針を使い、3.25 mg/kgの皮下投与ブプレノルフィン徐放性注射懸濁液(1.3 mg/mL)を投与し、20 gの体重あたり0.05 mLを注射します。
- 腰椎の側面を中央から骨盤帯まで剃り、イソプロピルアルコールとポビドンヨウ素を交互に綿棒で消毒し、3回繰り返して完全に自然乾燥させます。
4. 直接鞘内注射
- 麻酔と手術部位の準備後、マウスを清潔な注射部位に移動し、温熱パッドの上に腹側横たわりに置きます。
- 触診と注射を容易にするために、マウスを脊椎を反らせる位置に置きます。
- 腹部下部の下胸部から上腰椎のレベルに曲がったヘラを挿入し、軽度の脊椎屈曲を誘発し、第5と第6椎板(L5-L6が推奨)または第4と第5椎間板(L4-L5)の間の腰椎椎間隙を広げます。
- 針の面取りを椎板の間に差し込み、腰椎貯水槽に入り、くも膜下腔にアクセスし、骨との直接接触を避けて注射の安全性と精度を高めます。
- 骨盤帯を安定させるには、片手の親指と人差し指で骨盤帯を優しく掴み、もう一方の手で背側の正中線を触診して、L4-L5またはL5-L6の間の椎間隙を位置づけます。
- 滅菌の0.3mLインスリン注射器を、29Gの1/2インチ針を背側皮膚面に垂直または70〜80度の角度で整列し、斜面を頭蓋方向に配置します。針を硬膜に突き刺す際にわずかな抵抗を感じるまで前進させ、その後鞘内空間へと進みます。
- 先端が鞘内空間に入るまで一定に挿入し、尾をはじく反射で確認して鞘内挿入に成功しました。
- 大きな抵抗が見られたり、尾の揺れ反射が見られない場合は、針を抜き、解剖学的ランドマークを再確認し、注射を再開始する前に針の位置を調整してください。最初の試みがL5-L6椎間隙で行われた場合は、次の試みはL4-L5椎間隙で行います。
- ASO溶液10μLをゆっくり(10秒以上)注入し、圧力変化を最小限に抑え、CSF逆流を避けます。注射後、針はさらに10秒間保持されることがあります。
- 組織損傷や逆流を防ぐために、針を縦方向かつ滑らかに慎重に抜きましょう。
- 回復期間中はマウスを継続的に観察し、呼吸、運動機能、姿勢、痛みや苦痛の兆候を観察してください。
- ネズミが元のケージに戻る前に、必ず通常の動きや行動を取り戻してください。
- IACUCのプロトコルに従い、注射部位、ASO投与量、注射量、および処置中および手術後の行動・生理学的観察など、すべての関連する手技の詳細を記録してください。
5. マウスのモニタリングと注射後の回復支援
- 各マウスを、事前に温められた回収室内の個別または間隔のある区画に入れ、温度は37°Cに保たれます。
- 麻酔回復中は低体温症を防ぐためにチャンバーの温度を管理してください。
- 呼吸数やパターン、姿勢、触覚刺激への反応を継続的にモニタリングしてください。
- マウスが復元反射を取り戻し、協調した動きを見せるまで観察してください。
- 過密を避けることで視界が明瞭になり、干渉を防ぎましょう。
6. ホームケージに戻る基準の決定
- マウスが安定し、協調した自発的な動きがあるか確認してください。
- 呼吸の困難や不規則、発声、長時間の反応のなさなど、苦痛の兆候がないか確認してください。
- 栄養成分が完全なジェルダイエットサプリメントなどのソフトな栄養サポートを提供し、最小限の努力で水分補給とカロリー摂取を維持できます。
7. マウスの回復後の観察を行う
- 群居しているマウスは、探索、グルーミング、社会的交流などの正常な行動を確認しましょう。
- 異常な姿勢、筋力低下や麻痺、呼吸不整、反応の低下などの異常な回復の兆候がないか継続的に観察し、これらの症状が出た場合は速やかに再評価してください。
- 回復が遅れたり妨げられた場合は獣医の介入を求めてください。
8. 立体走位手術および術後ケアを用いた外側心室内内脳室注射
注:空間分布と相対的有効性を評価するために、内膜室(ICV)注射を用いた比較群を含め、ASOを外側心室に送り込みCSF媒介の分散と鞘内投与との比較を行います。マウスに対して確立された標準化されたプロトコルに従ってICV注射を行います。
- マウスを酸素中濃度2〜2.5%で麻酔し、マウスを温熱パッドの上で腹側横たわり状態に置き、その後、無菌1mLシリンジと25G針で0.05 mL/20体重20 kgあたり0.05 mLのブプレノルフィン徐放性注射懸液(1.3 mg/mL ブプレノルフィン塩酸塩)を皮下投与します。バリカンでマウスの頭皮を剃ります。
- すべての手術は麻酔下で行ってください。ICV手術中は無菌の無菌フィールドを維持してください。滅菌器具のみを使用し、非滅菌表面との接触を防ぐために慎重に取り扱ってください。
- 標準的な伏せ位置にデジタルディスプレイコンソールを設置し、ステレオタキシックフレーム内にマウスを固定します。マウスアダプターの歯のバーに前歯を差し込んで頭部を固定し、その後、イソフルランを供給する吸入・排気管でアダプターを固定します。イヤーバーを耳に差し込み、ネジを締めてヘッドをしっかり安定させます。
