ラットにおける後肢の運動運動学の客観的定量化のための深層学習に基づく多関節同期追跡

Summary

このプロトコルは、マーカーレストレッドミルテストと深層学習駆動の多関節軌跡自動ラベリングを用いて、ラット後肢の運動学的評価パイプラインを構築し、再現可能な動きの定量化を可能にします。

Abstract

ラットの歩行の正確かつ客観的な評価は、神経科学や運動学の研究分野において不可欠です。従来のシステムは間接的な歩行推論にフットプリントイメージングに依存することが多いが、後肢の多関節運動学を完全に捉えることはできない。本研究は、カスタムディープラーニングアルゴリズムとプログラム可能な重量サポートトレッドミルを統合し、複数の下肢関節のリアルタイム追跡と多次元運動学的定量化を可能にする、げっ歯類向けのマーカーレストレッドミルベースの歩行解析システムを確立します。このシステムは、変調速度(0-300 mm/s)、傾斜(±30°勾配)、および段階的な重量支持(0-500 g)条件下での歩行サイクルパラメータ、関節軌跡、力の分布パターン、運動の滑らかさを自動的に抽出し、神経筋行動研究のための客観的な評価ツールを提供します。脊髄損傷(SCI)モデルを用いて、健康な齧歯類と負傷した齧歯類間の関節可動域、軌道の連続性、推進力出力、運動の滑らかさの多次元差を検出する感度を示し、病気の識別およびグレード評価能力を検証しました。従来の主観的なスコアやフットプリント方式と比べて、このプラットフォームは個人のバイアスや低次元データの制限を排除し、ディープラーニング駆動のアーキテクチャと高スループットのデータ収集の利点を組み合わせています。中枢神経または末梢神経損傷、神経変性疾患、筋骨格系障害、加齢過程に関する研究に応用可能です。神経電気生理学モジュールの同期統合により、歩行と神経信号の時間的結合をさらに可能にし、中枢・末梢制御メカニズムの解析と神経調節戦略の開発のための方法論的枠組みを確立します。

Introduction

現代の神経科学およびロコモーター研究において、客観的な歩行の定量化は神経筋機能の解明、疾患メカニズムの解明、リハビリ戦略の評価に不可欠となっています^。その高い時空間分解能により、神経指令、筋肉活性化プロファイル、骨格力学間の微妙な相乗効果の変化を捉え、脊髄上経路、末梢フィードバック、機械的文脈の協調を調査するための実証的基盤を築きます。再現可能なキネマティック指標は病変、変性変化、治療効果の検出感度を高め、医薬品および医療機器の開発パイプラインを加速させます^。

CatWalk、DigiGait、簡易化されたフットプリント分析などの従来の評価プラットフォームは、足底接触パターンに基づいて間接的に関節運動学を推定します。これらの手法は、後肢の多関節運動学的複雑さを捉えきれない低解像度かつ一貫性のない指標を生み出します^。3,4。本手法の全体的な目標は、齧歯類モデル向けに特別に設計された高精度でマーカーなしかつ重量支持のある歩行解析システムを確立することです。したがって、我々は以下の新しい枠組みを確立します。(i) 連続多関節画像撮影中に制御された軸方向荷重(0-100%体重)下で齧歯類を直立姿勢に保つこと、(ii) 深層学習を通じて側面図解析から矢状面の解剖学的ランドマークを直接位置特定し2D空間軌道を生成すること、(iii) 時間分解された関節角およびセグメント運動学を統計モデリングのためにエクスポートすること⁵.基本的に、このフレームワークはコンピュータビジョン課題へのディープラーニングの応用に基づいており、ビデオデータから堅牢な共同特徴抽出を可能にします。

既存のシステムと比べて、このプラットフォームは4つの主要な利点を提供します。マーカーレス動作により、反射タグや埋め込みタグを排除し、手続きの複雑さや動作アー^{ティファクト}を大幅に削減します。統合されたフォースフィードバックサスペンションシステムは、0-100%までの正確な体重サポートを可能にし、市販トレッドミル7にはない負荷から荷降ろしまでの全ての歩行評価を可能に^します。ディープラーニングアーキテクチャは、新しい株、年齢、病的状態に対する迅速な再学習を可能にし、スケーラビリティ⁸において手動トラッキングを上回ります。また、高精度な多関節空間座標により、異常歩行パターンの定量的プロファイリングと組み合わせた関節間運動学の細かい解析が可能です。

