方法論記事

Caenorhabditis elegans L4幼虫全体におけるクロマチンアクセス性プロファイリング

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DOI：

10.3791/69791

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2026年4月17日

 ,  , 
1Departamento de Biología Celular y Desarrollo, Instituto de Fisiología Celular (IFC), Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

この記事について

サマリー

ここでは、L4期 Caenorhabditis elegans 全虫に対して、わずか30μLの線虫ペレットを用いて実装できる簡単かつ簡易なATAC-seqプロトコルを紹介します。

要約

クロマチンアクセスは転写、DNA修復、染色体分離に重要な役割を果たします。過剰アクセス領域は通常、活性プロモーターやエンハンサーと相関し、転写因子結合や調節活性を促進します。トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンのシーケンシング(ATAC-seq)アッセイにより、非常に少数の細胞でクロマチンアクセス性のゲノム全体プロファイリングが可能になります。しかし、 Caenorhabditis elegans での実装は、細胞解離を複雑にする線虫の豊富なコラーゲンキューティクルによって制限されています。ここでは、L4段階で全虫のATAC-seqを行うための最適化プロトコルを提示します。この手順は同期培養から始まり、キューティクルの破壊、酵素解離、細胞懸濁の準備を含みます。透過化された核はその後、Tn5転置を受け、その後ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅および次世代シーケンシング(NGS)対応ライブラリの精製が行われます。このプロトコルは30μLのミミズペレットを必要とし、1日で完了可能で、ブリストルN2リファレンス株で5,000〜9,000のアクセシビリティピークを生成します。この効率的なワークフローは、他の発生段階やFACS精製細胞集団にも適応可能です。C . elegansにおけるATAC-seqの技術的障壁を減らすことで、この手法は遺伝的および環境的攪乱に応答したゲノム全体のクロマチンアクセス性を全生物の文脈で研究する機会を拡大します。

概要

真核生物のゲノムは細胞核内に密に詰め込まれています。空間的制約に対応するため、DNAはヌクレオソームの周りに密接に巻き込まれます。ヌクレオソームは、異なる1門に高度に保存された8つのヒストンからなる多タンパク質複合体です。クロマチンアクセスパターンは組織内の細胞状態や遺伝子特異的パターンによって異なり、2,3,4。ヌクレオソームのアクセス性は、特にプロモーターや増強子などの遠位調節領域において、能動転写と強く相関しています。これらは転写因子にアクセス可能です5。開放されたクロマチン領域はDNA修復、複製、染色体分離にも重要な役割を果たします。対照的に、アクセスの低下は通常、サイレンシー化されたヘテロクロマチンおよび反復配列と相関しています。

クロマチンアクセスのマッピングは、遺伝子調節を理解するための強力な手法となっています。クロマチンのアクセス可能性を調査するために様々な手法が用いられています。初期の方法の一つとして、微小球核酵素(MNase)およびDNase I消化が用いられ、特定の遺伝子座8,9におけるヌクレオソームの位置とアクセスのマッピングが行われました。これらの技術は後に次世代シーケンシング(NGS)10,11と組み合わせてゲノム全体の研究に応用されました。しかし、これらの技術は成功裏に実装するためには、酵素濃度と反応時間の慎重な校正、さらに多数の細胞が必要です。

2013年、グリーンリーフ研究室は、少量の細胞数を用いてゲノム全体でクロマチンアクセスをシームレスにマッピングするトランスポザーゼアクセスクロマチンのアッセイ(ATAC-seq)を確立しました。ATAC-seqは市販のTn5トランスポザーゼを利用し、通常ヌクレオソームを持たない開放クロマチン領域に短いDNA配列(すなわちバーコード)を優先的に挿入し、活性プロモーターやエンハンサーと相関します。このプロトコルでは、細胞透過性と核の分離、その後Tn5による限定的な消化による超アクセス性クロマチンのタグメンテーションが求められます。その後、補完的なインデックスがPCR中に組み込まれ、NGS13の前にサンプルの多重化が容易になります。ATAC-seqは堅牢なプロトコルであり、シリコでの転写因子フットプリントも可能にし、単一細胞分解能14,15,16,17に対応しています。マウスやヒトサンプルに加え、ATAC-seqはゼブラフィッシュやショウジョウバエ、線虫Caenorhabditis elegans 18,19,20などの無脊椎動物など様々なシステムに実装されています。

