腎移植における急性抗体介在拒絶反応のラットモデルの確立

サマリー

本記事では、腎移植における急性抗体介在拒絶反応(AAMR)のラットモデルの確立について説明しています。このモデルは、腎移植の14日前にドナーブラウンノルウェーラットの皮膚移植で受容者ルイスラットを感作させることで誘導され、AAMRの病態生理学研究に充実した基盤を提供します。

要約

急性抗体介在拒絶反応(AAMR)は、腎移植における長期的な移植片生存の大きな障害となっています。AAMRの病態生理は主にドナー特異的抗体(DSA)によって駆動され、補体活性化を引き起こし、内皮細胞損傷、血管炎、移植片機能障害を引き起こします。免疫抑制療法の進歩にもかかわらず、AAMRの治療は依然として最適とは言えません。したがって、AAMRの信頼できる動物モデルの開発は、そのメカニズムを理解し、治療介入の可能性を評価する上で極めて重要です。本研究では、腎移植の14日前にドナーブラウンノルウェーラットの皮膚移植片で受容者ルイスラットを感作することでAAMRのラットモデルが確立されました。研究期間中、免疫抑制剤は投与されませんでした。生存分析では、プレセンシティ化された異体群の移植片生存率が非プレマシティック群と比較して有意に減少していることが示されました(6.2 ± 1.1 d 対 10.0 ± 0.7 d、 P < 0.001)。血清DSA-IgGのレベルは皮膚移植後7日目から有意に上昇し、腎移植後5日目まで上昇を続け、血清DSA-IgMのレベルは皮膚移植後7日目および14日目に有意に上昇しました。腎移植から6時間後から、同種移植は糸球炎、管周囲毛細血管炎、毛細血管内にC4d沈着の兆候を示し始めました。腎移植後3日目から、著しい異種移植片損傷と卵管壊死が観察されました。これらの変化は時間とともに徐々に悪化し、すべてAAMRの特徴と一致しています。このモデルはAAMRの主要な特徴を効果的に再現し、基盤となるメカニズムや治療法の将来の研究に充実した基盤を提供します。

概要

腎移植(KT)は、末期^{腎疾患に対する}重要な治療アプローチとなっています^1,2。しかしながら、移植拒絶反応は腎同種移植の長期生存に大きな影響を与える要因であり続け^{ています。}臨床的に観察される主な拒絶反応の種類は、急性拒絶反応(AR)と慢性拒絶反応(CR)です。急性拒絶反応はさらに急性T細胞介在拒絶反応(TCMR)と急性抗体介質拒絶反応(AAMR^)に分類されます^5,6,7。近年、免疫抑制剤の開発と応用により、TCMRの発症率は効果的に抑制されています。しかし、AAMRは同種移植^{片機能障害}の主な原因の一つであり続けています^8,9。

AAMRの病態生理は、移植前後のいずれかに産生されるドナー特異的抗体(DSA)によって引き起こされると考えられています¹⁰。DSAが同種移植片の血管内皮細胞の抗原に結合すると、古典的な補体カスケードが活性化され、膜攻撃複合体の形成とそれに続く同種移植片損傷が起こります¹¹。補体活性化の際、切断断片C4dは同種毛細血管内皮細胞表面に共有結合します。さらに、補体切断産物C3aやC5aなどの化学誘引剤は、炎症細胞(例:マクロファージ)を同種毛細血管に侵入させ、毛細血管炎やさらなる移植片損傷を引き起こす^12,13。したがって、AAMRの臨床診断は主に血清DSA値の上昇、毛細血管炎、卵管壊死、移植毛細血管内のC4d沈着の証拠^{に基づいています。}現在のAAMR治療法は主にB細胞または形質細胞の活性抑制、循環中のDSAの除去、補体活性化の阻害を含みます。これには、形質分離術、免疫吸着、CD20モノクローナル抗体(リツキシマブ)、プロテアソーム阻害薬(ボルテゾミブ)、補体阻害薬(エキュリズマブ)、およびIgG分解酵素(IdeS)17,18,19,20,21,22,23,24,25が含まれます.しかし、標準化された治療法はランダム化試験で十分に有効と証明されていないため、全体的な治療効果は依然として最適とは言えません。さらに、現在の免疫抑制戦略は、特に重篤な感染症合併症や悪性腫瘍への感受性増加など、重大な副作用の負担を伴うことが多いです(21,25,26,27)。したがって、AAMRの病態生理を明らかにし、より効果的な治療アプローチを開発するためにさらなる研究が必要です。

