本研究は、がんゲノムアトラスのデータを用いて、肺扁平上皮がん(LUSC)における10-lncRNA酸化ストレス関連シグネチャーを特定します。検証では臨床的な予測性能が限定的であることが示されましたが、シグネチャーは免疫微小環境パターンを区別し、 in vitro アッセイは LINC01615 移動-侵入関連のさらなる機構研究候補として支持されました。
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研究記事
* These authors contributed equally
本研究は、がんゲノムアトラスのデータを用いて、肺扁平上皮がん(LUSC)における10-lncRNA酸化ストレス関連シグネチャーを特定します。検証では臨床的な予測性能が限定的であることが示されましたが、シグネチャーは免疫微小環境パターンを区別し、 in vitro アッセイは LINC01615 移動-侵入関連のさらなる機構研究候補として支持されました。
長鎖非コードRNA(lncRNA)は、肺扁平上皮がん(LUSC)の予後値および免疫浸潤に有意な影響を与えます。本研究は、酸化ストレスに関連するlncRNAが扁平上皮がん(SCC)にどのように影響するかを示すことを目的としました。がんゲノムアトラス(TCGA)データセットは、LUSCのトランスクリプトーム情報および関連する臨床データを収集しました。予後モデルを構築するために、腫瘍と健康組織におけるOS遺伝子の異常発現および悪性腫瘍との関連を比較した一連のバイオインフォマティクス解析を用いて、予後関連遺伝子10個を特定しました。被験者は10遺伝子署名に基づく中央値リスクスコアに基づき、高リスク群と低リスク群に階層化されました。数学的リスクモデルは検証コホート(AUC ~ 0.5)において独立した予測性能が限定的であることを示しましたが、機能的および免疫学的評価ではリスク層間で腫瘍微小環境(TME)に有意な違いが認められました。具体的には、高リスク患者は低リスク患者と比べて異なる免疫浸潤プロファイルを示し、免疫スコアも変化しました。したがって、この酸化ストレス関連のlncRNAシグネチャーは直接的な臨床予測ツールとして機能するのではなく、LUSCの免疫状況に関する貴重な生物学的洞察を提供し、さらなるメカニズム的調査のための治療標的を浮き彫りにします。
肺がんは悪性腫瘍の中で最も高い発症率と死亡率を示します。非小細胞肺がん(NSCLC)の組織学的変異の中で、LUP-Squamous Celloma(LUSC)が主要なサブタイプであり、しばしば臨床的転帰が悪く、高効果の標的治療が不足していることと相関しています。これは肺腺癌2と比較してです。主な治療アプローチには外科的介入、放射線療法、化学療法が含まれますが、進行したLUSCの患者はしばしば治療抵抗を示します3。したがって、予後層化を改善し、LUSC4の探索的治療戦略を導くために、堅牢な分子バイオマーカーの特定が緊急に求められています。
酸化ストレスは、活性酸素種(ROS)の病理的蓄積を特徴とし、腫瘍の開始、成長、転移において重要な役割を果たします。効率的なROSクリアランス機構がない場合、ROSレベルが上昇するとDNA損傷や遺伝子毒性が誘発され、最終的にはがんの発症に寄与する様々なゲノム変異を引き起こします。特に、研究ではROSレベルと酸化ストレスの上昇が一貫して示されており、肺がんの病因に特異的に関連しています5,6。最近の研究では、酸化ストレスに関連する遺伝子クラスターが肺悪性腫瘍における前向き予後バイオマーカーとして機能する可能性がさらに示されています。長非コードRNA(lncRNA)は遺伝子発現の重要な調節因子として登場し、さまざまな悪性腫瘍における有望な予後バイオマーカーを示しています。以前の注目すべき研究7では、LUAD(LUAD)に対する酸化ストレス関連lncRNA予後モデルが確立されましたが、LUSCにおけるこれらのlncRNAの具体的な予後状況や免疫への影響は、依然としてほとんど解明されていません。
本研究では、著者らはTCGAデータセットを体系的に解析し、LUSCに特化した新規の酸化ストレス関連lncRNAシグネチャーを構築しました。さらに、純粋なバイオインフォマティクス解析とは異なり、本研究はin vitro 実験検証を取り入れ、主要な同定されたlncRNA(例:Linc01615)の生物学的機能的役割を確認しています。診断や治療の即時的な臨床的応用を主張するのではなく、本研究は主にLUSCにおける酸化ストレスの潜在的なメカニズムと腫瘍免疫微小環境との関連を探ることを目指しています。これらの発見は、貴重な生物学的洞察を提供し、将来のメカニズム的研究における潜在的な治療標的を浮き彫りにすることを目的としています。
