パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

Summary

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。

Abstract

レーザーキャプチャマイクロディセクション(LCM)は、複雑な組織内の特定の細胞群に、 現地 での可視化と分離を通じて空間的アクセスを提供します。固定組織の組織学的に定義された領域のトランスクリプトミック解析を可能にするため、パラホルマルデヒド(PFA)固定および最適切削温度(OCT)化合物埋め込みマウス肝切片からのRNA抽出に関する詳細なLCMプロトコルを提示します。このプロトコルは、組織固定、ショ糖脱水、OCT埋め込み、クライオセクシング、ヘマトキシリン染色、ターゲット組織学的部位のレーザー捕捉を含むワークフローを通じて、約1,000個のマイクロスケールサンプルの同定と収集を詳細に行います。この方法を用いると、高純度RNA(A₂₆₀/A₂₈₀: 1.9-2.1)が得られました。RNA完全数(RIN)は6.7±0.9で、PFA固定に伴う断片化が予想されていました。しかし、 βアクチン の定量PCRではCt値が17-19となり、断片化最適化ライブラリー調製を用いたRNAシーケンスでは高品質なリードが得られ、>90%の塩基がQ20およびQ30の閾値を満たし、RNAが感度度な下流解析に適していることが確認されました。したがって、このプロトコルはPFA固定肝組織の特定の組織学的領域から純度と完全性のRNAを提供することで、空間的に分解された標的的遺伝子発現解析を可能にします。

Introduction

空間的に解明された遺伝子発現プロファイルの正確な取得は、健康や疾患における組織の異質性を理解する上で極めて重要です。単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は^{細胞分解能}が高い^1,2を提供しますが、本来の空間的文脈を失い、組織解離時に転写プロファイルを変化させる可能性があります^3,4。公に特定された特定のマーカーを欠く細胞タイプでは、免疫蛍光に基づく選別や免疫磁気分離による純粋な集団の取得^{は依然として}困難です^5,6。VisiumやGeoMxなどの空間トランスクリプトミクス技術は、高スループットの遺伝子発現データの現地捕捉を可能にしますが、単一細胞またはサブ^{セルレベルでの}空間分解能は制限^{されています。}逆に、画像ベースの空間トランスクリプトミクスはナノメートルレベルの解像度を達成できますが、遺伝子検出スループットは制限^{されています。}これは、特定の形態領域に対する仮説主導の分析における継続的なギャップを浮き彫りにしています。

レーザーキャプチャマイクロディセクション(LCM)は、観察可能な表現型に基づいて組織切片や生細胞培養から顕微鏡誘導下で特定の細胞を選択・分離することを可能にします。このアプローチは細胞構造と^{空間情報を保存}します。この技術は肝疾患研究の下流解析に広く応用されています。例えば、LCMは肝生検から胆道上皮細胞を採取し、原発性胆管炎¹¹におけるその免疫調節役割を明らかにするために用いられています。さらに、実験モデルからγグルタミルトランスフェラーゼ(GGT)陽性組織を分離し、部位特異的な Ggt1 遺伝子発現の確認にも用いられています¹²。しかし、これらの研究は主に新鮮な凍結組織に焦点を当てており、臨床的注釈や長期追跡が欠如していることが多い^です。これに対し、化学的に固定された組織は組織病理診断に利点をもたらします¹⁴。LCMベースのRNAシーケンシング(RNA-Seq)は、アーカイブされた大規模なホルマリン固定およびパラフィン埋め込み(FFPE)肝標本に成功裏に適用されています¹⁵。しかし、パラホルマルデヒド(PFA)固定および最適切削温度(OCT)化合物埋め込み肝組織のマイクロスケールサンプルに特化した堅牢なLCMベースの遺伝子発現プロファイリングプロトコルは存在しません。