疾患メカニズムの調査や新規予防戦略の探求は小動物モデルに依存しているため、KTにおける信頼性の高いAAMRモデルの確立が不可欠です。私たちの研究グループは、ラット用KT AAMRモデル²⁸の製作に豊富な経験を持っています。本研究では、ブラウンノルウェー(BN)ラットをルイスラットにKT測定を行いました。BN(RT1ⁿ)とルイス(^{RT1 l})ラットは完全にMHCミスマッチのペアであり、異種拒絶の強力な遺伝的基盤を提供します²⁹。他のモデリング手法と比較して、ここで用いられる皮膚移植前感作法は、堅牢性と生理学的関連性において明確な利点を提供します。一時的な注射に依存し宿主免疫関与を欠く受動的抗体移植モデルとは異なり、この能動的感作アプローチは長期免疫記憶を確立し、高度に感作^{された患者の臨床}シナリオをほぼ模倣します。さらに、ドナー特異的輸血のような他の感作設計とは異なり、プロトコルによって抗体価が変動したり耐性を誘導したりすることがありますが、皮膚移植は単一で強力かつ高い免疫原性刺激^{を提供します。}これにより、高抗体価DSAの再現性の生成と、5日から7日の定められた期間内にAAMR表現型(例:毛細血管炎、C4d沈着)の一貫した発現が保証され、治療効果を評価するための非常に実現可能なプラットフォームとなっています。これらの異種ラットに対して2週間の皮膚移植前感作後、KTを実施し、血清学的、組織病理学的、免疫学的解析を通じてモデルを評価することでAAMRモデルを確立しました。

モデルの適用可能性に関しては、このプロトコルの利用者は移植後5日目から7日目の間にAAMR表現型の再現性が見られると期待できます。このモデルを検証するために不可欠な主な指標には、血清DSA(IgGおよびIgM)産生の動態、微小血管炎症(糸球炎および管周囲毛細血管炎)の組織学的証拠、そして管周囲毛細血管におけるびまん性C4d沈着が含まれます。しかし、読者は基本的な制約を認識すべきです。皮膚感作法は体液アームと細胞アームの両方に関わる広範なアロ免疫応答を引き起こします。したがって、このモデルは通常、単離抗体介在ではなく、優性AAMR特徴と共にTCMRを伴う混合拒絶病態として現れます。

プロトコル

すべての動物処置は、機関のガイドラインに厳格に従って実施され、山東第一医科大学および山東省千佛山病院の制度動物倫理委員会の承認を得ています。すべての手続きは3R原則およびヘルシンキ宣言(承認番号)に準拠していました。ジェニオ-IACUC-2024-A066)。本研究で使用される試薬および装置は 材料表に詳細記載されています。

1. 動物の調理

1. 成虫のオスBN(RT1ⁿ)とルイス(RT1^l)ラット(200-250g)を特定の無病原体(SPF)施設で飼育してください。近親交配株として、同じ株内の個体は遺伝的に同一であり、ドナーの均一性を確保します。
2. ラットを 図1に示すように4つの実験群に分けます:(1) 同種のKT、(2) 皮膚移植後の同種のKT(ST)、(3) 異種KT、(4) ST後の同種KT。
   注意:すべての手術は、立体顕微鏡の下でSPF手術室で行ってください。すべての処置中、サーモスタティック手術台を使用して動物の体温を37°Cに保ちます。
3. 4%-5%イソフルランを100%酸素で1.0 L/minの流量で誘導チャンバーで麻酔を誘導します(機関承認プロトコルに従い)。誘導後は鼻錐 から 1.5%〜2%のイソフルランで麻酔を維持します。麻酔の深さは、手技中にペダルの撤退反射の喪失を確認することでモニタリングされました。

2. ST による 前感作(グループ2および4向け)

1. ドナーラットの尾から2 cm x 2cmの全厚皮膚移植片を採取します(グループ2のLewis;グループ4のBNです。
   注:皮膚移植に使われたドナーラットは、同じ近親交配株のものの、後の腎臓ドナーとは異なる個体です。
2. 同じ大きさの移植苗床を受贈ラットの背中に準備します。
3. ドナー皮膚移植片を準備済みのベッドに置き、^前述の中断縫合で固定します。
4. 腎移植を進める前に14日間の感作期間を設けてください。