- イソプロピルアルコールとポビドンヨウ素を交互に綿棒で消毒し、3回繰り返し、無菌メスで中央線を切開して頭蓋骨を露出させます。無菌コットンの先端を使って軟組織を取り除き、ブレグマがはっきり見えるようにしてください。
- 頭蓋骨にブレグマを印をつけて。ASO入り注射器(26-G、26s/2"/2、ポイント型)をブレグマのすぐ上に置きます。針をターゲット座標に合わせます:頭蓋骨表面からAP -0.3 mm、ML ±1.0 mm、DV -3 mm。頭蓋骨にAP座標とML座標をマークしてください。
- マークされた座標にバーホールを作り、立体視フレームを使ってシリンジ針を頭蓋骨面から-3mmの深さまで下げます。溶液を10μL/分の速度で注入し、合計10μLの量が得られるまで続けます。注射が終わったら、針を4分間そのままにしてからゆっくりと引き抜き、逆流を最小限に抑えます。
- 頭皮切開部を縫合し、完全に目覚めるまで温めた37°Cの回復室に入れ、安定を確認したら元のケージに戻します。栄養的に完全なジェルダイエットサプリメントを提供し、異常な姿勢、筋力低下や麻痺、呼吸不整、反応性の低下などの異常回復の兆候を継続的に監視します。これらの症状が現れたら、すぐに再評価してください。
9. 複合筋活動電位(CMAP)の電気生理学的評価
- データ収集および解析時にバイアスを排除するため、実験者は各マウスの遺伝子型と処理群の両方を盲検にしておくこと。
- マウスをイソフルランで麻酔し、動かさと快適さを確保し、体温を37°Cに保つ。
- 足の反射を失うことで十分な麻酔を確認しましょう。
- 刺激と記録の両方に使い捨ての28Gモノポーラ針電極を使用してください。記録電極を脛骨前筋に1mm挿入します。
- 坐骨神経の切痕付近に0.1 msの単相方形波パルスを2秒ごとに1.0 mAから始めて0.5 mAずつ増やし、通常は1.5〜3.5 mAの超最大反応が得られるまで刺激します。
- 超最大閾値が決定されたら、そのレベルより0.5 mA高くCMAP反応を記録します。刺激から0.8ms後にCMAP振幅(ピーク・トゥ・ピーク)を測定し、レイテンシーを除外し、各マウスの左右脚の振幅を平均化します。
10. 血清pNFHレベルの測定
- 指定されたタイミングで、血栓活性化剤および血清分離ゲルを含む毛細血管採取管を用いて顔面静脈穿刺で全血100μLを採取します。
- 2000gの遠心分離機で血液サンプルを4°Cで10分間分離し、血清を分離します。
- 完全自動化されたカートリッジベースのマイクロ流体免疫測定解析装置上で、検証済み免疫測定試薬を用いて血清リン酸化ニューロフィラメント重鎖(pNFH)レベルを定量化し、生物学的サンプル中のpNFHを測定します。
11. RNAの単離とRT-qPCRの実施
- マウスの頸椎・胸髄組織を6mmの鋼ビーズを低温プログラム可能な高エネルギー振動ビーズミルで粉砕し、1,000〜1,200ストローク/分で30〜40秒間サンプル粉砕します。
- 粉砕組織(15 mg)を700 μLのフェノール-グアニジニウムチオシアネート系溶解液に2.8 mmのセラミックビーズを用いて均質化し、プログラム可能な高速ビードベースの機械的均質剤をプログラム可能な高速ビーズベースの機械的均質剤でRNA抽出試薬を用いて、30秒サイクルを2回行います。
- 製造元の指示に従い、オンカラムDNase処理を含む全RNAを抽出します。
- cDNA合成のために高容量逆転写試薬システムを用いて合成します。
- qPCR検出のために、ヒトSOD1遺伝子のエクソン4を標的とした目的遺伝子を検出するためのカスタムプライマー/プローブセットを設計します。
前方プライマー(5′-TGGTGTGTCCGATGTGTCTA-3′),
リバースプライマー(5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
プローブ(5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′) - マウスのGAPDH(TaqManアッセイID:Mm99999915_g1)をハウスキーピング遺伝子として使用してください。
- 高スループットリアルタイム定量PCR(qPCR)機器で、反応ごとに20 ngのcDNA、高速サイクルプローブベースのqPCRマスターミックス、遺伝子特異プライマー、蛍光標識加水分解プローブを用いて、ハウスキーピング(VIC/MGB)およびターゲット(FAM/MGB)転写産物の検出を行います。
12. データの統計分析
- 生前測定(CMAP)、血清pNFH、遺伝子発現解析のデータを平均±標準偏差(SD)として提示します。
- グループ平均間の統計的有意性を一方向ANOVAを用いて評価し、その後Tukeyの多重比較検定を用い、p < 0.05を統計的に有意とみなします。
- 適切な統計分析ソフトウェアを使用してグラフを作成し、研究で実施された分析と一致したすべての分析を行います。