数十年にわたり、C. elegansは発生学、細胞生物学、神経科学などの分野で強力なモデルシステムとして機能し、微小RNAやRNA干渉(RNAi)の同定などの画期的な発見をもたらしました21,22。この遺伝子はコンパクトな100MBのゲノムを持ち、約20,000個のタンパク質コード遺伝子を持っています23。遺伝子調節はプロモーター活性および遠位増強子を通じて行われ、これらはATAC-seqによって異なる組織、発生段階、加齢時点にわたってマッピングされています24,18。クロマチンアクセス性プロファイリングは、C. elegansにおける遺伝子調節を理解するための貴重なツールとなっています。したがって、ATAC-seqは異なる環境条件や野生分離株におけるエピジェネティックな地形の研究に特に有望であり、多様な転写応答を明らかにしています。さらに、他の病原性および非病原性線虫のクロマチン構造についての洞察も提供できるかもしれません。

C. elegansにおける主な方法論的課題の一つは、コラーゲン豊富なキューティクルの存在であり、これを解離して均質な細胞懸浮液を得るためには必要である。この課題に対処するため、線虫を分解し、C. elegans18,26でATAC-seqを行うための異なるプロトコルをまとめて最適化しました。L4幼虫期の使用が推奨されます。なぜなら、この発達段階の動物は転写活性の生殖細胞を有しており、これが開いたクロマチンに変換され、体細胞内で一貫した有益なクロマチンアクセス源を提供するからです。ここでは、線虫の解離と細胞懸濁生成のための迅速かつ効率的なプロトコルを提示し、C. elegansにおけるATAC-seqを可能にします。本法はL4期の線虫に最適化されており、最小30μLの線虫ペレットで済みます。また、他の発生段階やFACS精製細胞のような小規模サンプルにも応用可能です。このプロトコルは異なるC. elegans株や条件下で実施可能であり、Bristol-N2参照株における5,000〜9,000のクロマチンアクセスピークの特定が可能となり、その後のクロマチンアクセス解析の基礎を築きます。

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プロトコル

常に手袋を着用することが推奨されます。

注:1日目:同期ミミズの個体群の準備。すべてのミミズは大腸菌OP50をまきまくNGMプレート上で培養されました。開始前に必要とすべきもの:(サンプルまたは株ごと)、成虫用90mmまたは60mmのミミズプレート1枚または2枚、飼料入りの90mmまたは60mmプレート2枚、M9滅菌バッファー27(3g KH2PO4、6g Na2HPO4、5g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、H2Oから1 L。自滅菌で滅菌)

1. ミミズの収集

  1. 成虫の個体数を記した90mm(または30mmのプレート2枚)を用意します。
  2. M9バッファーでワームを回収し、15 mLの遠心分離機チューブに移します。
  3. 前回の手順を繰り返して、プレートからすべてのワームを回収します。
  4. 15mLチューブ内でワームを1分間落ち着かせ、慎重にM9バッファーを取り除きます。
  5. 必ず~1mLの寄生虫を用意してください。

2. 漂白

  1. 5mLのM9バッファー+650μLのNaOHを加えます。5M + 1,300μLの家庭用漂白剤(NaClO溶液5%)を加えます。
  2. 最大速度で渦が1〜2分間(最大2.5分以内)続きます。
  3. 1,000 x g で室温で1分間遠心分離します。
  4. 上清液を取り除き、9mLのM9バッファーを加えます。
  5. セクション2.3と2.4をさらに5回繰り返します。
  6. 胚を7mLのM9バッファーに再懸浮させます。
    注意:漂白プロトコルは温度や市販漂白剤の種類によって効率が異なる場合があります。

