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方法論記事

ドーパミン放出の 体外 記録のための高速スキャンサイクリックボルタメトリー

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DOI:

10.3791/69790

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2026年3月17日

 ,  , 
1Department of Clinical and Biomedical Sciences, University of Exeter Medical School, Hatherly Laboratories

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

高速走査サイクリックボルタンメトリー(FCV)は、カーボンファイバー微電極を用いてサブ秒分解能で急速なドーパミン動態を測定します。このプロトコルは、急性マウス脳スライスにおけるFCV(FCV)を説明し、電極の製造、スライス準備、校正、刺激ベースのアッセイを含み、生理的条件下でコリン作動性中間ニューロンがどのように線条体ドーパミン放出を調節するかを調べます。

要約

高速スキャン環状ボルタンメトリー(FCV)は、ドーパミン(DA)、ノルエピネフリン、セロトニンなどの酸化不能性神経伝達物質を、サブ秒単位の時間分解能でリアルタイムで検出できる電気化学的技術です。炭素繊維微電極に高速走査型の三角形電圧波形を適用することで、FCVは細胞外神経伝達物質濃度の急速かつ一時的な変化を非常に高感度に時間的精度で測定することを可能にします。これにより、FCVは高速な神経調節シグナル伝達イベントの記録に特に適しています。本記事では、 生外 マウス脳スライスにおける誘発性DA放出を測定するためのFCVの応用について説明します。このプロトコルは、カーボンファイバーマイクロ電極の製造、急性脳スライス準備、電極調整、データ取得、そして電流信号を絶対DA濃度に変換するための事後校正の重要なステップを示しています。選択的β2を含むニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)のジヒドロβエリスロイジン(DHβE)を用いて、nAChR活性が線条体DA放出に強力な調節的影響を与えることを示しました。本研究は、FCVが脳領域をまたぐモノアミン伝達を調査する強力なアプローチであることを強調しています。

概要

高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FCV)は、電気活性神経伝達物質の急速な変動を監視するために開発された電気化学的技術です。従来のサイクリックボルタンメトリーが遅いスキャン速度を用いるのに対し、FCVはマイクロメートルスケールの炭素繊維マイクロ電極を通じて、通常400 V/sの高速走査速度で三角形ポテンシャル波形を適用し、神経伝達物質濃度をサブ秒単位で測定することを可能にします。これらの高いスキャン速度は大きく安定した背景充電電流を発生させ、これをデジタルで引き算して神経伝達物質の酸化および還元反応によって生じるファラーダイ電流を分離できます。

FCVは特定の脳領域における細胞外神経伝達物質濃度のリアルタイム測定を可能にし、高い時間分解能と適度な化学的選択性を提供します4。これらの特徴により、FCVは自由に動く動物や麻酔下の動物、急性脳切片5、6、7を含むin vivoおよびex vivoの急速な神経化学シグナル伝達の研究に適しています。この技術にはいくつかの利点があります。(1) 制御された刺激プロトコルを用いて、明確なドーパミン作動性反応を誘発できること;(2) 炭素繊維マイクロ電極の直径が小さいため、組織損傷を最小限に抑え、正確な空間記録が可能であること;(3) FCVは薬理学的操作と非常に適合しており、モノアミン放出および取り込み速度論の効率的な調査を可能にします。(4) 化学的選択性と高い時間分解能の組み合わせにより、アンペロメトリーやマイクロダイアリシスのようなサンプリング手法と比べて検出が向上します。これらの手法は、しばしば高速で一時的な神経伝達物質イベントを捉える速度が不足したり、特定の分子の同定と定量に困難を抱えたりします5。