3. KTのためのドナー手術

1. ドナーラットに麻酔をかけます(グループ1および2はルイス;第3および第4グループ用大隊)。
2. ラットを仰向けにし、剣突から恥骨結合まで約3〜4cmの長さの正中開腹手術を行い、腹部臓器を完全に露出^{させます。}
3. 腸を優しく引き戻して、左腎臓とその付随する血管を視覚化します。
4. 左腎動脈を起点から腹部大動脈から隔離し、左腎静脈を下大静脈との接続点で隔離します。
   注:大動脈や大静脈腔のパッチ(カレルパッチ)を採取せず、血管を開口部で直接隔離・切断することを選びます。この技術は吻合に精密な顕微外科技術を必要としますが、受容者大動脈への動脈切開の範囲を最小限に抑え、パッチ再建に伴う乱流による血栓症のリスクを減らすために好まれます。
5. 腹部大動脈 を通じて 、左腎臓に約2 mLの冷たい(4°C)ヘパリン化生理食塩水(125 U/mL)を灌流し、腎が白くなるまで³¹。
6. 左腎静脈を横断し、次に左腎動脈を切開します。
7. 尿管を切断し、膀胱の一部が固定されていることを確認します。
8. 腎臓を採取し、すぐに0.5〜1.0mLの冷たい高張クエン酸アデニン(HCA)腎保存液に氷で浸します。

4. KTの受領者運営

1. ルイスラットの受給者に麻酔を。
2. 正中開腹手術を行い、腹大動脈と下大静脈を本来の腎血管のレベルより下に露出させます。
3. 腹部大動脈と下大静脈の一部を分離します。
4. 血管用ブルドッグクランプで孤立した血管区画をクランプします。
5. 腹部大動脈に小さな縦切開(長さ約1.0〜1.5mmで、ドナー腎動脈の直径に合わせたもの)を開け、10-0ナイロン縫合糸を連続的にドナー腎動脈と両端で吻合します。
6. 下大静脈に対応する切開を行い、8-0を使ってドナー腎静脈との端から側への吻合を行いますナイロン縫合糸。
   注意:過剰出血を防ぐために投与者に対して全身ヘパリン化は行われません。
7. まず、下大静脈の血管クランプを外して静脈の流出を確立します。その後、腹部大動脈の動脈クランプをゆっくりと外し、移植片への血流を回復させます。
8. 止血の有無を確認し、移植片灌流の評価をしてください。軽度の出血箇所は綿棒で圧迫してください。
   注意:適切に灌流された腎臓はすぐにピンク色で硬くなります。
9. 10-0ナイロン縫合糸を用いて、ドナーの膀胱パッチを受血者の膀胱のドームに吻合して尿路再建を行います。
10. 移植片の機能のみに依存するために、受容ラットの両腎臓を切除します。
    注:手術中、ドナー収穫から再灌流までの冷性虚血の総時間は60分未満に抑えられ、吻合中の温空虚血時間は虚血損傷を最小限に抑えるために30分未満に抑えられました。
11. 腹部切開部を5-0シルク縫合糸で層ごとに閉じます。
12. 創傷閉合直後、鎮痛のためにブプレノルフィン(0.05 mg/kg)を皮下投与し、感染予防のためにペニシリン(40,000 U/kg)を筋内投与します。脱水を防ぐために、1〜2mLの温かい無菌生理食塩水を皮下投与してください。

5. 術後ケアとモニタリング

1. 受領ラットの生存状況、行動(覚醒度、可動性)、生理状態(食物摂取量、排泄量)を毎日監視します。
2. 手術切開部を毎日検査し、感染や裂け目の兆候がないか確認してください。
3. 手術後最初の24時間はラットを1時間ごとにモニタリングし、2〜3日目は1日3回以上、その後は1日1〜2回モニタリングしてください。
4. 血管血栓症、尿漏れ、出血などの技術的合併症により移植後24時間以内に死亡した受血者は最終解析から除外します。本研究では、全体の手術成功率は約90%でした。