3. M9(液体)卵の夜間孵化

  1. 漂白卵の入った採取チューブが適切に閉じられているか確認してください。
  2. チューブを20°Cでゆっくり動かします(例:部屋内のシェーカーで20°C)。
  3. 寄生虫は夜間に孵化し、L1で停止します。
    注意:チューブを12時間以上放置しないでください。

4. 2日目:寄生虫の成長: L1 寄生虫の回復。

  1. シェーカーからチューブを取り出し、顕微鏡で L1 寄生虫が存在することを確認してください。
  2. チューブを垂直に約1時間RTで静止させます。
  3. 上清液を取り除き、約300個の L1 ワームを90mmのプレート1つまたは30mmのプレート2つに送り込み、餌を添えて移します。
  4. 20°Cのインキュベーターに入れ、26時間育ててL4段階に到達させます。

5. 3日目:ストック溶液の準備:次の溶液を準備し、4日目に新しい溶液を作る必要があります

注意:これは2日目か3日目に行うことができます。

  1. 10%SDSを1mL。
  2. 1M HEPES pH 8(オートクレーブ)50 mL。
  3. 20%ショ糖(オートクレーブ)250mL。
  4. 2Mナックル100mL:準備(オートクレーブ)。
  5. 2M KCl(オートクレーブ)50mL。
  6. 10mLの1MCaCl2 (オートクレーブ)。
  7. 10mLの1M MgCl2(オート クレーブ)。
  8. 100mLの1Mトリス、pH7.4。
  9. 5Mナクレート(オートクレーブ)5mL。
  10. 10%トゥイーン-20入り500μL。
  11. 10%ノニデP40/IGEPALを500μL投与。
  12. 5%ジトニン100μL(溶解には65°Cまで加熱が必要です)。
  13. 10%BSA(0.22μmフィルター付き)500μLを4°Cで保存。
    4日目:ATACのための L4 ステージワーム
    注意:開始前に、25°Cのインキュベーター、4°Cの遠心分離機を用意し、デジトニンを65°Cまで加熱(新鮮なバッファーの準備用)、無菌M9バッファー、無菌H2O、20μmフィルターを用意してください。

6. 溶液の調製

  1. 新鮮な溶液を準備してください( 表1参照)。L-15、10%FBS、卵バッファーは必ず無菌環境で取り扱い、冷蔵保存してください。

表1:新鮮な溶液調製用の備蓄。 線虫解離および細胞懸濁プロトコルのためのストック準備レシピ(第6節および第7節)。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

7. 線虫解離および細胞懸濁プロトコル

注:L4同期されたミミズ個体群を持つ90mmプレートまたは30mmプレート2枚が必要です。

  1. 20°Cのインキュベーターで26時間放置した後、顕微鏡でほとんどの線虫がL4段階にあることを確認してください。
  2. M9バッファーでプレートからすべてのワームを回収し、1.5mLの遠心分離機チューブに入れます。
  3. ミミズが重力で沈殿するまで、1mLの滅菌H2Oで5回洗います。
  4. ミミズの入ったチューブを25°Cのインキュベーターに30分間移し、腸内の食べ物の残りを取り除く。
  5. ミミズペレット50μLを取り、新しいチューブに入れます。
  6. 200μLのSDS-DTTフレッシュバッファーを加え、チューブローテーターで正確に5分間(それ以上は控え)混混します。
  7. 冷たい卵バッファー1mLを加え、ピコフュージで 回 して上清液を除去します。これを6回繰り返します。
  8. 新鮮に調製したプロナーゼ80μL(15 mg/mL)を加えます。
  9. 200μLピペット(フィルター付きチップ付き)で、ワームズとプロナーゼの混合液の70倍を混ぜ、RTで15分間培養します。
  10. L-15 10%FBS培地800μLを加え、500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  11. L-15 10%FBS培地1mLを加え、遠心分離を繰り返します。
  12. 前の手順をさらに2回繰り返します。
  13. 上清液を除去し、L-15 10%FBS培地900μLに再懸濁します。
  14. 20μmフィルターでフィルターを使います。