ドーパミン(DA)は報酬、動機付け、運動制御、学習や記憶の複数の側面に関与する重要な神経調節因子であり、急速かつ一時的な放出の動態を特徴とします。FCVでは、通常-0.4Vから+1.2Vまでの三角形電圧波形が炭素繊維マイクロ電極に繰り返し印加されます。陽極(上向き)スイープ中、電極表面近くのDAは約+0.6 Vで酸化され、2つの電子が放出されドーパミン-o-キノンが生成されます。陰極(下向き)スイープの間、この化合物は約-0.2 VでDAに戻され、2つの電子9を取ります。その結果生まれた電流-電圧シグネチャーにより、細胞外DAレベルの秒単位の変動を高精度に検出・定量化し、高い空間的・時間的分解能で明らかにします。実験では、FCV記録を10Hzで15〜30秒にわたり収集し、電気刺激によって引き起こされるDA放出を捕捉するのに十分でした。

線条体内では、DAの放出は局所的なコリン作動性介在ニューロン(ChI)によって厳密に調節されています。ChIは線条体ニューロンのわずか1%〜2%を占めますが、広範囲に樹状化し、軸索-軸索相互作用を通じてドーパミン作動性軸索を強く制御します(10,11)。この調節は紋状体学習において重要な役割を果たす可能性が高いです。学習中、中脳DAニューロンは報酬や報酬予測の手がかりに反応して位相発火を示します12に対し、ChIは高度に同期した多相性興奮-停止-反動発火パターンを示します13。ChIの停止と相位性DA活性の時間的一致は、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChRs)を介したChI媒介によるDA放出の調節の重要性をさらに強調しています14,15。DA放出の調節を超えて、この時間的な一致は紋状体16における学習関連シナプス可塑性の誘導に必要であることが示されており、この回路内でChIとDAシグナル伝達の相互作用を明確にすることの重要性を示しています。

ChIsは少なくとも2つの異なるメカニズムを通じてDAの放出に影響を与えます。第一に、ChIの同期活性化は、ドーパミン作動性体細胞発火とは独立に、DA軸索17,18,19のnAChRsの活性化を通じて、急速かつ短遅延のDA放出を誘発します。この軸索DA放出は、DA軸索17における異所性活動電位の生成によって媒介されると考えられます。第二に、ChIの活性化はDA軸索の脱分極を防ぐことで、その後のDA放出を著しく抑制します。特筆すべきは、この抑制は非常に短い潜伏で起こり、検出可能なDA放出を誘発しない比較的低いChI活性レベルによって誘発されることであり、nAChRsの活性化がDA放出を引き起こすよりも進行中のDA放出を抑制する効果が高いことを示唆しています。したがって、これらの要因は、ChIが生理学的条件下でDA放出に全体的な抑制的影響を及ぼす可能性を示唆しています。しかし、より細かな空間スケールでは、ChIは局所的にDA軸索放出を促進することがあります。

これらの発見は、線条体DAシグナル伝達の制御においてChIが精密に調整された役割を浮き彫りにしています。FCVは、その高い時間分解能により、ChI活性がDA放出に対する促進効果と抑制効果の両方を正確に測定できるため、これらのChl-DA相互作用を解析する強力なアプローチを提供します。

本稿では、炭素繊維マイクロ電極の製造およびFCVを用いた細胞外DA濃度の測定に関する基本的な手順を概説します。

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プロトコル

すべての動物処置はエクセター大学動物福祉倫理審査委員会によって承認され、内務省ライセンス[PP262252]のもとで実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 炭素繊維微電極の調製