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データ取得と前処理
本研究で分析されたすべてのデータは、 資料表に掲載されている一般公開のTCGAデータベースから取得されました。本研究は、国立衛生研究所(NIH)のゲノムデータ共有方針およびTCGAが提供した出版ガイドラインに厳格に従って行われました。データセットは非特定化された公開臨床および多オミクスデータで構成されているため、本研究はさらなる機関審査委員会(IRB)承認の対象外とされました。LUSCのトランスクリプトームデータおよび対応する臨床情報は、がんゲノムアトラス(TCGA)データベースからダウンロードされました。当初、コホートは551サンプル(腫瘍502件、正常49件)で構成されていました。この予後モデルの堅牢性を確保するため、完全全生存期間(OS)データ、生存状況、または重要な臨床特性を欠く患者は下流の生存分析から除外されました。この厳格なフィルタリングプロセスを経て、最終的な470名のLUSC患者からなる分析コホートが確立されました。これら470名の患者は、リスクモデルの構築と検証のために、トレーニングセット(n = 235)とテストセット(n = 235)にランダムに分けられました。合計792の酸化ストレス関連遺伝子が、関連性スコア≥7を含む基準を用いて、 Table of Materialsに掲載されたGeneCardsデータベースを通じて収集されました。limmaパッケージ(バージョン3.66.0)は、異なる発現の酸化ストレス遺伝子をスクリーニングするために利用されました。火山プロットはggplot2パッケージ(バージョン4.0.2)を使って作成されました。トレーニング群と試験群の間で、臨床的特徴に顕著な差異は認められませんでした(p > 0.05)。トレーニングセットはモデル構築に、テストセットは内部検証に使用されました。
リスクモデルの構築と検証
酸化ストレスに関連するlncRNAを特定するために、ピアソン共発現解析が行われました。著者らは、同定された異なる発現の酸化ストレス関連遺伝子の発現プロファイルと、TCGA-LUSCデータセット内のすべての注釈付きlncRNAとの相関を評価しました。共発現lncRNAの選択に関する相関基準は相関係数|R|> 0.4、p値は0.001<。これらの閾値に基づき、合計6,088個の酸化ストレス関連候補LNNNが導出・抽出されました。その後、これら6,088の候補lncRNAはLASSO回帰および補完的解析手法を用いて予後リスクモデルを構築しました。処理されたデータを用いて、患者参加者は高リスク層と低リスク層に分類されました。
独立因子とROC曲線
独立予後変数を特定するために、単変量および多変量のCox回帰モデルが用いられました。具体的には、多重単変量Cox回帰解析(n=236検定)における家族ごとの誤差率を制御するため、ボンフェローニ補正を適用し、厳格に調整された有意性閾値をp < 0.00021(0.05 / 236と計算)に設定しました。
生存分析および主成分分析
生存パッケージ(バージョン3.8-6)は全体生存率(OS)率の計算に用いられ、主成分分析(PCA)はリスクモデルの堅牢性評価に用いられました。
ノモグラム
適合指数はRのrmsパッケージを用いてノモグラムの信頼性を評価しました。腫瘍変異負荷(TMB)はmaftoolsパッケージ(バージョン2.22.0)を用いて評価・可視化されました。ssGSEAを含むアルゴリズムが免疫浸潤の検出に用いられました。さらに、ggpubrパッケージ(バージョン0.6.3)を用いてリスク群間の免疫チェックポイントを比較しました。ESTIMATEアルゴリズムを用いて腫瘍微小環境(TME)の特徴付けを行いました。
関数解析
RのclusterProfilerパッケージ(バージョン4.14.6)はエンリッチメント解析に使用されました。機能経路のさらなる探求のために、GSEA解析が実施されました。Cytoscapeを用いて、観察のための共発現ネットワークが作成されました。
実験的手法
細胞培養条件とグルーピング