結果
成マウスにおける鞘内(IT)投与の精度と効率を厳密に特徴づけるために、まずエバンスブルー染料(0.5%)を脳脊髄液の流れと組織浸透の視覚トレーサーとして用いる基礎検証実験を実施しました。成体の野生型C57BL/6Jマウス(株#000664、体重25-30g)は、運動の異常を除去するために酸素中にイソフルラン(2-2.5%)で麻酔され、腰部は無菌条件下で準備されました。IT注射は、20 μL、30 μL、50 μLの単回上昇用量でくも膜下腔に腰椎穿刺を行い、用量/体積および染色強度の関係を評価しました。注射時のテールの動きや負の抵抗観察で針の位置が正確であることが確認されました。
染料投与から5分以内に、マウスに冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を経心的に灌流し、血管系から残留染料を除去しました。脊髄は優しく取り出され、標準的な照明のもと、中立的な背景で撮影されました。目視検査では、染料を受けたすべてのマウスでエバンズブルーの背側から腹側にかけて一貫した均一な分布が確認されました。注射量の増加は、前尾軸にかけた染料飽和度の強化と相関していましたが、20μLの注入量を注入したマウスでも強い染色が見られました。対照的に、エバンスブルー染料を投与しなかったマウス(無菌生理食塩水注射の対照群)では、脊髄組織に目に見える色素や背景染色は見られませんでした(図1)。これらの発見は、マウスへのIT注入が脊髄沿いの速やかで再現性の高い溶質の送達を可能にすることを示しています。これらの実験の制約には、色素分布の定量的評価が不足していることや、ASO投与に用いられる10μL注入量での染料分布解析が行われていないことが挙げられます。しかし、ヒトSOD1-G93Aマウスの遺伝子発現レベルでの標的結合測定では、ヒトSOD1特異的遺伝子発現解析を用いて定量化が行われました。ASO投与の後続実験で用いられた10μLの注射量は、マウスでの安全かつ耐容性の高い投与を確保するために選ばれ、先行研究に基づき十分な中枢神経系曝露が期待されています38。
この解剖学的検証を基に、次に変異したSOD1を標的としたIT投与の機能的関連性を評価しました。これはSOD1-ALSモデルにおける検証済みの治療戦略です。ヒト変異体 SOD1 遺伝子を持つヘミ接合同SOD1-G93Aトランスジェニックマウスは、予測可能な運動ニューロン変性と神経筋機能低下を示し、確立された前臨床モデルとなっています。生後5週、症状が現れる前に、マウスはSOD1特異的ASOの100μg濃度で10μLのITボーラスを1回投与しました。この用量は、McCampbellら(2018)が報告したICV投与を用いたマウスでの最適化研究に基づいて選定されました。36。IT投与とICV投与の有効性を比較するため、別のグループに同じASO用量のICV注射を立体定位投与で投与しました。管制部門はIT経路を通じて非アクティブASO(非目標管制)を受け取りました。
治療から5週間後(生後10週)、マウスは軽いイソフルラン麻酔下で複合筋活動電位(CMAP)検査を受けました。標準化された坐骨神経刺激プロトコルによって誘導された後肢筋のCMAP記録は、ITおよびICV治療群の両方で、非活性なASO処理対照群と比較して振幅の有意な保存を示しました(Tukeyの事後検定による一方向ANOVAによるp < 0.0001)。重要なのは、振幅保持はITとICVの投与法で有意な差が見られず(p > 0.05)、神経筋保護が同等であることを示しました(図2A)。
神経細胞の完全性の全身バイオマーカーを評価するため、高感度の電気化学発光アッセイを用いてリン酸化神経フィラメント重鎖(pNFH)の血清レベルを測定しました。注射後5週間の採血時点で採取した血液サンプルでは、ASO処理マウスのpNFH濃度が車両処理対照群と比較して>40%減少(p < 0.0001)を示し、ITおよびICVモダリティ間で有意差は認められませんでした(図2B)。均一な分子バイオマーカー応答は電気生理学的データを裏付けており、このALSモデルにおいてITデリバリーが神経変性プロセスを効果的に緩和していることを示唆しています。
分子レベルでのSOD1-ASOの標的結合を評価するため、解離した頸椎および胸髄脊髄組織に対して逆転写定量PCR(RT-qPCR)を実施しました。全RNAはカラムベースプロトコルを用いて抽出され、高純度(A260/A280>1.8)を確保した後、ランダムヘキマープライミングを用いたcDNA合成を行いました。GAPDHに正規化されたヒトSOD1転写産物を標的とした定量的なPCR増幅では、ITデリブ後に平均60%、ICVデリバート後に35%のノックダウンが示され、いずれも不活性ASO対照群と比較して有意(p < 0.0001)を達成しました。投与経路間の直接比較では、IT投与の方が有意に大きなノックダウン(p < 0.0001)が示され、脊髄への直接アクセスによる標的の関与がより効果的に示唆されました(図3)。他のCNS領域における標的関与を評価するためのさらなる研究が必要です。