6. 移植後の評価

1. DSAレベルの検出
   1. ST後0日目、3日目、7日目、14日目とKT後1日目、3日目、5日目に尾部静脈から血液サンプルを採取してください。
   2. サンプルを~1500 x g で10分間遠心分離し、血清を分離して-20°Cで保存し、分析まで保存します。
   3. ドナーラットから脾臓を採取し、70μmの細胞ストレーナーで機械的に解離し、冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に変換します。ACK溶解バッファーを使って赤血球を5分間溶除し、その後PBSで細胞を2回洗浄します(遠心分離機で300×gで5 分間)。 細胞数を数え、最終濃度を1×10⁷ cells/mLに調整します。
   4. 受体血清をPBSで1:25で希釈します。
   5. 希釈した血清50μLを、5個^のドナーラット脾臓球と37°Cで30分間培養×10個5個のドナーラット脾臓を培養します。
   6. 細胞を2mLのPBSで2回洗浄し、400 × g で遠心分離し、4°Cで5分間
   7. 細胞をFITC結合抗ラットIgGおよびPE結合抗ラットIgM抗体(特定のクローンについては 材料表 を参照)で4°Cで1時間インキュベートします。
   8. 細胞を洗浄し、PBSに5 ×^{10 6} cells/mLの濃度で再懸浮させます。
   9. サンプルを解析し、DSA-IgGおよびIgMの平均蛍光強度(MFI)を定量化します。
2. 腎移植片の病理学的検査
   1. 指定された時期に腎移植片を採取します(ST群後の同遺伝子KTはKT後5日目、ST群後の同種KTは6時間、12時間、1日目、1日目、2日、3日目、4日目、5日後)。
   2. 組織サンプルを4%パラホルムアルデヒドに室温で24時間固定します。脱水とクリアリングの後、組織をパラフィンブロックに埋め込み、4μmの断片に切断します。
   3. 切片にはヘマトキシリン・エオシン(HE)および周期酸シフ(PAS)染色を行います。
   4. 免疫組織化学では、切片をEDTAバッファー(pH 9.0)に浸し、圧力鍋で加熱して抗原回収を行います。満圧に達したら5分間維持し、その後自然冷却で室温に戻します。
   5. 切片には3%の過酸化水素で10分間処理します。
   6. CD31およびC4dに対する一次抗体を4°Cで一晩インキュベートします。
   7. 室温で30秒間、DAB+基質クロモゲンを塗布して可視化します。
   8. デジタルスライドスキャナーで染みのある部分をスキャンします。

7. 統計解析

1. 定量データは平均±標準偏差(SD)として提示されます。統計解析は適切な統計ソフトウェアを用いて実施されました。
2. カプラン・マイヤー分析を用いて受容者の生存率を評価します。
3. Studentのt検定を用いて、グループ間の定量データを比較します。
   注:P値<0.05は統計的に有意と見なされます。

結果

腎同種移植の生存期間
ST群後の共生KT群および共生CT群の受容者は、1か月間の観察期間中拒絶反応なく長期生存しました。逆に、同種KT群およびST群後の同種移植KTの生存期間はそれぞれ10.0日±0.7日、6.2日±1.1日であり、両群間で統計的に有意な差がありました(図2A)。

DSAのレベル(IgGおよびIgM)
ST群受容後の同種KTの血清DSA-IgG値は、ST群受容者と比較して7日目から5日目にかけて有意に上昇しました。ST後0日目および3日目に、グループ間でDSA-IgGレベルに統計的に有意な差は認められませんでした。具体的には、ST後7日目に、ST群後の異種KTのDSA-IgGレベルは対照群よりも有意に高く(135.0 ± 11.8 vs 76.0 ± 5.6、P < 0.001)。この差はST後14日目にさらに強まり、DSA-IgGレベルはそれ...

ディスカッション

AAMRは進行が速く、臨床結果が悪影響を及ぼすため、KTでは依然として大きな課題となっています。33,34,35,36です。現在の効果的な抗拒絶反応治療が急性エピソードを逆転させても、患者の40%以上が慢性AMRに進行します。慢性的なAMR診断後、5年間の移植片生存率はしばしば50%を下回ります。C4d陽性患者の4年間の移植片生存率はわずか50%であるのに対し、C4d陰性患者では8年³⁷分経っても約50%のままです。AAMRの発生は主に、受容者の免疫抑制が不十分であることに起因し、それがB細胞の活性化とDSA 24,29,38,39,40,41,42の産生を引き起こします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗CD31モノクローナル抗体	アブカム(イギリス)	AB64543	免疫組織化学(血管内皮細胞の標識) クローン番号:TLD-3A12
反C4d 抗体	ハイカルト・バイオテック(オランダ)	HP8034	免疫組織化学(補体沈着の検出)では希釈は1:50 クローン数:NA(多クローナル)
FITC結合抗ラットIgG抗体	アブカム(イギリス)	AB6840	DSA-IgGレベルのフローサイトメトリック定量 クローン数:多クローナル
ガス麻酔システム	南京カルビンバイオテクノロジー有限公司	KW-MZJ-4	全身麻酔用のイソフルランを装備 クローン番号:NA(多クローナル)
PE結合抗ラットIgM抗体	バイオ・レジェンド	408918	DSA-IgMレベルのフローサイトメトリクス定量に使用 クローン番号:MRM-47
立体定位外科顕微鏡	北京中天広正科技有限公司	TS-39NK	ラット腎移植手術に使用 クローン番号:NA
血管ブルドッグクランプ	ロボズ外科機器会社	RS-5481T	腎移植中の血流遮断に使用 クローン番号:NA