ジトニン透過化されたBE(2)-C神経芽細胞における酸化リン酸化結合のコリン作動位子依存性調節

Summary

本研究では、細胞膜を選択的に透過させるプロトコルを提示し、基質や阻害剤の標的的送達を可能にすることで、培養細胞におけるミトコンドリア酸化リン酸化(OXPHOS)を評価し、通常は分析を妨げる形質膜輸送障壁を克服します。この技術を用いて、OXPHOSの機能がムスカリン作動薬およびアンタゴニストによって調節されることを示しました。

Abstract

本研究の目的は、培養細胞における酸化リン酸化(OXPHOS)機能を、定義された基質阻害剤の組み合わせを用いて評価しつつ、単離ミトコンドリア製剤で失われた細胞構造と細胞質的文脈を保持することでした。完全な細胞は複数のクレブス回路中間体への透過性が低いため、特定の電子伝達連鎖(ETC)経由した基質支持呼吸の直接評価は限られています。これを克服するために、ディトニン媒介の選択的細胞膜透過化を適用し、BE(2)-C神経芽細胞瘤細胞に対して細胞外フラックス分析装置を用いた結合および電子流アッセイを実施しました。細胞型依存性を調べるため、ジトニンはHEK293細胞およびラット背根神経節(DRG)ニューロンにスクシネート+ロテノンを用いて経験的に滴定し、複合体II–IV駆動呼吸を分離しました。

コンプレックスI阻害によるスクシネート支持呼吸は、透過性細胞で非透過性細胞と比べて複合体II–IV駆動酸素(O₂)消費量が増加し、膜非浸透基質のミトコンドリアへのアクセス改善と一致しました。対照的に、内因性輸送経路(例:ピルビン酸/マラー酸)を介して基質に入る呼吸は、条件間でより小さな差が見られました。このプラットフォームを用いてムスカリン配位子を試験したところ、結合アッセイでは作動薬とアンタゴニスト関連のO₂消費量の違いが観察されましたが、電子フローアッセイでは試験条件下で配位子関連効果が最小限に見られました。これらの発見は、検出可能なリガンド効果が最大電子移動能力よりも結合定義呼吸状態のレベルでより顕著であることを示しています。全体として、選択的透過化は培養細胞の生体エネルギーアッセイにおける基質へのアクセスを拡大し、ミトコンドリア呼吸の薬理学的調節の解析を可能にします。

Introduction

ミトコンドリアエネルギー代謝の機能不全や再プログラムは、神経変性、がん、炎症性疾患、心臓代謝疾患、さまざまな遺伝性疾患など、幅広い疾患の中心的な存在です。ミトコンドリア代謝が疾患の病因に果たす役割をよりよく理解するために、いくつかの分析戦略が開発されています。これには、_O2消費率(OCR)、細胞外酸性化率(ECAR)、ATP定量、基質利用、プロファイリングまたはクレブスサイクル代謝物解析、同位体トレーシング¹の測定が含まれます。これらの技術の中で、OCRはミトコンドリア呼吸の重要な指標として機能し、高解像度呼吸計(HRR、例:Oroboros O₂k)²、クラーク型電極、細胞外フラックスアナライザーなどの機器を用いて評価できます

Oroboros O₂kシステムは、Clark型ポラログラ_フィーO2センサー(POS)^3,4,5を用いて密閉チャンバー内の_O2濃度を測定し、単離ミトコンドリア、透過性細胞、組織均質物質などのサンプルに適しています。この膜は、金/プラチナカソード、銀アノード、そして25μm_の透水性かつ化学的に耐性のあるフッ素化エチレンプロピレン膜(FEP)によって試料から分離されたKCl電解質リザーバーで構成されています。クラーク型電極³は密閉チャンバー内で動作し、_O2感応電極を介して_O2濃度の変化を検出し、単離ミトコンドリアや細胞懸濁液に一般的に使用されます。これに対し、細胞外フラックスアナライザーはマイクロプレートに埋め込まれた蛍光センサーを用いて、生の付着細胞や単離ミトコンドリアのOCRおよびECARを定量化し、高スループットの代謝プロファイリングを可能にします。細胞外フラックス分析装置プラットフォームの実用的な利点は、複数の条件下で並行して自動化されたマルチパラメトリック評価が可能であるのに対し、クローズドチャンバーシステム(例:HRRやクラーク型電極)は一般的にスループットが低く、より多くの手動操作を必要とします。