これらの包括的なデータは、マウスモデルにおける中枢神経系(CNS)へのASO投与において、IT注射が正確で再現可能かつ低侵襲な技術であることを説得力のある検証としています。IT投与は、神経機能の持続的保存(CMAP)、疾患関連バイオマーカーの正規化(pNFH)、標的中枢神経系領域内のヒト SOD1 転写体の強固な分子ノックダウンなど、幅広いアウトカム指標においてICV投与と同等の治療効果を示しました。これらの発見は、CNS標的ASO治療薬の臨床的に翻訳可能な経路としてのITデリバリーの多様性を強調しており、ICVと同等の有効性を持ちながら、手続きの簡素さと侵襲性の低減を維持できます。したがって、ITとICVの提供はCNS標的介入において同様に有効なアプローチであり、解剖学的アクセス性、手技的実現可能性、治療的文脈に応じて前臨床環境での柔軟性を提供します。これにより、ITデリバリーは将来のCNS標的治療の有望な翻訳プラットフォームとして位置づけられています。トランスレーショナル研究を支援するため、脳脊髄液内の薬理動態分布、さまざまな中枢神経系領域、標的細胞の取り込みを、蛍光の現場ハイブリダイゼーションや免疫蛍光などの技術を用いて、さらなる前臨床研究を行うことを提案します。
図1:成マウスの鞘内注射後のエバンスブルー染料分布の可視化。 エバンス・ブルーダイ(0.5%)は、成マウスに直接鞘内(IT)注射を用いて脊髄分布の質的評価を行いました。20μL、30μL、50μLの3種類の異なる染料体積が、別々の実験群(n=1匹のマウス1匹)で投与されました。注射後、脊髄を採取し洗浄し、組織に沿った染色強度から染料の浸透性を評価するために洗浄しました。脊髄組織の画像は、各注入量に伴う造影剤の拡散の程度を示しており、線量に依存する被覆範囲と染色強度の増大が脊髄全体で増加していることを示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:SOD1を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド療法はマウスの運動機能を回復し、病的な神経フィラメントレベルを低下させる。 成体のSOD1-G93A遺伝子組換えマウスは、生後5週に脊内(IT)または脳室内注射による活性SOD1-ASO(SOD1-ASO)またはIT注射による非活性対照ASOのいずれかを単回投与投与しました。治療効果は生後10週、治療後5週間に相当する時点で評価されました。(A) 複合筋活動電位(CMAP)記録を取得し、治療対象動物の神経筋機能を評価する。SOD1-ASO処理群(n=5 - 6群)では、対照群に比べてCMAP低下が逆転し、機能回復が見られました。(B) 神経変性のバイオマーカーであるリン酸化神経フィラメント重鎖(pNFH)の末梢レベルを、10週目に採取した血清から定量化した(n=5〜8個ずつ)。SOD1-ASO治療は対照群と比較して循環中のpNFHレベルが有意に減少し、疾患関連神経障害の減衰を示唆しました。すべてのデータは±平均標準差(SD)として提示されています。統計的有意性は一方向分散分析(ANOVA)を用いて決定され、その後Tukeyの多重比較検定を用い、p値≤0.0001は治療群間の強固な差異を示しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:SOD1-ASO投与は、トランスジェニックSOD1-G93Aマウス脊髄におけるヒトSOD1 mRNA発現を有意に抑制します。 脊髄内(IT)または脳室内(ICV)注射を通じて投与されるSOD1標的アンチセンスオリゴヌクレオチド(SOD1-ASO)の標的化効率を評価するため、生後10週(投与後5週間)で安楽死させられたSOD1-G93Aトランスジェニックマウスの脊髄組織の頸椎/胸部切片を逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を用いてヒトSOD1 mRNA発現の有無を解析しました。ヒトSOD1転写産物のレベルは、非活性ASO処理群の発現に対して定量・正規化されました。図は各処理群(n=5〜7マウス)におけるヒトSOD1 mRNA(GAPDHに正規化された)のフォールド変化を示しており、SOD1-ASO投与に対する著しいダウンレギュレーションを示しています。データは平均±SDとして提示されます。グループ間の統計的差異は一方向分散分析(ANOVA)を用いて決定し、その後Tukeyの多重比較検定を用い、p値≤0.0001は治療群間の強固な差異を示しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
| 構成要素 | FW | 追加量(Lまたはkgあたり) | 部隊 |
| リン酸ナトリウム単塩基二水和物 | 0.034 | g | |