このプロトコルは広く適用可能です。これは、変調された機械的要求下での上脊髄制御、固有受容フィーフィードバックループ、筋肉の相乗効果の研究^{を可能にします9。}病態生理学的には、脊髄損傷(SCI)、脳卒中、神経変性、末梢神経障害、神経筋疾患に対する感度の高い運動バイオマーカーを提供します^8,10。治療的には、高分解能運動学から統計的パワーを高めた薬理学的またはデバイスベースの介入の縦断的評価を支援します¹¹。このモジュール構造により、筋電図(EMG)や脳信号などの補完的なプラットフォームとのシームレスな統合が可能となり、下肢の運動における神経相関の機械的復号を促進します。

Protocol

すべての動物処置は北京脳研究所の動物ケア・使用委員会の承認を受け、実験動物のケアおよび使用ガイドラインに準拠しています。手技関連の有害事象は認められませんでした。

1. 装備の準備

1. トレッドミルシステムの電源を入れ、タッチスクリーンの スピードコントロール ボタンを選択します。
2. ベルトを低速で30秒走らせて、ベルトがずれるかどうかを観察します。
3. 傾斜コントロールボタンを選択し、傾斜を0°に設定し、ゼロをクリックして表示値がレベルバブルと一致しているか確認してください。
4. サスペンションインターフェースに入り、10gの重りを吊るして張力測定値が0.10Nに近いか確認します。
5. 産業用パーソナルコンピュータ(IPC)をオンにし、ビデオ取得・解析ソフトウェアを入力します。
6. その日の実験用のディレクトリを作成し、実験名、動物ID、実験グループ、速度、傾斜、減量率などの情報を含めます。
7. 高速産業用カメラ(UC70、解像度:1280X1024、フレームレート:60fps)、マニュアルフォーカスレンズ(f=12mm)をアルミプロファイルブラケットに固定します。カメラレンズをトレッドミルの縦軸に対して垂直に位置させ、厳密に横方向の映像を捉え、トレッドミルベルト面から15cmの水平作業距離を保ちます。
8. レンズを水平に置き、バブルレベルを使ってラットの胴体がフレームの中央2/3を占めるようにします。ピントと絞りを調整して、背面の定規(1cmグリッド)の目盛り線がはっきり見えるまで調整します。
9. プレビュー をクリックして、 トレーリングがなく背景の明るさが均一であることを確認しましょう。画像が暗すぎる場合は、発光ダイオード(LED)バックライトを使って明るさを上げます。露出オーバーの場合はゲインを下げ、絞りを適切に絞りましょう。
10. 「 録画開始 」をクリックして、データ記録の品質をテストしてください。録画 停止 をクリックし、データ保存パスを設定します。上記の機器試験を完了したら、動物実験を開始します。

2. 動物の準備と走行試験

1. ネズミと元のケージを実験室に移し、10分間休ませます。この期間中は、食料や水の自由なアクセスを許可してください。
2. 電子体重計(0.1gまで正確に)を使って体重を記録します。体重が合ったラット(±10 g)を組み合わせて、体のサイズによる混同効果を最小限に抑えましょう。
3. 後肢の毛色が背景と十分に対比しない場合は、電動シェーバーを使って太ももの外側と下腿の裏側の幅1cmの毛の帯を優しく取り除き、関節認識の精度を高めます。
4. 次に柔らかいテープで股関節から足首までの直線距離(mm)を測り、これがその後のストライドの正規化の基礎となります。
5. 手袋をはめ、ネズミを掴み、弾性のある胸ストラップを前脇の下に巻きつけ、調整可能なスライドレールに取り付けます。ストラップが動物の呼吸に影響を与えずに指を一本挿入できる程度に緩くしていることを確認してください。
6. 画面上の張力値を観察しながら、サスペンションアームのハンドルをゆっくり回転させ、徐々に目標の軽量化比まで上げていきます。ネズミの後肢がまだ地面にしっかりと触れているか確認してください。
7. グリップバーの高さを調整してください。トップノブを緩め、立ったときにネズミの鼻先より少し下に前方のグリップバーを配置し、動物が頭を過度に後ろに傾けたり前かがみになったりせずに簡単に掴めるようにします。
8. タッチコントロール画面で 速度 を150 mm/s、 傾斜 を0°に設定します。動物を特定の体重サポートレベルに適応させるために、10分間の順応セッションを実施します。ラットのストレスサイン(例えば凍えや排泄)を監視してください。
   1. 歩様が不規則(>3回中断/分)と定義される場合は、持続時間を2分ずつ増やし、最大20分まで延長します。
9. 馴染は、ラットが少なくとも60秒間連続的かつ均一な歩幅を維持し、足を引きずらず、尾が自然に垂れ下がり、硬直しない状態とみなされます。最大順応期間を過ぎてもこれらの基準を満たさない動物は除外します。
10. 形式的な実験に必要なパラメータを入力します。タッチスクリーン上で希望する速度(0-300 mm/sの任意の値)と傾斜(−30°から+30°)を順次入力し、トレッドミルベルトの方向を選択します。
11. トレッドミルを起動した後、ネズミの歩行姿勢を観察してください。もし中央の1/3部分からずれたら、ナックルで右側の壁を軽く一度叩いてみてください。ほとんどの動物は自分で位置を修正します。連続した2回の修正が効果がなければ、ラットの位置を変えて再記録します。
12. 安定化後は 「録画開始 」をクリックし、少なくとも5回の完全な歩行サイクルを連続して記録してください。
13. 各試行終了後、すぐに速度を0に落とし、胸のストラップを外してネズミを対応するケージに戻します。
14. 休息時間には水を与え、試行の間に少なくとも3分の間隔を空けてください。
15. 同じ条件下で少なくとも3件の試験を記録してください。動物が6回以上の試行を連続して走る場合は、疲労を防ぐためにさらに2分間の休息を追加してください。
16. 正式実験の5日前に5日間連続して事前トレーニングを行います。1日10分間、速度150 mm/s、傾斜0°、体重減少ゼロで歩き、歩行を観察します。