  1. きれいなガラス容器にアセトンを入れます。ガラス毛細血管を完全にアセトンに浸し、各毛細血管が満たされるようにします。
  2. ピンセットを使って、アセトン入りの毛細血管にカーボンファイバーを一本挿入します。アセトンから毛細血管を取り除き、完全に自然乾燥させます。
  3. 乾燥した毛細管を垂直のマイクロ電極プラーに装填し、管の中央点を加熱フィラメントと一直線に位置させます。
  4. プラーを作動させ、ヒーターレベルを58.1に設定すると、1本の毛細管から2つのカーボンファイバー電極が生成されます。引き抜いた電極をトリミングのために回収します。
    注意:加熱温度や引っ張り力の統一設定はありません。これらのパラメータは機器ごとに異なり、各実験室環境ごとに試行錯誤を通じて最適化する必要があります。
  5. 引き抜いた電極を10×レティクル付きの顕微鏡の下に置きます。メスを使って繊維の先端を~100μmの長さにトリミングします(図1A)。
  6. 導電性ワイヤーの両端から約1cmの絶縁材を剥がします。露出した端の一端に導電性の銀インクを薄く塗ります。
  7. 銀色でコーティングされたワイヤーの端をカーボンファイバー電極の後端に差し込み、ワイヤーとファイバーのしっかりと接触を確保します。接合部を瞬間接着剤で塞ぎ、完全に乾かしてください。

2. 解の準備

  1. ショ糖ベースの切断液を準備します。
    1. ショ糖系切断液1L(pH 7.4、~300 mOsm/L)を調製するには、以下の成分(mM単位)を溶解します:85 NaCl、25 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、7 MgCl2、10 グルコース、65 ショ糖。
    2. 200mLのスクロースベースの切断液をきれいなボトルに移します。1 M CaCl2· 200 μL を加えます。H2Oで最終的なCaCl2 濃度1 mMに到達します。使用前に、95%O2 /5%CO2 のガス混合物で少なくとも30分間泡立ててください。
  2. 人工脳脊髄液(aCSF、pH 7.4、300 mOsm/L)を準備して記録します。
    1. 蒸留水1Lに以下のものを溶かして10×aCSFのストック溶液を調製します:1300 mM NaCl、250 mM NaHCO3、25 mM KCl、および12.5 mM NaH2PO4。ストック溶液は4°Cで保存します。
    2. 1× aCSFを調製するには、100 mLの100 mL× aCSF ストック溶液と52 mLの0.5 M NaHCO3を混合します。混合液を蒸留水で1リットルに薄めます。1 M CaCl2· mL を2 mL 加えます。H2Oを用いて最終濃度2 mM CaCl2を得ます。使用前に95%の酸素2/5%CO2 で少なくとも30分間バブルを作ってください。
  3. 校正用に2.5 mM DA標準液を準備します
    1. 0.1 mMの過塩酸を20 μLの過塩素酸を20 mLの蒸留水に希釈して製製します。完全に希釈するようによく混ぜてください。
    2. DA塩酸塩粉末9.48mgを重量し、上記の0.1 mM過塩酸に溶解して最終濃度2.5 mMにします。溶液は4°Cで保存し、酸化を防ぐために光から守ります。

3. 脳切片の準備

  1. 動物を安楽死させた後、脳を素早く取り出し、すぐに氷のように冷たいショ糖ベースの切断液に移します。
  2. 脳を振動器のプラットフォームに取り付け、ブレグマに対して+1.5mmから+0.5mmの300μmの冠状スライスを切断し、切断速度は0.34mm/sです。
  3. スライスを32°Cに保たれたaCSFを含む回収チャンバーに移します。 スライスを30〜40分孵化させます。
  4. 回収後は、連続的に酸素を含んだaCSFで室温にスライスを保管し、その後再使用します。