| リン酸二塩基性ナトリウム無水 | 142 | 0.111 | g |
| 塩化ナトリウム | 58.44 | 8.766 | g |
| 塩化カリウム | 74.56 | 0.224 | g |
| 塩化カルシウム二水和物 | 147.02 | 0.206 | g |
| 塩化マグネシウム・ヘキサハイドレート | 0.163 | g | |
| 水(ミリQ) | 993 | g | |
| ポロクサマー188 | 0.01 | g |
表1:aCSF組成。
補足図1:腰椎鞘内注射のためのマウスの位置。 腹部の下に置かれた湾曲したヘラ(スクープラ)は脊椎を曲げ、椎間隙を広げます。注射はL4-L5またはL5-L6レベルを標的とし、示すように脊椎の内軸に沿って適切な位置を保ちます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
補足ファイル1:ASOの配列と化学。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。
ディスカッション
ここで紹介する直接鞘内注射(IT)技術は、特にマウスのような小型齧歯類モデルにおいて、中枢神経系(CNS)への治療薬を投与するための低侵襲でありながら非常に効果的な方法です。このブラインドスティック手術は技術的には難しいですが、訓練を受けた注射者によって実施されれば再現性があり、臨床的にも関連性があることが証明されています。この方法は精密な解剖学と効率的な技術を用いて、カテーテル挿入を必要とせずに迅速な中枢神経アクセスを提供し、前臨床研究の拡大に大きな利点をもたらす重要な簡素化となっています。しかし、その翻訳的関連性はさらなる定量的評価と標準化された方法論的検証によって改善されるでしょう。
成功するIT導入は、いくつかの重要なステップに依存します。綿密な動物の準備が不可欠です。まずチャンバーで麻酔を誘発し、鼻のコーンで維持し、その後腰椎の毛を剃り、動物の快適さを確保するために鎮痛剤を投与します。マウスの適切な位置取りは、腹部の下に曲がったヘラを置き、脊椎を曲げて椎間隙を広げることで実現されます(補足図1)。ここで説明する鞘内注射の目的は、針の面取りを適切な椎骨レベルで椎板の間に差し込み、腰椎貯水槽内に位置させることです。L4とL5の椎板、あるいはできればL5とL6椎板の間の椎間隙を正確にターゲット化することが、くも膜下腔にアクセスするために極めて重要です5,10。くも膜下腔は、鞘内腔とも呼ばれ、くも膜と39番筋の間に位置しています。脊髄は椎管より短いため、尾端脊髄の節は対応する椎骨レベルに対して前方側により位置しています。あいまいさを避けるため、注射部位は脊髄のレベルではなく椎間空間で示されています。特に、マウスにおける腰椎断肢には、株内および系統間で大きなばらつきが存在することが注目に値します。注射は脊椎の正中線に沿って行う必要があり、外側の偏位を避けるためです。これにより後肢麻痺や重症の場合は脊髄損傷による麻痺が生じることがあります。適切な解剖学的部位で行えば、脊髄損傷のリスクは最小限です。しかし、神経根の刺激や損傷のリスクはわずかに残っており、悪影響を最小限に抑えるためには十分なオペレータートレーニングと手順の熟練度の重要性が強調されています。尾の弾き反射は針の挿入の成功を示す指標となり、インジェクターが深さを判断し、浅い刺入や過度に深い挿入を避けるのに役立ちます。この技術は習得に慣れ、逆流や周囲組織への漏れを防ぐために、深さ、角度、注入量を安定してコントロールする必要があります。注射量は≤10μLを維持することを推奨していますが、最大20μLまでも副作用なく評価しています。過去の研究では、薬物送達に最適な10μLの鞘内注射容積が特定されています。これはマウスの総CSF容積の25〜30%に相当しますが、成体マウスにおける最大許容される鞘内注射容積は30 μL10と報告されています。推奨限度を超える注射量は脳脊髄液(CSF)の動態を乱し、CSF圧力の変化や副作用のリスク増加につながる可能性があります。マウスの総CSF体積は35〜40μLと推定され、1日に12〜13回の回転(41,42)で、ほぼ1.8時間ごとに完全な更新に相当します。CSFの急速な回転や実証的観察、さらに20〜30μLまでの鞘内注射容積を合併症なく安全に使用できることを示す過去の研究を考慮すると、10μLの注射量は副作用を生じさせることは期待されていません10,44。