3. 歩行データの抽出

1. まず、通常約10秒の目標歩行を含むセグメントを抽出し、これには少なくとも10回の解析可能な安定した歩行サイクルが含まれている必要があります。
2. .movファイルを解析ソフトにインポートし、ラットの個別情報(ID番号、グループ、実験条件など)を登録します。
   注:このシステムは高性能ポーズ推定に最適化された最先端のニューラルネットワークであるYOLO-NAS Poseアーキテクチャを採用しています。
   データセット構築:モデルは6,000フレームの堅牢なデータセットで訓練されました。これらのフレームには、DeepLabCutのグラフィカルユーザーインターフェースを用いて、5つの主要な後肢関節(腸骨稜、股関節、膝、足首、つま先)の座標が手動で注釈付けられ、地上の正確さを確保しました。
   トレーニング:ネットワークはNVIDIA RTX 3080 GPU上で移行学習を行い、YOLO-NAS Poseの重みをラットの後肢の特定の特徴に合わせて適応させました。
   初期化:ソフトウェア内で事前学習済みの「Rat_Hindlimb_YOLO_v1」モデルを選択し、信頼度閾値を0.8に設定して低確実性のキーポイントを除外します。
   解析段階では、YOLO-NASポーズモデルが映像ストリームをフレームごとに処理します。従来のコンピュータビジョン手法が背景減算に依存するのに対し、この深層学習アーキテクチャはラットを直接位置特定し、バウンディングボックス内の共同座標を予測します。
   後処理:アルゴリズムは確率マップからx座標とy座標を抽出します。高周波ジッターを軽減するために、生の軌道には中央値フィルター(ウィンドウサイズ:3フレーム)が適用されます。
   出力:システムはビデオフレーム内の5つのターゲット関節に成功裏にロックオンし、歩行シーケンス全体に対して時間分解された空間座標を生成します。これらのデータは自動的に.csvファイルとしてエクスポートされ、運動学的計算が行われます。同時にキャプチャされたバックボード定規(1cmグリッド)を使い、変換関係を確立し、自動的にスケーリングファクターを計算し、ピクセル座標をミリメートル単位で一括変換します。
3. 各節の空間位置座標を時間経過でエクスポートし、.csvファイルとしてエクスポートして後続のインデックス計算に用いてください。
   注:ソフトウェアは歩幅、歩幅、足の高さを自動的に計算し、5つの下肢関節の空間位置や角度の変化を時間とともにエクスポートします。つま先の高さに基づき、ソフトウェアは各ステップを自動的にスイングフェーズとスタンスフェーズに分け、各歩様サイクル内のスイングフェーズとスタンスフェーズの割合を計算します。

4. グループ間の運動学的比較

1. グループ内の各歩行サイクルを0%(足の接触)から100%(同じ足の接触)まで正規化し、異なるサイクルの長さを統一し、グループ平均化と比較を容易にします。歩行動態を示すために生成可能な画像の種類は 補足ファイル1に記載されています。

5. 統計分析

1. すべての統計解析はGraphPad Prismソフトウェアを使用して実施してください。
2. シャピロ・ウィルク検定を用いてデータ分布の正規性を検証します。
3. 運動学的検証および体格指数(BMI)のデモンストレーション比較については、平均 ± SEM としてデータを提示します。
4. ペアなしの学生t検定を用いて、2つの実験条件の違いを評価します。
5. 統計的有意の閾値を *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.005 と定義します。このパイロット検証研究には合計n=3頭のラットが含まれていました。