細胞外フラックスアナライザーは、マイクロプレートの底に沈着する完全な付着細胞や懸濁細胞のミトコンドリア機能を評価するのに特に有用です。完全な付着細胞を用いたアッセイでは、グルコースやピルビン酸⁶などの基質を用いてミトコンドリアのエネルギー代謝をプロファイリングできます。あるいは、少量の濃縮ミトコンドリア画分を用いたアッセイにより、基礎呼吸、ADP刺激呼吸(状態3)、安静呼吸(状態4)、および基質と阻害剤の組み合わせを用いた非結合刺激呼吸の連続測定^{が可能です7。}しかし、完全な細胞系では、細胞透過性のないトリカルボン酸(TCA)サイクル代謝物は、その代謝を直接評価することはできません。一方、単離ミトコンドリアは細胞膜障壁が存在しないため、これらの代謝物の使用を可能にします。単離された濃縮ミトコンドリアバイオエナジェティクスアプローチの解析には限界があります。すなわち、分離中にミトコンドリア構造が変化する可能性があり、ミトコンドリア代謝や代謝物輸送に影響を与える細胞質因子が減少または欠如することがあります。したがって、選択的透過化アプローチは、細胞構造の一部を保持しつつ、ミトコンドリアへの制御されたアクセスを可能にする妥協案としてよく用いられます。代謝アッセイにおいて、完全な細胞または単離ミトコンドリアのいずれかを用いる制限を克服するため、本プロトコルはディジトニンを用いた付着性神経芽細胞腫(BE(2)-C) 細胞の透過化方法を記述しています。このアプローチにより、細胞に非浸透しない代謝物が細胞膜を越えて持ち込まれることを容易にしつつ、定義された基質や阻害剤に対する機能的なミトコンドリア応答を維持します。

ディトニンの選択性は膜脂質組成の違いに基づいています。細胞膜はコレステロールが豊富であるのに対し、ミトコンドリア膜、特に内側のミトコンドリア膜は非常に少ないコレステロールを含^{んでいます。}低濃度では、コレステロール含有量が高いため、ディトニン(またはサポニン)が選択的かつ完全に細胞膜を透過しますが、ミトコンドリア膜は高濃度でのみ影響を受けます(^9,10)。デジトニンはコレステロールに結合し、細胞膜に孔を形成することで、適切に最適化されればTCAサイクル中間体のような小分子がミトコンドリアの構造や機能を破壊することなく細胞質に入ります。この方法は、細胞外フラックス解析器マイクロプレート上で再現可能に接着単分子層としてプレートできる培養細胞に最適であり、各細胞タイプとシーディング密度ごとにディジトニン濃度の経験的滴定が必要です。ミトコンドリアの完全性の維持の運用指標には、強靭で阻害剤感受性のOCR応答(例:ロテノン/アンチマイシンAでの期待される減少や、アスコルビン酸/TMPDによるIV駆動呼吸の完全な状態)、および過剰浸透を示すOCR崩壊の欠如が含まれます。したがって、ディジトニン最適化は実験比較前に実施し、培養条件や細胞密度の変化時に繰り返し行うべきです。さらに、最適なディジトニン濃度は細胞タイプによって異なり、非物質基質(例:スクシネート)が侵入しつつ阻害剤感受性ミトコンドリア機能を維持するための透過性ウィンドウを確立するために経験的に決定する必要があります。本研究では、BE(2)-C細胞だけでなく、HEK293細胞およびラットの一次背根神経節(DRG)ニューロンでもディトニンを最適化することで、この原理を示しました。

このプロトコルは、元々男性の神経芽細胞腫患者の脳から単離されたBE(2)-C神経芽腫細胞を用いて実証されました。BE(2)-C細胞は様々なムスカリン受容体を発現し、特にコリン作動性受容体ムスカリン1型(CHRM1)を発現します。これまでの研究では、CHRM1が培養ラットの背根神経節ニューロンの細胞体および神経質細胞、さらにCHRM1をトランスフェクトしたHEK293細胞¹¹においてミトコンドリアと関連していることを示しました。さらに、マウスにおけるChrm1の遺伝的欠失はミトコンドリア構造と機能の複数の側面を変化させます(^12,13)。したがって、BE(2)-C細胞はムスカリン配位子がOXPHOS機能に及ぼす調節効果を調査するために用いられると仮説を立てます。本実証では、アゴニストであるアセチルコリン、バイアスされたアンタゴニストピレンゼピン¹⁴、アンタゴニストであるアトロピンなどのムスカリン系薬剤が、スクシネートまたはピルビン酸/マラートを基質として基質として存在した場合にミトコンドリア呼吸に与える影響を調べ、その影響を比較しました。