この未充足のニーズに対応するため、PFA固定かつOCT埋め込みのクライオセクシングを用いた包括的なプロトコルが最適化されました。このプロトコルは、感度の高いLCM-RNA^{アプリケーションにおける}FFPEワークフローの限界(例:長時間の処理や過酷な化学物質)に対応します。これに対し、PFA固定およびOCT埋め込みサンプルの固定および埋め込みプロセスは比較的単純かつ柔軟であり、RNAの完全性と組織形態の両方を保つ高品質な断片の迅速な準備を可能にします。さらに、このプロトコルは紫外線(UV)レーザーベースのLCMシステムを用いて実行されます。赤外線システムと比較して、UV-LCMはより細かい切断解像度を提供し、直接かつ非接触のサンプル採取を可能にし、汚染を最小限に抑え、複雑な組織構造から微小スケール領域を正確に分離することに適しています(^17,18)。したがって、このプロトコルの運用価値は、PFA固定肝切片から微小スケール領域(~1,000細胞)を形態保存的に捉えられる能力にあります。これにより、標的遺伝子発現解析に適したRNAが得られ、組織病理学的特徴と局所的なトランスクリプトムプロファイルの直接的な相関が可能となります。

ここでは、PFA固定かつOCT埋め込みされたマウス肝切片からマイクロスケール組織(~1,000細胞)をレーザーキャプチャマイクロ解剖し、その後RNA抽出と定量逆転写PCRおよびRNAシーケンスによる下流解析を行うプロトコルを説明します。これらの処置は5日以内に完了可能です。

このプロトコルの適用可能性を評価する際の参考として、主な範囲と制限事項を以下にまとめます。このプロトコルは、主にマウス肝臓に応用されるPFA固定型OCT埋め込み組織から、特定の組織学的領域を仮説駆動型かつ形態学的に誘導するサンプリングに最適化されています。空間的に分解されたトランスクリプトミックデータを、固定標本に保存された正確な組織病理学的特徴と相関させる必要がある研究者に適しています。このワークフローは、新鮮に凍結されたサンプルが入手できないアーカイブまたは臨床注釈付きの固定組織を扱う際に特に価値があります。しかし、このプロトコルは、高完全性で非断片化RNA(例:RNA完全性番号(RIN)>8)を必要とする研究には理想的ではありません。なぜなら、化学的固定による断片化が全長転写産物に依存する応用に制限があるためです。

Protocol

動物の取り扱いおよびケアのすべての手続きは倫理ガイドラインに従って実施され、サザン医科大学の動物倫理委員会によって承認されました。本法は成体の 雄C57BL/6J マウスを用い、高脂肪・高糖・コリン欠乏の食事で代謝関連脂肪肝炎(MASH)をモデル化しました。肝臓組織を採取する前に、動物たちは首を切断して安楽死させられました。

1. PFA固定試料の調製

1. 新鮮な肝組織サンプル(個々の葉、厚さ5mm以下)を、4°Cで4°Cで冷たい4%PFA(新たに調製したばかり)30mLに24時間固定します。
   注:肝臓にはリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、1×、通常は137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4)溶液を1×濃度で5分間灌流し、その後4% PFAで5分間灌流することが推奨されます。あるいは、組織を10%ホルマリン溶液に固定することも可能です。
   注意:PFA固定剤は有毒です。すべてのPFA廃棄物は、機関および地域の規制に準拠し、適切にラベル付けされた化学廃棄物容器に回収されなければなりません。
2. 固定組織サンプルをRNaseフリーの1×PBS溶液で3×回、5分間洗浄します。
3. 固定された肝組織を、50mLのチューブに30%ショ糖(滅菌1×PBSで新たに調製したもの)を入れます。サンプルは4°Cで10〜12時間維持します。
4. 組織サンプルをショ糖溶液から取り出します。サンプルをトリムして取り扱いやすいブロック(約5mm×3mm×5mm)にし、OCTを含むクライオモルド(7mm×7mm×5mm)に埋め込みます。
   注意:必要に応じて鉗子で組織の向きを調整してください。
5. OCT化合物を上に塗って組織サンプルを完全に覆い、OCT埋め込み組織ブロックを液体窒素またはドライアイスの上に置いて素早く凍結し、固体ブロックを形成します。この急速凍結は高品質な冷凍切開を得るために不可欠です。
   注意:クライオジェニック素材を扱う際は、手を保護するために耐凍手袋を着用してください。
6. OCT埋め込みブロックを-80°Cの温度で冷凍切開するまで置きます。