この手法のスケーラビリティは大きな利点です。習得すれば、訓練を受けた注射者は1時間あたり10〜12頭の動物を治療でき、カテーテル挿入やより侵襲的な手術の手間を避けつつ、より大規模な前臨床試験を可能にします。この手法は複雑な器具を避け、動物のストレスを軽減し、慢性的なカテーテル挿入と比べて回復時間を短縮するため、繰り返し投与が必要な縦断研究に適しています。臨床用量投与をシミュレートするために、マウスを対象に最大4回の投与を8週間間隔で行わせる連続的なIT投与を検証しました。これらの注射は良好に耐容され、苦痛、行動変化、疾患の兆候はなく、複数回のIT治療後にCSF動態や脊髄構造に有意な変化が報告されなかった先行研究と一致している34,45。したがって、我々の研究は適切な間隔で繰り返しのIT投与が可能であり、持続的な標的関与が治療効果を得るために必要であるヒト治療パラダイムに沿ったことを確認しました。私たちの経験では、これらの繰り返しのIT注射は5週から29週までの幅広い年齢層で成功裏に実施されました。年齢や体重の増加は皮下組織の増加により脊髄のアクセス性に若干影響を与えることがありますが、熟練した操作者と針の挿入感に慣れた技術者であれば、効果的な投与は依然として可能です。しかしながら、注入部位やボーラス容量以外にも、注入速度や注入溶液の物理的特性(CSFに対する密度など)がCNS内の溶質分布に大きな影響を与えることを指摘します。これらのパラメータは本研究では直接測定または操作されていませんが、Linningerら(2023)による最近の研究は、メカニズム的薬物動態モデルを通じて、これらの要因が鞘内アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の生体分布および組織標的に有意に影響を与えることを示しています。したがって、本研究の限界として認識し、注入速度と溶液の特性をCNSの送達と翻訳関連性の最適化に向けた今後の重要な変数として強調します。これらの結果は、複数回量前臨床パラダイムにおける繰り返しIT投与の信頼性と実現可能性を強調し、持続的なターゲット結合やヒト治療レジメンのトランスレーショナルモデリングへの利用を支持しています。
ITアプローチは治療試験においても柔軟性を提供します。ASOs、小分子、ペプチド、ウイルスベクターなど幅広いモダリティに対応し、CNS標的介入の直接評価を可能にします。治療薬を正確に制御された量で腰椎貯水槽に届ける能力は、効果的な脊髄とより広い中枢神経への曝露を確保しつつ、全身への波及を抑えます。尾の弾き反射やその他の手がかりにより、鞘内投与の成功をリアルタイムで検証でき、再現性をさらに高め、実験の失敗率5,6,8,47を低減します。
SOD1-G93Aマウスを対象とした以前の研究では、この病態が特に腰椎領域に皮質よりも顕著に影響を及ぼしていることが示されました29,48。したがって、この技術は特にSOD1-ALSの文脈で重要です。SOD1-ALSは、スーパーオキシドジムターゼ1(SOD1)遺伝子の変異によって引き起こされるALSの遺伝的形態です。これらの変異は誤った折りたたみたたみのSOD1タンパク質集合体を生じさせ、運動ニューロン内で機能の毒性向上を引き起こし、進行性の神経筋低下を引き起こします49,50。本研究では、SOD1標的ASOを用いて標的mRNAへの成功した結合と機能回復を示しました。RT-qPCR解析では、IT投与後の脊髄におけるヒトSOD1転写物の有意な抑制が示され、CMAP記録では運動ニューロン機能障害の逆転が示されました。さらに、血清解析ではリン酸化ニューロフィラメント重鎖(pNFH)レベルが低下し、これは神経変性のバイオマーカーであり、治療戦略の有効性を裏付けました。
このモデルの臨床的意義は、SOD1-ALS35の治療のためにSOD1 mRNAを標的とするASOであるtofersen(QALSODY)®の最近のFDA承認によって強調されています。トーファーセンはSOD1-ALS患者に脊体内投与され、標的結合の間接マーカーである総CSF SOD1タンパク質レベルおよび血漿NfL(軸索損傷および神経変性のマーカー)の減少を含む明確な薬理動態活性が示されています。第3相VALOR試験およびそのOLEの統合解析において、トファーセン治療の早期開始は臨床機能、筋力、生活の質の指標の低下と死亡相当事象のリスク低下と関連している35。これらのデータは、中枢神経系標的ASO療法の強力な手段として鞘内経路を裏付け、同様の投与戦略を用いた前臨床研究に強いトランスレーショナルな信頼性を与えています。
ALSでの有用性に加え、IT経路は脊髄性筋萎縮症(SMA)14,51,52で成功を示しており、IT投与のASO Nusinersen(Spinraza®)が最初の承認治療法であった14,51,52。IT注射は血脳関門を回避し、広範囲にわたる中枢神経系の生体分布を可能にします。これはびまん性神経病理を特徴とする疾患にとって重要です。繰り返し投与は物流面や耐容性の課題を伴いますが、製剤や投与技術の進歩により、IT投与は長期治療においてより現実的になっています。