4. リグのセットアップと電極調整

  1. 灌流システムを起動しろ。リグ全体に蒸留水を少なくとも10分間浸してください。暖房システムを起動し、温度を32°Cに設定してください。
    注意:ヒーターを作動させる前に温度センサーが溶液に完全に浸透していることを確認してください。
  2. 刺激発生装置のソフトウェア、カメラ、マイクロマニピュレーター、顕微鏡の背景照明をオンにしてください。
  3. FCVデータ取得用のHDCVソフトウェアを開きます。電圧パラメータを-0.4Vから+1.2Vの三角形波形に設定し、400 V/sのスキャン速度で10 Hzで適用します。
  4. 脳切りをスライスチャンバーの中央に置き、ハープで固定します。
  5. マイクロマニピュレーターを使い、電極の先端を顕微鏡の視野に入れます。
  6. 顕微鏡の下で電極の先端を確認し、無傷で破損していないか確認してください。
  7. データ収集を開始し、電流-電圧プロットを確認してください。
  8. 新しい電極を皮質組織に設置し、記録前に少なくとも30分間三角形波を循環させて調整します。
    注:適切なサイクリックボルタンモグラムは特徴的な充電曲線を示すべきです(図1B)。ボルタンモグラムが歪んでいる場合(図1C-E)、または背景電流が不安定の場合は電極を交換してください。不安定さが続く場合は、アース接続を確認してください。

5. 細胞外DA濃度の測定

  1. マイクロマニピュレーターを使い、記録電極を調整部位から脳スライス内の標的記録位置へ移動させます。
  2. 目的の記録部位に同心円状の双極性刺激電極を設置します。記録電極を刺激電極から約50μmの位置に置きます(図2A,B)。
  3. 0.65 mAで単一パルス電気刺激を、パルス幅200μs、刺激間間隔150秒で伝達します。酸化および還元ピークが予想電圧(図2C)で発生し、DA過渡現象が典型的な解放およびクリアランス速度を示すこと(図2D)を確認しましょう。
  4. 10の基準DA信号を記録し、最後の3つの基準線トレースを確認してください。これらの信号間の変動が5%未満であることを確認してください。
    注意:信号振幅が低いか低下し続ける場合は、炭化物質の供給量、温度安定性、aCSFの浸透圧とpHを確認してください。
  5. 単一パルス(1p)と4パルス(4p、100Hz)両方のパラダイムを含む擬似ランダム化シーケンスで刺激パルスを届けます。
    注:4p 100 Hz刺激はDAニューロン11 の自然な高周波発火を模倣し、ChI依存性抑うつの最大大きさを評価するために一般的に用いられます。これはChI活性化20の約7〜8ms後に発生します。録音中に交互の刺激パターンを使い、シーケンスバイアスを最小限に抑えること。
  6. 目的の薬理学的物質をaCSFに溶かし、溶液を95%O 2/5%CO2 で少なくとも10分間泡立てます。
  7. 薬剤を浴槽に塗布し、完全な薬理効果が得られるまで(例:DHβEは10〜15分)培養します。薬物治療条件下で刺激と記録の手順を繰り返します。

6. キャリブレーション

  1. 2.5 mM DAストックのうち20 μLを25 mLの酸素付きaCSFに希釈して、2 μM DA校正液を準備します。
  2. 電極は入口の近くに配置してください。顕微鏡のピントを調整して、入口の上下の縁をはっきりと確認してください。インレットチューブの中心に再び焦点を合わせ、マイクロマニピュレーター(上げ・下げ)を調整して、電極の先端がはっきり見えるまで調整します。
  3. 電極表面を約10秒間高速流出して酸素入りのACSFを灌流し、電極表面を洗浄します。顕微鏡でスイッチを観察しながら、灌流ラインをaCSFからDAキャリブレーション溶液に変えます。
  4. DA溶液で30〜60秒の灌流を維持します。チューブを再びaCSFに切り替え、灌流を続けてDAを洗い流してください。キャリブレーション手順を3回繰り返します。
  5. 3つのDA応用の平均電流応答(ΔI)を用いて校正係数(nA/μM)を計算します(図2E)。各アプリケーションごとに、Δi= IDApeak− IDAbase(DAbase)を用いて計算します。ΔI値を平均し、既知のDA濃度(2μM)で割って電極の校正係数を求めます。
  6. 電極に実験日をラベル付けし、すべての校正データファイルを保存して後で参照してください。
    注:各記録電極は実験日の終わりに校正され、最適な感度と精度を確保するために後回の記録には再利用されません。