2. レーザーキャプチャマイクロ解剖のためのクライオセクシング

1. ポリエチレンナフタレート(PEN)膜を30分間紫外線にさらし、その後0.1 mg/mLのポリL-リジンをコーティングし、その後自然乾燥させます。次に、PENメンブレンスライドの縁を中性の取り付け媒体で密封します。
   注:PEN膜スライドのUV照射およびポリL-リジン処理は、組織サンプルのPEN膜スライドへの接着を改善することができます。中性の取り付け媒体で周囲を密閉することで、水の浸透や膜下の気泡形成を防ぎ、LCMの効率維持に不可欠です。
   注意:肌と目を紫外線から守ってください。紫外線遮断の安全ゴーグルや(UV防護仕様のフェイスシールド)、白衣、ニトリル手袋、露出した肌を覆う長袖を着用してください。
2. クライオスタットとすべての工具の接触可能な表面をRNase除染剤で拭き取り、ブラシを75%エタノールで洗浄してください。
   注意:使用済みのエタノールワイプや溶液は、地域の環境衛生・安全プロトコルに従って処分してください。
3. 機器を−20°Cに到達させて安定させます。
4. 肝臓サンプルを-80°Cから採取し、最低15分間クライオスタットに入れます。
5. 試料ステージの表面に薄く(2〜3 mm)のOCT化合物を塗布します。試料ステージをクイックフリーズ棚(またはクライオスタットチャンバー)に置き、OCT層を事前に固めます。
6. 試料段階の事前固化したOCT層に少量のOCTを塗布します。平衡組織ブロック(ステップ2.4)を取り出し、すぐにこのOCTに水平に置き、部分的に凍結し癒着するために10〜15秒保持します。固定が完了したら、試料ステージ(組織ブロックを取り付けたもの)をクライオスタットの標本ヘッドに取り付けます。
7. クランププレートの片側からクランププレートと背面プレートの間にブレードを慎重に差し込み、クランプレバーをクランプします。
8. クライオスタットの厚さ設定を10μmに調整してください。
   注意:組織のスライス厚さは必要に応じて調整しますが、厚さは5〜15μm^の間に維持してください。
9. 切断して、-20°Cのクライオスタットチャンバー内の事前処理済みPEN膜スライドに直接取り付けます。
   注:1枚のPEN膜スライドは6〜8個の組織切片を収容可能です。区画作業は1時間以内に完了することが推奨されています。切片時間を制限することで、組織の周囲環境への曝露を最小限に抑え、RNA分解、組織脱水、形態的遺物のリスクを低減します。これらはLCMや下流解析におけるRNAの質と組織学的完全性の維持に不可欠です。

3. レーザー捕獲マイクロ解剖のためのヘマトキシリン染色

1. 使用前に室温(RT)で20分間解凍してください。
2. スライドをRNaseフリーの1×PBSで洗い(3回、各10秒)洗います。
3. 組織スライドをろ過したマイヤーヘマトキシリン溶液(1.0 g/Lヘマトキシリン、0.2 g/Lヨウ酸ナトリウム、50 g/L 硫酸アルミニウムアンモニウム・ドデカハイドレート、50 g/L クロラールハイドレート、1.0 g/L クエン酸から構成)に5〜10秒浸します。
   注意:染色前にヘマトキシリンの作業液を0.22μmのシリンジフィルター膜に通してください。
4. 残留ヘマトキシリン溶液を除去するために、RNaseフリーの水でスライドを3回(1回10秒)洗浄します。
5. 顕微鏡で染色の質を評価してください。
   注:最適に染色された核は、クリアな背景の中で鮮明な青紫色に見えるべきです。染色が不十分だと核が薄くなり、染色が過剰だと細胞の詳細が見えなくなります。これらの最適な染色基準を満たすスライドのみが次のステップに進むべきです。
6. スライドを吸水性のある紙で拭き取り、その後完全に自然乾燥させます(10〜15分)。
   注意:LCMを進める前にスライドが完全に乾いていることを確認してください。その後、スライドを50mL遠心分離機チューブに入れ、LCMが行われるまで一時的に氷の上に保管します。