8. 核の単離とクロマチン標識

注意:ピペットのフィルター付きチップを使いましょう。開始前に:Tn5バッファーを取り出し、解凍させ、サーモブロックを37°Cに設定し、PCR生成物精製キット(材料表)を取り出し、EBバッファーを37°Cに置き、カラムの遠心分離はRTで行うべきです。

  1. ろ過セルの懸濁液を500 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。
  2. 上清液を除去し、~50 μLを残します。
  3. 45μLのリライスバッファー(新たに調製したもの)を加え、慎重に再懸浮させます。
  4. ウォッシュバッファー50μLを慎重に加えます(混ぜないでください)。
  5. 遠心分離機で5分、500 x g 、4°C。上澄液を除去します。氷の中に置いておけ。
  6. スピニング中は、各反応(Rx)ごとに以下のTn5混合物を準備します:25 μL Tn5バッファー29、24.8 μL ヌクレアーゼフリーH2O、0.2 μL Tn5酵素。複数のサンプル用のマスターミックスを準備してください。
  7. 遠心分離後、上清液を取り除きます。核は氷の上に置いておけ。核ペレットに50μLのTn5混合液を加え、ゆっくりと7回ピペットします。サーモブロックで37°Cで30分間培養します。10分ごとに各チューブを軽く叩くようにしてください。
    注意:PCR精製キットを取り外し、EBバッファーを37°Cのインキュベーターに入れてください。次の5ステップではこのキットのバッファを使用します。
  8. Tn5インキュベーション後、キットから300μLのPBバッファー(黄色)を加え、最大速度で25秒間ボルテックスを混ぜます。
  9. チューブ内の全ての体積を取り出し、スピンカラム(紫色、4°Cで保存)に移し、RTで最大速度で1分間遠心分離します。
    注意:カラムはDNAを保持するため、上清液は信頼して捨てることができます。
  10. スピンカラムに750μLのPEバッファを追加し、RT速度で1分間遠心分離機で行います。
  11. 上清液は採血チューブと一緒に捨てます。カラムを新しい1.5 mLチューブに入れて遠心分離を繰り返します。1.5 mLチューブは廃棄してください。
  12. カラムを新しいラベル付き1.5 mLチューブに入れ、カラム中央に37°CのEBバッファー10 μLを加えます。コラムには触らないように気をつけてください。RTで1分間そのままにしてください。
  13. RTで最大速度で1分間遠心分離機;4°Cでは決してありません。
  14. 最後の2ステップを繰り返し、EBバッファ内で合計20μLの洗脱を行います。
    注意:任意の一時停止:停止時はサンプルを-20°Cで保存できます。 ここでは、タグメントされたクロマチンが20μLの体積にあります。

9. ライブラリ増幅

  1. ATACライブラリ増幅には、適切なサイクル増幅数を推定するためにリアルタイムPCRが必要です( 表2参照)。これをPCRプレートで行ってください。
  2. 最終増幅のためのサイクル数を推定するには、増幅曲線の最初の3分の1に対応するサイクル数を取る必要があります。サイクル数が15を超えないのが理想的です。各サンプルごとにサイクル番号を推定する必要があります。
    注:qPCR後、タグメントされたDNAは18μLの容量に保存されます。任意の一時停止:停止したい場合は、サンプルを-20°Cで保存できます。
  3. ATACライブラリー最終増幅:
    1. 各サンプルには異なるRvプライマーが必要です(メモを取ってください)。
    2. 各サンプルは、推定されるサイクル数(N)に対して増幅されなければなりません。
    3. このPCRは200μLチューブで実施します( 表3参照)。
    4. ここには8μLのタグメントDNAと50μLの増幅ATACライブラリがあります
    5. オプションの一時停止:停止したい場合は、サンプルを-20°Cで保存できます。