IT投与はICV注射よりも人間の臨床実践においてより大きなトランスレーショナルな関連性を提供します。成体マウスにおけるICVおよびIT注射は、主に中枢神経系内の標的位置と、投与される物質の分布や効果に違います。ICV注射は、主に脊髄上部を標的とした脳外側脳室内の脳脊髄液(CSF)に直接物質を送達します。これに対し、IT注射は主に脊髄を標的とした脊髄軟膜下腔内のCSFに物質を供給します。両方法とも血脳関門を迂回し直接中枢神経系の送達を可能にしますが、IT投与は一部の化合物で作用 時間を長くし、脊髄での伝達がより強くなる傾向があります。一方、ICVは側心室に隣接する脳領域で局所的に高濃度を得ることができます54。ただし、脊髄液に投与された化合物は脳に到達できますが、輸送速度は非常に遅いです。これらの違いは手続き上のリスクにも反映されています。ICV注射は無菌性が損なわれた場合の汚染リスクが高い一方で、IT注射はリスクが全くないものの、デバイス関連の脆弱性は少ないです。術後のIT注射は一時的な不快感や後肢関連反応を引き起こすことがありますが、ICV注射は即時的な不快感が少ないものの、局所的な頭蓋刺激は残る可能性があります。
この技術の今後の応用は、現在の前臨床研究を超えて広がっています。ITデリバリーは、遺伝子編集ツール(例:CRISPR/Casシステム)、RNA干渉モダリティ、ウイルスベクターベースの遺伝子治療を含む次世代CNS標的治療薬の評価に活用できます。このアプローチは複数の中枢神経系経路を標的とした併用療法にも適応可能であり、薬理力学的相互作用のリアルタイム評価を可能にします55,56。さらに、IT管理は画像診断モダリティと統合され、分布やターゲットエンゲージメントをin vivoで追跡できるため、トランスレーショナルパイプラインの加速が可能となります。この技術はまた、神経疾患の遺伝子定義マウスモデル間で精密医療戦略を研究するプラットフォームを提供し、バイオマーカーの発見、縦断的な機能評価、臨床翻訳前の安全性評価を促進します。
結論として、イソフルラン麻酔を用いた直接腰椎IT注射技術は、低侵襲で迅速かつ臨床的に翻訳可能なマウス中枢神経系への治療投与方法を示しています。SOD1-ALSモデルでの成功した応用とシリアルドージングとの互換性は、トランスレーショナル神経科学研究におけるより広範な展開の強固な基盤となっています。CNS遺伝子調節、RNA標的治療、精密医療への注目が高まる中、ITルートは前臨床モデルと臨床成功をつなぐ重要な薬物送達戦略として今後も重要な役割を果たし続けるでしょう。
開示事項
SMとS-C Lは現在Biogen, Inc.の従業員であり、TC、DF、YL、JD、MZは元従業員です。本記事で論じたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ionis Pharmaceuticalsから著者に提供されました。トーファーセン(QALSODY)は、バイオジェンとアイオニス・ファーマシューティカルズが共同開発した製品です。
謝辞
記事で説明したASOを供給してくれたIonis Pharmaceuticalsに感謝いたします。Biogenのライアン・ギャンブル、スティーブ・ガラファロ、アドリア・マルティグ、イザベル・イサザ、タラス・トゥチュケヴィチ、デイビッド・コスケの専門家のご協力により、実質的な改訂を通じて原稿が大幅に向上したことに感謝します。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.3 mL 29 G、1/2インチのインスリン注射器 IT注射用 | スミス・メディカル | 4429-3 | |
| 直径0.5mmの無菌ドリルバリ | ファインサイエンスツール(FST)または同等のもの | 1900705 | |
| 5-0 プロリーン・モノフィラメント縫合線 | エティコン | 8870H | |
| アルコールスワブスティック | ダイナレックス | 1203 | |
| アルコールスワブスティック | ダイナレックス | 1203 | |
| 鎮痛剤 - ブプレノルフィン緩放型 | 処方箋が必要です | ||
| 動物クリッパー | ワール | 08787-450A | |
| Applied Biosystems 高容量cDNA逆転写キット | フィッシャー・サイエンティフィック | 43-688-14 | |
| ビードラプター24ホモジナイザー | オムニ・インターナショナル社 | 19-070 | |
| 血液採取および血清分離チューブ | ベックトン・ディキンソン(BD) | 365967 | |
| 塩化カルシウム二水和物 | JT・ベイカー | 1335 | |
| デジタルシリンジポンプ | ハーバード・アパラタトゥス | 70-4507 | |
| エラ自動免疫測定システム | R&Dシステムズ | 600-100 | |
| 眼軟膏-プラルーブ | デクラ | 17033-211-38 | |
| ジェノ/グラインダー | SPEX サンプル準備 | 2010 | |
| Germinator 500 ドライ滅菌器 | ブレインツリー・サイエンティフィック、または同等の組織 | GER 5287-120V | |
| ハミルトン注射器(針付き)(26s/2"/2(ポイントスタイル) | ハミルトン | 80300 | 26s/2"/2: 26秒:26G; 長さ2インチ; 2:ポイントスタイル |