4. レーザーキャプチャマイクロディセクティング

注意:各スライドのLCM実験時間は30分から1時間の範囲に保つべきです。LCM実験全体は4時間以内に完了することが推奨されています。この限界はRTでのRNA分解を最小限に抑え、チューブキャップ内の収集バッファーの蒸発を防ぐために設定されており、効率的なサンプル回収に不可欠です。実際には、形態的に定義された領域から約1,000個の細胞を目標に4時間以内に確実に収穫できます。

1. RNase除染剤で実験台の表面を拭き取ってください。
2. コントローラーをオンにして顕微鏡の初期化プロセスを完了させます。
3. キーを Off から On の位置に時計回りに回してレーザーシステムを起動します。
   注意:レーザーシステムはウォームアップに約10分かかります。
4. コンピュータの電源を入れ、LCMソフトウェアを開いて初期化プロセスが完了するのを待ちます。
5. 無菌の0.2 mL PCRチューブ(採取チューブ)を採取装置に挿入します。
6. PCRチューブのキャップに10μLのプロテナーゼK消化バッファー(材料 表参照)を加えます。
   注:プロテイナーゼK消化バッファーの総体積は、完全な溶解手順の一環として、次のステップ(ステップ5.4.1参照)で150μLにまで持ち上げられます。
7. 採取装置を顕微鏡の検体ホルダーに装填してください。
8. 「Change Collector Device」ウィンドウ内で、まず「Move to Reference Point」ボタンを選択します。次に、カメラのフォーカスを調整して基準点をクリアに見ることができます。必要に応じて、窓の矢印を使って視野の基準点を中央に設定します。
9. 組織切片を標本ホルダーに詰め込み、組織切片が裏向きでラベルが右側にあることを確認してください。
10. 10×の対物レンズを選択し、微小胞性脂肪症(多数の小さく透明な細胞質液胞と中心に核を持つ肝細胞が特徴)など、特定の病理的特徴を示す関心領域を特定し、輪郭を描き出します。次に レーザー メニューに移動し、「 キャリブレート 」ボタンをクリックします。画面上のメッセージを確認して「 はい 」を選択し、キャリブレーションを進めてください。
    注:10×対物レンズはマイクロディセクション専用ではありません。他の倍率レンズ(例:20×)は、試料の鮮明度や希望の解像度に基づいて選択可能です。
11. レーザー制御パネルで切断パラメータを次の通りに設定します:レーザー出力=50、絞り(レーザービーム直径)=5、速度=9。
    注:上記のパラメータ値は、本プロトコルで使用される組織サンプルを含むUV-LCMシステムの基準となります。他のUV-LCMシステムのユーザーはこれらを出発点として検討すべきであり、設定を経験的に調整する必要があるでしょう。最適な設定は組織タイプ、切片厚さ、その他のLCMシステムによって異なる場合があります。
12. グラフィックツールバーを使ってターゲットエリアの周りに円を描きます。 シングルシェイプを選択し、 LCMを開始 カットボタンで実行し、その後、採集装置を配置して解剖組織を採取します。
    注:成功した剥離は、選択した領域が分離することで示され、しばしば目に見える隙間や破片の動きが見られます。一貫性を保つために、サンプルごとに同規模の領域をあらかじめ定められた数から採取します。ターゲットエリアが自動的に切り離されない場合は、 移動と切断 ボタンをクリックしてマウスで手動で標本を切断してください。セル数のより正確な推定のために、LCMソフトウェアは切断面積の総面積を自動で記録できます。この値はターゲットセルの平均断面積で割ることで、捕獲されたセルの総数を近似できます。
    注意:LCMプロセス中はレーザービームを直接見て見つめないようにしてください。
13. オプションで、ファイルメニューの「画像を名前で保存」コマンドを選択して、解剖部位のビフォー・アフター画像を撮影することも可能です。ダイアログボックスで場所、ファイル名を選択し、希望するフォーマット(例:.tif)で保存します。
14. 希望のセル数を集めたら、「 アンロード 」ボタンをクリックしてコレクターをステージから取り除きます。PCRチューブを密封する前に、キャップ内のプロテナーゼK消化バッファー容積が10μLのままであることを確認してください。LCM中に蒸発が発生した場合はバッファーを補充します(ステップ4.6参照)。
    注:バッファーを10μL加えることでキャップ表面が完全に湿潤し、ステップ4.16の遠心分離時にマイクロ解離組織ペレットの効率的な移動が促進されます。
15. 収集管を徹底的に渦巻け。
16. 採集チューブを短時間回転させ、RNA抽出まで-80°Cで保管します。
    注意:次のサンプルではステップ4.5から4.16を繰り返してください。プロトコルはRNA抽出まで一時停止可能です。