Protocol

1. 解凍と初期メッキ

注:BE(2)-C細胞のベース培地は、ATCCで調合されたEagle's Minimum Essential MediumとF12 Mediumを1:1で混合し、10%胎児用牛血清(FBS)を補っています。

1. 37°Cの水浴で凍結したBE(2)-C細胞を解凍します。解凍後、細胞を200× gで5分間遠心分離してクライオプロテクティブを除去します。
2. 細胞ペレットを完全な培養培地に再懸浮させ、10cmの細胞培養皿に細胞をプレートします。培養液は37°Cの加湿インキュベーターで、空気中のCO₂5%を含み、細胞がサブコンフレンシーに達するまで培養します。

2. サブカルチャリング

1. 細胞を2〜3回のサブカルチャーで、安定した指数関数的成長相に到達させます。

3. トリプシン化および単細胞懸濁調製

1. 培養が60〜80%のコンフルーシティに達したら、細胞をトリプシン化します。細胞懸濁液を研磨された細かい先端の転移ピペットに数回通し、塊を解離して単一細胞懸濁液にします。
2. トリプシンを中和するためにFBSを含む新鮮な培地を加えます。細胞を200× g で5分間遠心分離してペレット状にします。

4. 細胞外フラックス分析装置で使用される24ウェル細胞培養マイクロプレートの細胞シーディングプロトコル

1. ペレットを完全な培地に再懸浮させ、最終濃度は100μLあたり100μLあたりです。
2. 細胞を最適な密度で播種し、1〜2日以内に完全な結合に達するようにします。実験設計によっては、4つの角井戸または1つの角井戸を空にしておく。これらの井戸は背景管理として機能します。
   注意:これは試行錯誤が必要で、メディアの音量やタイミングの調整も含まれます。
3. 培地の色の変化をモニタリングしてください。黄変はpHの低下を示し、細胞の健康を維持するために即時に新しい培地に交換する必要があります。

5. 細胞外フラックス分析装置を用いたアッセイの準備

注:ここで用いる結合および電子流アッセイ形式は、確立されたマイクロプレートベースのミトコンドリア呼吸^{ワークフロー7}に従い、ディジトニン滴定やムスカリンリガンド処理条件を用いたBE(2)-C細胞の透過化を含む修正が加えられています。

1. ストック溶液と2つのミトコンドリアアッセイ溶液(MAS)を準備します。事前に2つのMAS混合物と作動試薬(基質および阻害剤)のストック溶液を準備してください( 表1、 表2、 表3参照)。
2. すべての在庫溶液とMASは-20°Cで保存し、将来の使用のために効率的なアッセイセットアップを可能にします。
   安全性: ロテノン、アンチマイシンA、オリゴマイシン、FCCP、ジトニン、TMPDは有害であり、施設の安全ガイドラインに従って取り扱うべきです。すべての阻害剤ストック溶液は、適切な個人用防護具(白衣、ニトリル手袋、眼を保護する)を着用しながら、認証済みの化学煙処理フード内で準備・取り扱いされるべきです。これらの試薬を含む溶液およびDMSO含有廃棄物は、機関および地域の規制に従い、有害化学廃棄物として収集・処分されるべきです。作業面は使用後に除染されるべきです。
3. センサーカートリッジの水分補給
   1. 実験前夜、細胞外フラックスアナライザーのセンサーカートリッジに各ウェルにセンサーカートリッジの校正バッファーまたはリン酸塩緩衝生食塩水(PBS、pH 7.4)を1mL加して水和します。センサーカートリッジは室温(20〜25°C)で一晩(12〜18時間)放置します。
      注:37°Cの非CO₂インキュベーターでの培養は不要で、カートリッジは装填中に室温に平衡します。細胞外フラックス分析装置に投入して校正すると、カートリッジは約15分以内に37°Cに達します。