NCI-H520ヒト肺扁平上皮癌細胞株(RRID: CVCL_1566;材料表に記載)は、RPMI-1640培地で培養され、胎児用牛血清10%(v/v)およびペニシリン-ストレプトマイシン1%を補足しました。ログフェーズ細胞は6ウェル培養プレートにシードされました。順調に適合すると、細胞は3つの異なる実験群にランダムに割り当てられました。標準培養条件下で維持されたブランク対照群、非標的siRNAでトランスフェクトされた陰性対照群(si-NC)、そしてLINC01615特異的siRNAをトランスフェクトした実験的ノックダウン群(si-LINC01615)。
細胞トランスフェクション
si-LINC01615およびsi-NC試薬は氷上で解凍されました。トランスフェクション複合体調製のために、血清不含有のRPMI-1640培地95μLを無菌遠心分離チューブにピペットし、その後、それぞれのsiRNA3μgとLipo3000トランスフェクション試薬5μLを順次添加しました。同じ手順がsiLINC01615とsiNC群の両方に適用されました。溶液は温和に混合され、室温で5分間培養されて複合体の形成を促進し、1本あたり約200μLの総体積が得られました。その後、この混合物は指定された培養井戸に均一に分布され、800μLのRPMI-1640基底培地が収容されました。37°Cで6時間の潜伏後、トランスフェクション培地を慎重に吸引し、新鮮な完全培養培地に交換しました。
創傷治癒(スクラッチ)アッセイ
創傷治癒アッセイでは、対数増殖中のNCI-H520細胞(RRID: CVCL_1566)を6ウェル培養プレートに5.6 ×105 セル/ウェルにシードしました。95〜100%の合流に達すると、無菌の200μLピペットチップを使ってセルの単層をウェルの中心に垂直に引っかき、人工的に線状の傷を作りました。その後、ウェルはPBSで3回洗浄され、剥離した細胞や細胞残骸を除去し、血清不含有のRPMI-1640培地で培養されました。同じ損傷部位の画像は、倒立顕微鏡を用いて0、24、48時間に撮影しました。創傷治癒面積はImageJ(RRID: SCR_003070;材料表に記載)を用いてギャップ距離を測定し、移動速度は0時間時の初期創傷面積に対して計算されました。
トランスウェルの移動および侵入アッセイ
細胞移動および侵入能力は、 材料表に記載された8.0μm孔径ポリカーボネート膜挿入部を備えた24井戸のトランスウェルチャンバーを用いて評価されました。侵入アッセイでは、頂端チャンバーに50μLのマトリジェル(血清フリー培地で1:8希釈、 材料表に記載)で事前にコーティングされ、37°Cで2時間培養されて重合されました。一方、移動アッセイではコーティングされていない挿入物を使用しました。細胞トランスフェクションと24時間の血清飢餓期間を経て、NCI-H520細胞を採取し、血清フリーのRPMI-1640培地に再懸濁させ、200 μLで1.8 ×10 5 細胞/ウェルの密度で頂端室にシードしました。基底室には600μLのRPMI-1640培地が充填され、化学誘導剤として10%のFBSが補足されました。37°Cで5%のCO₂で48時間の培養後、挿入物を取り外し、PBSで3回洗浄しました。膜の頂端に残った細胞は、濡れた綿棒で優しく拭き取った。基底外側面に移動したり侵入した細胞は、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定され、室温で30分間材料 表 に記載されたギエムサ溶液で染色されました。移動および侵入した細胞は、倒立顕微鏡を40倍倍率で40倍で、各挿入物ごとにランダムに選ばれた3つの光学フィールドで可視化・列挙しました。
統計解析
すべての統計解析およびデータ可視化はRソフトウェア(バージョン4.1.2)を使用して実施されました。リッド:SCR_001905;材料表に記載 されています)。本研究で使用されたすべてのRパッケージの具体的なバージョン番号は、それぞれの方法論的サブセクションで明確に記載されています。有意な値は、特に報告がない限りp<0.05と慣例的に定義されていました。複数比較(例:多重単変量Cox回帰分析)が行われた場合、Bonferroni法が厳格に適用され、家族ごとの誤差率(FWER)を維持し、正確な調整済み閾値(例:p < 0.00021)はそれぞれの方法論小節で詳細に記載されています。定量 的なin vitro データは平均±標準偏差として表現され、適宜Studentのt検定または一元ANOVAを用いて解析されました。
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酸化ストレスに関する差異発現遺伝子の同定