5. 微量解剖サンプルの全RNA抽出

1. RNase除染剤で実験台の表面を拭き取ってください。
2. LCMサンプルを-80°Cの冷凍庫から氷浴に移します。必要に応じて、同じサンプルの異なるバッチをプールすることもできます。
3. マイクロ解剖したサンプルチューブを逆さまにして42°Cで30分間培養します。
   注意:この逆行により、短時間の遠心分離(ステップ4.16)後にキャップに付着した組織が消化バッファーに放出されます。これにより、ステップ5.4.1の体積調整および高速遠心分離前にバッファーへの最大限のサンプル輸送が保証されます。
4. 固定組織に最適化された標準RNA抽出キットを用いて、LCMサンプルから全RNAを分離します(材料 表参照)。
   1. 各サンプルチューブ内の体積を、プロテナーゼK消化バッファーを使って最終150μLに調整します(材料 表参照)。チューブを11,000 × g (1分)で回し、その後無菌の1.5 mLチューブに移します。
   2. 1本あたり10μLのプロテナーゼK(20 mg/mL)を加え、繰り返しピペッティングしてサンプルを優しく混ぜます。これにより、最終体積は160μLとなり、最終的なプロテイナーゼK濃度はサンプルあたり約1.25 mg/mLとなります。
   3. 2段階のサンプル培養を行います。まず56°Cで15分間、次に80°Cで15分間培養します。 各孵化中は、5分ごとに短くチューブを一時的にボルテクスさせます。
      注意:最適な作業効率を得るために、予熱された水浴を2つ使用してください。単一浴を使用する場合、56°Cの孵化後に一時停止し、浴槽が80°Cまで加熱される間、サンプルをRTで保持し、その後進行します。
   4. サンプルを氷に3分間置き、その後20,000 × g (15分)で遠心分離します。
   5. 浄化された上澄液を新しい1.5 mLチューブに吸引し、ペレットは避けます。
   6. 各サンプルに16 μLのDNaseインキュベーションバッファーと10 μLのDNase I酵素(2.73単位/μL、 材料表参照)を加えます。その後、チューブを優しく逆さまにして内容物をよく混ぜます。これにより、最終体積は186μL、消化反応中の最終DNase I濃度はサンプルあたり約0.15単位/μLとなります。
   7. チューブの壁から残留液体を集めるために素早く回転させてください。
   8. サンプルチューブをRTで15分間孵化します。
   9. 各試料に320μLの高塩洗浄バッファー(材料 表参照)を移し、試料を十分に混合します。これにより、最終的なサンプルあたり506μLの体積が得られます。
   10. 各チューブに720μLの絶対エタノールを移し、ピペッティング(遠心分離なし)で試料を混合し、すぐに作業を進めます。これにより、最終的なサンプルあたり1,226μLの体積が得られます。
       注意:絶対エタノールは非常に可燃性が高いです。適切な処分のために、指定された非ハロゲン有機溶剤廃棄物容器に廃棄物のエタノールを回収してください。
   11. 700μLのサンプル混合物を精製カラム(2 mLの収集管に置かれ、 材料表を参照)に移します。蓋を優しく閉じ、8,000 × g (15秒)で遠心分離機をかけます。
   12. 収集チューブの流れを捨てる。浄化カラムを保持してください。
   13. ステップ5.4.11から5.4.12まで繰り返します。
   14. 各サンプルチューブに500μLのエタノール系洗浄バッファー(材料 表参照)を加えます。蓋を優しく閉じ、8,000 × g (15秒)で遠心分離機をかけます。その後、収集チューブの流れを捨てます。
   15. ステップ5.4.14を全文で繰り返し、唯一の修正は遠心分離時間を8,000 × gで2分に延長することです。
   16. 各精製カラムを新しい2.0 mLチューブに移します。キャップを開けた状態で14,000 × g (5分)で遠心分離し、その後チューブと残留液体を捨てます。
   17. 各精製カラムを新しい1.5 mLチューブに移します。RNaseフリー水16μLを膜にピペットで注ぎ、キャップを閉じて14,000 × g (5分)で遠心分離して全RNAの溶出を促進します。
       注意:分解を防ぐため、ステップ5.5および5.6の間はすべての脱出RNAサンプルを氷上保存してください。
5. RNAサンプルを定量し、純度(A₂₆₀/_{A 280} の比率)を分光光度法で確認します。
   注:このステップでの濃度と純度(A₂₆₀/_{A 280} 比)の測定、そしてステップ5.6の完全性評価は、RNA回収の成功を決定的な定量チェックポイントとして機能します。透明なRNAの洗脱液が期待されます。
6. 1%のゲル濃度でアガロースゲル電気泳動を行い、バイオアナライザーシステムを用いてRNA完全数(RIN)を決定してRNAの品質を評価します。
7. RNAサンプルはqRT-PCRまたはRNA-Seqを行うまで-80°Cで保存します。