表2:最初のライブラリ増幅の手順。 最初のライブラリ増幅のためのレシピとPCRプログラム(セクション9)。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

表3:ATACライブラリ最終増幅の手順。 最終ライブラリ増幅のためのレシピおよびPCRプログラム(セクション9)。 この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

10. 図書館の浄化

注意:始める前に、サイズ選択用のビーズ(AMPure、SPRIselect、または自作の校正ビーズ)を冷蔵庫から取り出し、室温に慣らしてください。使用前に毎回渦を使ってビーズを激しく混ぜてください。

  1. 80%エタノール(分子級)を1mL調製します。
  2. サンプルチューブ(50μLがある部分)に25μL(0.5ボリューム)のビーズを加え、ピペットで混合します。
  3. RTで10分間孵化させます。
  4. チューブを磁気ラックに5分間置きます。
  5. 上清液(70μL)を新しい200μLのクリーンチューブに移します。
    注:このステップでは、<200 bpのDNA断片を廃棄します。
  6. ビーズ65μL(1.3ボリューム)を加え、10回混ぜます。
  7. RTで10分間孵化させます。
  8. チューブを磁気ラックに5分間置きます。
  9. 磁気ラックからチューブを取り出さずに上清液を捨てます。
    注:この時点でビーズは>200塩基および<1000塩基のDNA断片を保持しています。
  10. チューブを磁気ラックに乗せたまま、ビーズの上に200μLの新たに準備された80%エタノールを直接加え、数回上下にピップで洗浄します。
  11. エタノールを除去し、200μLのエタノールで繰り返し洗浄します。
  12. エタノールは捨て、蓋を開けてビーズを2〜5分ほど乾かします(あまり乾かさないように)。
  13. 磁気ラックからサンプルを取り出します。50μLの滅菌水素2Oに再懸浮液を注入し、チューブの壁からすべてのビーズを洗い流すようにしてください。
  14. 最後に、チューブを磁気ラックで5分間孵化させます。
  15. 上清液を新しいきれいなチューブに移します。ここには増幅・精製されたATACライブラリが保管されています。
    注意:図書館は短期間(最大4週間)-20°Cで保管することも、-80°Cで長期間保管することも可能です。

11. 断片サイズ分布

  1. 最終増幅が完了したら、サンプルの一部を毛細管電気泳動に通し、断片サイズの分布パターンを確認することが望ましいです。

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結果

タグメント後の品質管理により、正確なライブラリ準備が保証されます
プロトコル中は、クロマチン標識後に行われるqPCRに特に注意を払うことが重要です(セクション9)。これはDNAの質と実験の性能を評価する上で重要なステップです。図1Aは2つの増幅曲線を示しています。左のもの(15サイクル未満)は、これまですべてが成功していたことを示す良質な資料なので、続けても問題ありません。右側の曲線(図1A)は質の低い材料を示しているため、このサンプルは継続すべきではありません。次に注意すべき点は、ライブラリの増幅および精製後に断片長分布を評価するために毛細管電気泳動を行うことが推奨される点です。転座DNAを正しく検証するために、ヌクレオソームパターンに対応する断片を示す必要があります:~150 bp(単一塩基体)、~300 bp(バイヌクレオソーム)などです(図1B–D、サンプル1および2)。...