ワークフローは 図1に示されています。最終分析コホート(470名のLUSC患者)の臨床的特徴は 表1に詳述されています。関連スコアの定義された閾値≥7に基づき、著者らはGeneCardsデータベースから合計792の酸化ストレス関連遺伝子を取得しました(補足ファイル1)。正常サンプルとLUSCサンプルの間で、178の酸化ストレス遺伝子が有意な発現レベルの変化を示しました(補足ファイル2)。発現パターンは火山プロット(図2A)およびヒートマップ(図2B)で可視化されました。そのうち10遺伝子が上位化され、168個がダウンレギュレーションされました。
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肺扁平上皮癌(LUSC)は、非小細胞肺がんの多数かつ非常に攻撃的な組織学的サブタイプであり、しばしば厳しい生存率と従来の治療法に対する耐性が特徴です 8,9。新たな証拠は、酸化ストレスがさまざまな悪性腫瘍の病因および進行において重要な要因であることを強調しています。活性酸素種(ROS)の病理的蓄積や、KEAP1/NRF2シグナル伝達軸などの細胞抗酸化防御システムの調節障害は、肺がんにおける腫瘍の開始、細胞アポトーシス、治療抵抗性に大きな影響を与えます(10,11,12)。したがって、強固で酸化ストレスに関連する予後バイオマーカーの特定は、リスク階層化の精緻化とLUSC患者における新規治療的脆弱性の探求に不可欠です。
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著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。原稿作成の際には人工知能(AI)ツールやAI支援技術は一切使用されませんでした。すべての科学的内容、分析、生データ、結論は著者によって独立して生成、レビュー、承認されました。
この研究は中国国家自然科学基金(助成金番号8200430)の支援を受けました。湖南中医大学および湖南中医学院附属病院を含む寄稿者および関係機関の皆様のリソースと支援に心から感謝申し上げます。また、この研究に貢献してくださったすべての研究者および参加者の皆様にも感謝申し上げます。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 4% パラホルムアルデヒド | Beyotime | P0099 | 細胞の固定に使用 |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | コエクスプレッションネットワーク作成に使用 |
| 胎児ウシ血清 (FBS) | Gibco | 10099-141 | 最終濃度10% (v/v) |
| GeneCardsデータベース | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | 酸化ストレス関連遺伝子のスクリーニング |
| ギムザ染色 | Sigma-Aldrich | GS500 | 移動/侵入細胞の染色に使用 |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | 創傷ギャップ定量化に使用 |
| Lipo3000トランスフェクション試薬 | GLPBIO | GK20006 | siRNAトランスフェクションに使用 |
| マトリゲル | Corning | 356234 | 無血清培地で1:8に希釈 |
| NCI-H520 ヒト肺扁平上皮癌 | ATCC | HTB-182 | インビトロ検証アッセイに使用 |
| PBS (リン酸緩衝生理食塩水) | Gibco | 10010-023 | 細胞洗浄に使用 |
| ペニシリン-ストレプトマイシン (1%) | Gibco | 15140-122 | 細胞培養抗生物質サプリメント |
| Rソフトウェア (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | 統計解析と可視化 |
| RPMI-1640培地 | Gibco | 11875-093 | 細胞培養培地 |
| がんゲノムアトラス (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | トランスクリプトームおよび臨床データソース |
| トランスウェルチャンバー (8.0 μm) | Corning | 3422 | 移動および侵入アッセイに使用 |