6. RNA解析

注:qRT-PCRはステップ6.1および6.2で記述され、RNA-Seqはステップ6.3で記述されています。

1. 逆転写反応混合物を準備し、氷の上で1回の反応ごとに総RNAを50ng加えます。提供された指示に従ってサーマルサイクラーを用いて逆転写反応を進めてください(材料 表を参照)。
2. 氷上では、製造元の指示に従って βアクチン 用の定量PCRマスターミックスを準備します(プライマー配列は材料 表 を参照)。製造者が推奨するサイクルプロトコルを用いて定量PCRシステム上でリアルタイムPCR増幅を行い、反応ごとに10 ngのcDNAを投与します。
3. 低入力の鎖状キット(材料 表参照)を用いて、総RNA50 ngからRNA-Seqライブラリを構築します。バイオアナライザーシステムでライブラリーのサイズと濃度を決定し(材料 表参照)、その後高スループットプラットフォーム上でペアエンドシーケンスを行います(材料 表参照)。

Results

実験ワークフローには、PFA固定、30%ショ糖脱水、OCT埋め込みおよび冷凍切開、ヘマトキシリン染色、LCMによる標的領域(~1,000細胞)の同定と精密収集、細胞溶解、RNA分離、RNA品質管理指標、そして2つの主要な分析応用 が含まれます。PENスライドのヘマトキシリン染色された肝臓断片は、顕微鏡下で(図2A)および(図2B)のマイクロスケール肝組織のレーザー捕捉の前後に示されています。微小胞性脂肪症を示す関心領域はPCRチューブのキャップに正確に収集され、細胞形態を完全な状態に保ちました(図2C)。

1回の複製ごとに約1,000および2,000個のLCM捕獲細胞から総RNAが抽出され、それぞれ110.7 ng±11.8 ngおよび213.3 ± 26.2 ngを得ました(<...