6. 実験当日

注意:すべての溶液を新鮮に準備し、必要に応じてpHを調整し、使用まで氷で保管してください。

1. 凍結基質ストックとMASを室温(20–25°C)で15〜30分解凍し、37°Cの水浴で5〜10分解凍します。
2. すべての基質溶液と注入液を準備し( 表4、 表5、 表6、 表7参照)、pHが7.4であることを確認しましょう。必要に応じて調整し、使用までは溶液を氷に保管しておきましょう。カップリングアッセイには 表4 と 表5 を用いてください。電子フローアッセイについては、 表6 と 表7を用いてください。
3. 阻害剤と基質を適切なセンサーカートリッジポートに装填し、アッセイの実行準備をしてください。アッセイの種類(結合アッセイまたは電子フロー ^アッセ イ7)に応じて、必要に応じて 表4 と 表5 、または 表6 と 表7を参照してください。
4. すべての基質および阻害剤の作動液を定められた最終体積(バルクミックス:15 mL、カートリッジ注入ミックス:1ポートあたり2 mL)を準備します。注入後の最終井戸濃度(最終井体容量:ポートD後700μL)を達成するための濃度を計算します。
5. ムスカリン配位子を含む24ウェルの細胞外フラックスアナライザープレートの各ウェルに、準備済みアッセイ溶液450μLを加えます(最終リガンド濃度:1μM;ウェル全体体積:500μL)。各ウェルにはすでに50μLの1×MASバッファーと浸水セルが入っていることを確認してください。
   注意:この工程はプレートをアナライザーに積み込む直前に行ってください。
6. 各準備試薬をセンサーカートリッジの対応する注入ポートに50μLずつ装填します。

7. 機器プログラミングおよびアッセイ実行

1. 実験の少なくとも1〜2時間前に細胞外フラックス分析装置を起動し、内部インキュベーターを37°Cで安定させてください。 校正およびアッセイ実行中はチャンバー温度を37°Cに保ちます。
2. 分析装置を表 8に従って適切な混合、待機、測定サイクルを実行するようプログラムします。
3. ソフトウェア内でウェルと実験グループに実験設計に従ってラベル付けします。
4. アッセイランを始めてください。計測器がセンサーカートリッジのキャリブレーションを行わせます(~15分)。
5. カートリッジ校正中に装填用のアッセイプレートを準備してください。必要に応じて装填を遅らせること;センサーカートリッジは機器内で37°Cで安定します。
6. ポートD注入後の最終測定サイクルが終了したらアッセイを完了します。直ちにアッセイ後の正規化とデータ解析に進みます。

8. 細胞外フラックス分析装置アッセイのための細胞プレート準備

1. センサーカートリッジをアナライザーに入れて校正後、すぐにセルプレートの準備を開始します。接着細胞を含む各ウェルに1xMASバッファー700μLを加えます。室温(20〜25°C)で1分間培養します。
2. 結合した細胞を乱さないように慎重にバッファーを吸引してください。洗う手順を少なくとも3回1分繰り返し、残留培地を除去し、10分以内にすべての洗濯を完了させます。
3. 指定された背景井戸(セルなし)に1倍のMASバッファ50μLを追加し、視覚的な体積参照を確立します。
4. 実験井戸からバッファーを吸引し、各ウェルに約50μLの残留バッファーを残します。
5. 37°Cの水浴で培養し、蒸発を防ぐために水面上に保ちます。37°Cで10分間(最大20分)維持してから積み込みます。
6. プレートをロードする直前に、各ウェルに適切な基質を含む1×MASバッファー450 μLを加え、最終体積500 μLにします。
7. プレートを細胞外フラックス分析装置に挿入してください。

9. 分析およびデータ分析の終了

1. 実行完了後、セルプレートとセンサーカートリッジをアナライザーから取り外します。
2. 全タンパク質定量または総細胞数を用いて、ウェルごとのOCR値を正規化します。RIPAバッファーを用いた溶合細胞をブラッドフォードアッセイまたは他の分光光度タンパク質アッセイで総タンパク質を定量します。
3. 分析ソフトウェアを使ってOCR値を正規化し、必要に応じてデータをエクスポートします。
4. 以下の受容基準を適用してください:ベースラインOCRの安定性(連続した2回の測定サイクルで≤15%のドリフト)を確認し、ロテノン、オリゴマイシン、または抗マイシンA注射後のOCR減少≥60%を確認します。
5. これらの基準に満たないランは除外し、必要に応じて透過剤濃度や細胞シーディング密度を再最適化します。

10. 結果の輸出

1. USBドライブを楽器に差し込みます。
2. アッセイデータをエクスポートします。

11. データ処理

1. 計器ソフトウェアを使ってデータを分析してください。
2. 処理済みデータを、選択した解析ソフトウェアに対応した形式でエクスポートし、さらなる分析と可視化を行います。

Results

結合アッセイにおけるBE(2)C細胞透過化のためのディジトニン濃度の最適化
このプロトコルの開始時に、ミトコンドリア呼吸を損なうことなく効果的な細胞透過化に必要な最適なディジトニン濃度を標準化しました。このプロトコルでは、5μMおよび10μMのディトニンを開始濃度として検査し、結合アッセイを実施しました。このアッセイはETCとOXPHOS機構の結合度を評価し、ETC駆動呼吸とOXPHOS駆動呼吸を区別することを可能にします。ロテノンは複合体Iを阻害するために用いられ、スクシネートは複合体IIへの電子供与体として機能し、錯体IIからIVへの電子流を促進し_{、酸素消費}を支えました(図1A)。複合体II–IVによる基底呼吸は、10μMのディジトニンで5μMより有意に高く、高濃度では透過性細胞膜を越えたサッカーシネート輸送がより効率的に行われることを示唆しています(図1A,B)。