| 硬質組織均質ミックス 2.8 mm セラミック(2 mL強化チューブ)(50/pk) | フィッシャー・サイエンティフィック | 50-280-9286 | 供給元:Revvity Health Sciences Inc |
| ヒーティングパッド | K&H製造 | 1060 | |
| ICVプラットフォーム | ストールティング | 502063 | |
| 除去システムを備えたイソフルランチャンバー | VetEquip | 901820 | |
| 塩化マグネシウム・ハイハイドレート | EMDケミカルズ | 1.05832 | |
| メッツェンバウム・シザーズ | ファインサイエンスツール(FST)または同等のもの | 14016-14 | |
| マウスGAPDH TaqMan Assay ID Mm99999915_g1 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4331182 | |
| CMAP用の針電極、28 G | ナタス・メディカル(ブランド、テカ) | #902-DMF25-TP | |
| NutraGel:完全栄養 | バイオ・サーブ | NGB-2 | |
| オルセン・ヘガー針ホルダー | ファインサイエンスツール(FST)または同等のもの | 12502-12 | |
| ポロクサマー188 | マッチラー | ||
| 塩化カリウム | JT・ベイカー | 3045 | |
| プリアンプ(CMAP用) | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI) | SYS-DAM50 | |
| ProteinSimple pNFHキット | R&Dシステムズ | SPCKB-PS-000519 | |
| プロビドン-ヨウ化物スワブスティック | ダイナレックス | 1201 | |
| QIAzol溶解試薬 | キアゲン | 79306 | |
| QuantStudio 12K Flexシステム | 応用バイオシステム | 4471087 | |
| スクープラ | フィッシャーブランド | 01-257-567 | |
| シグナル v6.04 | ケンブリッジ電子設計 | シリアルナンバー 061144 | CMAPソフトウェア |
| 小動物回収室 | サーモケア携帯型動物集中治療ユニット モデルFW-1 | FW-1 | |
| デジタルディスプレイコンソールを備えた小型動物の立体誘導フレーム | KOPF | モデル940 | |
| SOD1 G93Aマウス | ジャクソン研究所 | ストック # 004435 | |
| 塩化ナトリウム | EMDケミカルズ | 1.16224 | |
| リン酸二塩基性ナトリウム無水 | シグマ・オルドリッチ | 55136 | |
| リン酸ナトリウム単塩基二水和物 | シグマ・オルドリッチ | 3819 | |
| 滅菌使い捨てメス | メッドベテナショナル、または同等の団体 | MIL4410 | |
| 無菌ドレープ | ダイナレックス | 4410 | |
| 滅菌ガーゼパッド | ダイナレックス、または同等のもの | DRX-3354 | |
| 無菌生理食塩水 | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 14190094 | |
| 滅菌手術用手袋 | アンセル、または同等のもの | 20277290 | |
| 刺激アイソレーター(CMAP用) | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI) | SYS-A365D | |
| ストールティング・マイクロドリル | ストールティング | 58610 | |
| 外科用湾曲鉗子(Graefe 鉗子 - チタン製) | ファインサイエンスツール(FST)または同等のもの | 11652-10 | |
| 外科用スタンプス(Graefe 鉗子 - チタン) | ファインサイエンスツール(FST)または同等のもの | 11650-10 | |
| 手術用テープ | ダイナレックス、または同等のもの | 3572 | |
| 鎮痛剤の皮下注射用注射器 | BD | 309582 | |
| TaqMan ファストアドバンスドマスターミックス | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4444556 | |
| 水(ミリQ) | |||
| 体重計 | トレドのメットラー モデルXSR2002S | 23-112795 | |
| 野生型C57BL/6Jマウス | ジャクソン研究所 | ストック # 000664 |
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