Discussion

LCMの強みは、選択された細胞や組織領域を正確に現地捕捉し、異質な組織内の特定の領域の研究を容易にすることにあります。しかし、サンプル収率の低さ、時間のかかる工程、高コスト、そして専門機器の必要性により、この技術の実験室での広範な応用は^{制限されています。}本研究では、LCM-RNAプロトコルが歴史的な主要な制約を克服するために確立されました。このプロトコルは、ヘマトキシリン染色の迅速ステップ(~10秒)を実装し、FFPEの代わりにPFA/OCT埋め込みを用いることで、多くの固定組織プロトコルで必要とされる時間のかかるキシレン脱硫化手順を排除しました。単一チューブ採取戦略は中間移送を避け、試料損失やピペッティング作業を削減します。膜の周囲をマウントメディウムで密封することで、一般的な水分問題を防ぎ、初回成功率と^{切断効率を}上げます。PFA適応RNA抽出キットの使用により、架橋RNAの効率的な回収が保証されました。超高感度ライブラリー調製キットと組み合わせることで、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<ストロング>マテリアル<ストロング>
0.2 ml 薄壁チューブ	アクシゲン	PCR-02-C	LCM収集用の管
1.5 mL遠心分離機チューブ	アクシゲン	339653
4% パラホルムアルデヒド	レーゲン	DF0135
50 mL遠心分離機チューブ	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	339653
DEPC(ジエチルピロカーボネート)	シグマ	D-5758
DNase I 消化セット	キアゲン	73504	RNeasy FFPEキットのコンポーネントには、DNase Iストック溶液とDNaseブースターバッファーが含まれています
エタノール(100%)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	BP2818	分子生物学用に精製
エタノール系洗浄バッファー	キアゲン	73504	バッファRPE(RNeasy FFPEキットのコンポーネント)
高塩水洗浄バッファー	キアゲン	73504	バッファRBC(RNeasy FFPEキットのコンポーネント)
ロープロファイルミクロトームブレード	ライカ・バイオシステムズ	819
マイヤー」Sヘマトキシリン	レーゲン	DH0001
OCTコンパウンド	さくら	4583
PEN膜コーティングスライド	ライカ	11505188
リン酸塩緩衝塩水	レーゲン	CC0010	DNase/RNaseフリー
ポリLリジン	マックリン	P875131S
プロテナゼK消化バッファー	キアゲン	73504	バッファーPKD(RNeasy FFPEキットのコンポーネント)
精製柱	キアゲン	73504	RNeasy MinEluteスピンカラム(RNeasy FFPEキットの部品)
定量PCRマスターミックス	タカラバイオ	RR820A	TB グリーンプレミックス Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)
逆転記キット	キアゲン	205411	QuantiNova 逆転写キット
RNA抽出キット	キアゲン	73504	RNeasy FFPEキット
RNAシーケンシングキット(低入力、鎖状)	タカラバイオ	634412	SMARTerストランドトータルRNA-seqキット - ピコ入力哺乳類V2
RNase除染剤	ソーラービオ	SR0040	清掃
ショ糖	マックリン	S818049
<ストロング・アンド・アニマルズ>ダイエット
マウス:C57BL/6J	広東省実験動物センター	03
<ストロング>特別な食事と飲み水<強い>
高脂肪・コリン欠乏食(ベースダイエット)	トロフィック動物飼料ハイテク株式会社	TP36310M	マクロ栄養素:タンパク質、14kcal%;炭水化物:26 kcal%;脂肪、60 kcal)
砂糖補助飲料水	マックリン	該当なし(社内準備)	D-グルコース(Macklin, Cat# F87500)とD-フルクトース(Macklin, Cat# S818049)の混合物が、最終濃度42 g/Lでオートクレーブされた飲料水に加えられ、グルコース対果糖の比率は55:45(w/w)でした
マウスプライマー
β-actin(前書き:AGAGGGAAATCGTGGTGGTGAC)	BGIシーケンシング	カスタム	HPLC精製
β-actin (逆:CAATAGTGATGACCTGGCCGT)	BGIシーケンシング	カスタム	HPLC精製
<ストロング>装備
クライオスタットマイクロトーム	ライカ・バイオシステムズ	CM3050 S
バイオアナライザーシステム	アジレント	G2939BA
ハイスループットシーケンシングプラットフォーム	イルミナ;Inc.	NovaSeq 6000システム
レーザーキャプチャマイクロディセクレーションシステム	ライカ・マイクロシステムズ	ライカLMD6500
定量PCRシステム	応用バイオシステム	QuantStudio 5 リアルタイムPCRシステム
分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	NP80	ナノドロップ
サーマルサイクラー	バイオラッド	T100
Software
Adobe Illustrator CC 2019(バージョン 23.0.2)	アドビ	https://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad プリズム(バージョン 8.3.0)	GraphPadソフトウェア	https://www.graphpad.com