6. 電気生理モジュールの埋め込み

1. 動物モデリングが終わったら、電気生理記録装置を埋め込みます。
2. 神経記録のためには、頭蓋骨表面、硬膜外空間、または大脳皮質に電極を置き、脳信号を記録します。
3. 脊髄記録には、椎間孔の硬膜外空間に記録電極を挿入します。
4. EMG記録のために、筋肉に双極性銀線を埋め込み、筋肉の電気活動を記録します。
5. 着床後は5〜7日間動物を回復させ、毎日傷や歩行を確認して感染や痛みの兆候がないか確認してからトレッドミル実験に進みます。
6. 上記の装備と動物の準備を完了させてください。
7. 電気生理学的パラメータと運動動画の収集を同期させ、電気生理学的データとビデオデータが同じタイムスタンプを共有するようにします。
8. データ収集後、解析中に神経信号をビデオフレームと整合させ、歩行サイクルの異なる段階における電気生理学的パターンを直感的に観察し、中枢-末梢結合メカニズムの探求に直接的な証拠を提供します。

Results

トレッドミルシステム構造の回路図と実際の写真はそれぞれ 図1A、Bに示されています。この装置はマーカーなしで高コントラストの横画像を取得することができます。トレッドミルは速度、傾斜、方向、軽量化の調整に対応し、数値制御パネルを備えています。付随するソフトウェアインターフェースには、リアルタイムの監視・取得インターフェース、ビデオアップロードおよび歩行抽出解析インターフェースが含まれています。自動歩様注釈のためのディープラーニングモジュールが組み込まれており、後肢の腸骨稜、股関節、膝、足首、足首、足の関節の連続的な動きデータを高フレームレートかつ高精度で手動注釈なしで取得できます(図1C)。

健康なラットとSCIラットの比較では、同じ視野内の主要な身体ポイントのビデオ抽出と自動注釈により、異なる運動学的表現型が明らかになります。重度のSCIラットは標準プロトコルに従...

Discussion

このプロトコルは、ラットのトレッドミルを使った歩行分析システムとその運用手順を明らかにし、神経筋行動研究のための多次元かつ客観的な評価ツールを提供します。例例研究におけるSCIと健康なラットの歩行パラメータのグループ間比較で示されたように、システムは連続的な高フレームレート歩行ビデオグラフィーとAI駆動の自動多関節注釈アルゴリズムを通じて被験者の下肢の生の空間的動き座標を取得します。これにより、歩行軌跡、フェーズセグメンテーション、力指数分布パターンを含む包括的な定量分析や図示が可能になります。SCIの応用に加え、このシステムは中枢神経系損傷(例:脳卒中、脳出血)、神経変性疾患(例:アルツハイマー病、パーキンソン病)、末梢神経筋疾患(例:坐骨神経損傷、筋ジストロフィー)、および加^{齢研究における}歩行変化の調査を促進します。

このプロトコルの成功した実装には、いくつかの重要なステップがかかっています。まず、動物の順応が極めて重要であり、トレッドミルでの事前トレーニングが不...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
歩行AI注釈&取得ソフトウェア	上海ClinAITrial Technology Co., Ltd.	マウスAI	MouseAIはMOVEMETRICSトレッドミル向けの統合分析 ソフトウェアであり、ビデオ録画、メタデータログ、自動歩行分析を一つのワークフローに統合しています。
機械的衝撃	RWDライフサイエンス、中国・深圳
マルチチャネル電気物理学論理記録システム	柯道(蘇州)脳コンピュータ技術株式会社、および	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128Aは、小型から大型の実験動物への高解像度神経記録のために設計された、コンパクトな128チャンネル の生体内電気生理学取得システムです。軽量のプラグアンドプレイヘッドステージ(&1.3 g)、16ビットA/D変換、プログラム可能アンプを統合し、EEG、ECoG、LFP、スパイク、EMG、ECG信号を0.1 Hzから30 kHzまでの&leでキャプチャします。2.4 & マイクロ;Vシステムノイズと>10 GΩ入力インピーダンス。RHD128Aは、脳と機械のインターフェース、 神経変性およびリハビリテーションの研究を加速させるために、堅牢でユーザー向けの拡張可能な神経データを提供します。
トレッドミル	上海ClinAITrial Technology Co., Ltd.	ムーブメトリクス	MOVEMETRICSは、高度な齧歯類歩行分析のための高精度 計測付きトレッドミルです。