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結果

DAの放出振幅は、背景を差し引いたFCV記録から定量化されました。各試行では、バックグラウンド信号は5つの安定した刺激前ボルタンモグラムを平均して生成し、酸化ピークの明確な分離を可能にしました。DA放出は約+0.6Vのピーク酸化電流として測定されました。各実験終了時に電極の校正が行われ、ピーク酸化電流は電極特異感度係数(nA/μM)を用いてDA濃度に変換されました。条件間の比較を容易にするため、反応を3つの試験で平均し、同じスライス内で記録されたベースラインの単一パルス(1p)反応に正規化しました。

基底条件下では、4パルス(4p、100 Hz)刺激による細胞外DA([DA]o)の放出は、1パルス(1p)によるものよりわずかに大きいだけでした(図3)。DHβE(1μM)を浴槽で施用した後、4p対1p誘発[DA]o の比率が著しく増加しました。これは、制御条件下でChI活性化がnAChRを通じたその後のDA放出を強...

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ディスカッション

このプロトコルは、急性マウス脳スライスにおけるFCVを用いた誘発性DA放出の基本手順を説明し、重要なワークフローの包括的なガイドを提供します。DA特異的応用に加え、FCVはノルアドレナリンやセロトニンなどの他の神経伝達物質を、生体外および体内製剤の両方で検出するためにも用いられます。ここでは、カーボンファイバーマイクロ電極の製造、急性スライス準備、データ取得、電極較正など、この手法の主要構成要素を紹介します。

FCVでDA信号を確実に検出するには、いくつかの技術的考慮事項が必要です。まず、炭素繊維電極を約100μmの最適長さにトリムし、感度と組織内の正確な空間定位のバランスを取る必要があります。次に、カーボンファイバーと周囲のガラスとの間に高品質な密閉が、背景雑音を最小限に抑え、信号の長期的な安...

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開示事項

張燕峰はOxbioの創設者です。

謝辞

この研究は、英国心臓財団、糖尿病英国、政府科学・イノベーション技術省(DSIT)、ウェルカム・トゥ・Y.F.Z.の支援を受けた医療科学アカデミースプリングボード賞の助成金(SBF009\1125)によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アセトンシグマ・オルドリッチ534064-500ml
塩化カルシウムシグマ・オルドリッチ21115-100ml1M解
カーボンファイバーグッドフェロー・ケンブリッジ・リミテッドLS596012 APB
同心双極電極FHC300197刺激電極
ジヒドロ&ベータ;-エリスロイジン臭化水素化物トクリス・バイオサイエンス午前12時/295293
ドーパミンHClアペックスBTB1482
高速スキャンサイクリックボルタメトリーポテンショスタットシステムウェーブニューロAF01FSCV1
ガラス毛細管 ハーバードの装置GC200F-10
グルコースシグマ・オルドリッチSLCQ7550
ハロゲン電源オリンパス TH4
絶縁電流刺激器デジタイマーDS3
塩化六ヒ酸マグネシウムシグマ・オルドリッチM2670
マルチコアケーブル マルチコンププロ3372784
過塩素酸フィッシャー科学UN2920氷河酢酸に0.1M含まれています
蠕動ポンプギルソン ミニプラス3
塩化カリウムシグマ・オルドリッチP9541
プライムBSIエクスプレステレダイン01-プライム-BSI-エクスプス
銀の導電性塗料RSコンポーネントRS 186-3600
銀/塩化銀の参考文献ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ0226E基準電極
スライススコープサイエンティフィカプロ2000
重炭酸ナトリウムシグマ・オルドリッチS5761
塩化ナトリウムフィッシャー科学2402665
リン酸ナトリウム一塩基シグマ・オルドリッチS5011
刺激発生器マルチチャネルシステムSTG5 
ショ糖ミリポール84100
垂直マイクロ電極プラー 成重PC-100

参考文献

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