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ディスカッション

ここでは、全L4ステージの Caenorhabditis elegans 寄生虫におけるATAC-seqによるゲノムワイドクロマチンアクセス性のプロファイリングに最適なプロトコルを説明します。クロマチンのアクセス性は遺伝子発現、DNA修復、複製、組換えに直接影響を与え、ATAC-seqは細胞や組織サンプルの標準的な手法となっていますが、不透過性でコラーゲン豊富な線虫のキューティクルを持つ線虫など、完全な生物への適用には独自の技術的課題があります。同時に、全生物のアッセイを評価することは、世界的なエピジェネティック応答を捉える独自の機会を提供します。本手法は、同期したL4段階の少量の線虫から線虫解離、透過化、核の準備、クロマチン標識付け、ライブラリーの調製を精緻化することでこれらの課題に対応しています。このプロトコルは1日または2日で完全に実行でき、複数のサンプルを並列処理することが可能です。

このプロトコルの成功にはいくつかの重要なステップがあります。(1) 新たに調製されたバッファーとレジェント...

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開示事項

著者たちは利益相反がないと宣言しています。本稿の執筆、分析、準備において生成AIは一切使用されていません。

謝辞

J・ヘルシュ・ゴンザレスは、国立人道科学技術評議会(CONAHCYT、現Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación)(#CVU 846476 年)から博士号奨学金を受けました。J・ハーシュ・ゴンザレスはCONAHCYT(現SECIHTI)奨学金(788519)によって支援を受けていました。このプロジェクトは、PAPIIT-UNAM助成金IN217824およびSECIHTI助成金CBF-2025-I-2275の支援を受けてVJVに提供されました。IFCではUBMのローラ・オンガイ・ラリオス、グアダルーペ・コディス・ウエルタ、ミネルバ・モラ・カブレラに感謝します。UBMI:アウグスト・セサール・プート・ヘルナンデスとカルロス・ペラルタ・アルバレス;そしてUnidad de Cómputo、Imagenología、Taller、Bibliotecaなどがあります。本研究で使用された株を提供してくださったカエノラブディティス遺伝学センター(CGC)に感謝申し上げます。CGCはNIH研究インフラプログラム局(P40 OD010440)によって資金提供されています。

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材料

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この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
250 mL, 0.22 µm PESUltra Curzsc-200253
AgarBD214010
Agencourt AMPURE XPNalgeneA63886
Bovine Serum AlbuminMaplica200100
Calcium ChlorideSigmaC5670-100G
CellTrics 20 µmSysmex04-0042-2315
CholesterolSigmaC8503-25G
DigitoninSigmaD141-500 mg
Disposable glovesMicroflex94-243
DL-DithiothreitolsigmaD0632-10G有害
Ethyl alcohol, pureSigma1003661421
Fetal Bovine SerumbiowestS181S-500
HEPESSigmaH3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)Illumina20034211
Kapa Syber 50 mLSigmaKK4618
L-15 Medium (Leivobitz)sigmaL4386-10L
Magnesium Chloride anhydrousSigmaM8266-100G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
Magnesium Sulfate HeptahydrateSigmaM1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)Qiagen28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master MixNEBM0541S
Nonidet P40 SubstituteSigma74835-1L
Pen StrepGibco15140-122
PeptoneBD211677
Petri dish 60 mmTritechT3308
Petri dish 90 mmInterluxC9015-2C
Pipet tips 10 µL, filterCellpro800108
Pipet tips 20 µL, filterCellpro800708
Pipet tips 200 µL, filterCellpro800608
Potassium ChlorideSigmaP9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic PowderJ.T. Baker3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, CrystalJ.T. Baker3246-01 500G
Sodium ChlorideJT Baker3624-01
Sodium dodecyl sulfatesigmaL4509-100G
Sodium HydroxideMacron7708-10
Sodium HypochloriteCloralex544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated CrystalJ.T. Baker3824-01
SPRIselectBeckmanB23318
SucroseSigmaS0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µmUltra CurzSc-358812
Trizma baseSigmaT1503 1KG
Tween 20SigmaP9416-50ML
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参考文献

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