Discussion

本研究は、培養神経芽腫細胞におけるムスカリンリガンド媒介によるOXPHOS調節を評価する迅速かつ費用対効果の高いプロトコルを導入します。選択的形質膜透過器であるディトニンを用い、定義された基質阻害剤対を組み合わせることで、スクシネートなどの代謝基質をミトコンドリアの原 位に直接標的的に送達することを可能にします。このアプローチは、通常、主要なTCAサイクル中間体へのアクセスを制限する完全な細胞膜の限界を克服します。重要なのは、このプロトコルが細胞構造と細胞質間相互作用を保持し、神経変性疾患モデルに関連する薬物治療を含む様々な実験条件下でのミトコンドリア機能を評価する生理学的に重要なプラットフォームを提供していることです。

成功の最も重要な決定要因は、特定の細胞型とシーディング密度に対するディトニン濃度の経験的最適化です。この細胞型依存性を裏付けるため、最適なディジトニン濃度は細胞タイプによって大きく異なることが観察されています。例えば、HEK293細胞は約15μMのディジトニンで最大限のスクシネー...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセチルコリン塩化物	ミリポーアシグマ	A6625	ムスカリン作動薬
ADP	MPバイオメディカルズ株式会社	ICN19014901	電子受容体、ATP合成の基質。
アンチマイシンA	AAJ63522MA	サーモ・サイエンティフィック	ミトコンドリア複合体IIIを阻害します
アトロピン	ミリポーアシグマ	1044990	ムスカリン系抗抗薬
Be2Cセル	アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション	CRL-2268	神経芽腫の男性患者の脳から単離された神経芽細胞は、ムスカリン受容体を発現します
デジトニン	ミリポーアシグマ	D141	穏やかな洗剤、膜の透過剤。
D-マンニトール	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	AA3334236	浸透圧安定化や膜保護に使われる非代謝性糖アルコール
EGTA	ミリポーアシグマ	E0396	カルシウムキレートは、ミトコンドリアタンパク質を分解する可能性のあるカルシウム依存性プロテアーゼやその他の酵素の活性化を防ぎます。
脂肪酸フリーBSA	ミリポーアシグマ	126575	制御不能な脂肪酸の影響を防ぎ、ミトコンドリアを安定させる
FCCP	ケイマン・ケミカル	NC0904863	ミトコンドリアにおける酸化的リン酸化のプロトノフォアおよびアンカップラー
ヘペス	ミリポーアシグマ	391340	pHバッファリング、ミトコンドリア機能との適合性
L-アスコルビン酸	TCIアメリカ	A053925G	TCAサイクル中間体、OXPHOSの基質
塩化マグネシウム	ミリポーアシグマ	M8266	イオンバランスのために、酵素活性の支援
N1,N1,N1,N1-テトラメチル-1,4-フェニレンジアミン(TMPD)			シトクロムcへの電子ドナー、複合体IおよびIIをバイパスして複雑なIV機能を評価すること、TMPD/アスコルビン酸は複合体IV依存性酸素消費の直接測定を可能にします
オリゴマイシン	ミリポーアシグマ	1404-19-9	ミトコンドリアATP合成を阻害する、複合体V
ピレンゼピン・ジヒドロクロライド	ミリポーアシグマ	P7412	ムスカリンバイアス作動薬
ピルビン酸	サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ	AC132155000	TCAサイクル基板
ロテノン	ミリポーアシグマ	557368	ミトコンドリア複合体Iを阻害します
シーホースXF24 V7 PS細胞培養マイクロプレート	アジレント	102340-100	細胞培養マイクロプレート
シーホースXFe24アナライザー	アジレント	S7801BR	Agilent Seahorse XFe24分析装置は、24ウェルプレート形式で生細胞の酸素消費率(OCR)および細胞外酸性化率(ECAR)を測定します。
スクシン酸	フィッシャー・ケミカル	AC158742500	TCAサイクル中間体、OXPHOSの基質
XFe24センサーカートリッジキャリブレーションバッファ	アジレント	102340100	PBSバッファーpH 7.2
XFe24センサーカートリッジ	アジレント	102340-100	OCRおよびECAR測定用のセンサー