方法論記事

ヒルシュスプルング病患者の神経節および神経節性結腸セグメントのプロファイリングのための単細胞RNAシーケンス

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DOI：

10.3791/69825

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2026年5月22日

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1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ヒルシュシュプルング病における神経節性および無神経節性結腸切片間の免疫細胞浸潤および細胞型特異的転写差異を解析するための単細胞RNAシーケンシングワークフローを記述しています。

要約

ヒルシュスプルング病(HSCR)は、腸遠端に腸ニューロンが欠如することを特徴とする先天性腸の運動障害です。バルクRNAシーケンシングと比較して、単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は単一細胞レベルでの遺伝子発現プロファイリングを可能にし、集団平均解析で隠されがちな細胞異質性を解消します。HSCR患者の神経節および神経節断片の転写状況を特徴付けるための標準化されたscRNA-seqワークフローが確立されました。大腸組織を採取し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を行って神経節および神経節領域を特定しました。組織は酵素的および機械的に解離され、単細胞懸濁液にされ、その後ろ過、生存可能性評価、単細胞トランスクリプトームライブラリームの構築が行われました。品質管理を通過したライブラリはシーケンスされ、生データはセルの定量化と品質フィルタリングのために処理され、低品質のセルや技術的アーティファクトを除去しました。正規化と次元削減の後、細胞は確立されたマーカー遺伝子に基づいてクラスタリングされ注釈付けされました。下流解析では、神経節組織と神経節組織の細胞型組成を比較し、主要な免疫細胞サブセット内で異なる発現遺伝子を特定しました。結果は、HSCRにおける神経節断片と神経節節間における免疫微小環境に大きな違いがあることを明らかにしています。

概要

ヒルシュスプルング病(HSCR)は、世界中で約5,000人の出生に1人の割合で発生する、最も一般的な先天性腸運動障害の一つです。この疾患は、胚発生週5〜12週の間に腸内神経稜細胞(ENCC)が遠位腸に移動しなかったことに起因し、その結果、影響を受けた区画に腸神経節が欠如します2。そのため、神経節は持続的な痙攣性収縮と蠕動運動障害を示し、近位腸の拡張を引き起こします。臨床的には、これは機能閉塞として現れ、便秘、腹部膨張、嘔吐を引き起こし、重症の場合は生命を脅かすことがあります。神経節節の外科的切除はHSCRの主要な治療法であり、しかし、多くの患者は便秘、腸炎、便便の排出など術後の合併症を経験し、生活の質を著しく低下させます。さらに、広範な腸切除後に短腸症候群(SBS)が発生することがあり、栄養吸収の障害や臨床管理の課題が増加します。したがって、HSCRの基礎的なメカニズムの解明と新規治療標的の特定は依然として重要な臨床的課題です。

近年、単一細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)は疾患に関連する分子メカニズムの調査に広く応用されています。従来のバルクRNAシーケンシングとは異なり、scRNA-seqは単一細胞分解能での遺伝子発現解析を可能にし、バルク解析で隠されている細胞異質性や希少なサブポピュレーションの同定を可能にします。その結果、scRNA-seqは細胞の異質性と細胞間コミュニケーションを解析する強力なツールとして浮上し、生物学および医学の研究を前進させました。このアプローチにより、アルツハイマー病6、関節リウマチ7、肺がん8、2型糖尿病9など複雑な疾患における新規病原性メカニズムと治療標的が明らかになりました。

本研究では、scRNA-seqを用いてHSCR患者の神経節および神経節結腸組織における免疫細胞転写の風景と浸潤パターンを特徴づけました。ワークフローは主に3つのステップで構成されていました:単一細胞懸濁液の準備と品質評価、3′単一細胞RNAシークライブラリの構築、そして下流のバイオインフォマティクス解析です。切除直後に組織サンプルは専用の単細胞保存液に保存され、48時間以内に酵素解離されて単細胞懸濁液に分解されました。細胞生存率は80%を超え、最終細胞濃度はライブラリー調製前に700〜1,500細胞/μLに調整されました。神経節と神経節間での免疫細胞浸潤を比較し、顕著な転写差異を示す免疫細胞サブグループを特定しました。これらの解析は、HSCRにおける大腸病理に関連する免疫細胞変異を明らかにします。

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プロトコル

本研究は、尊義医科大学付属病院の倫理委員会(承認番号:KYLL-2024-030)によって承認されました。この研究はヘルシンキ宣言に準拠しています。すべての参加者およびその保護者から口頭および書面によるインフォームド・コンセントが取得されました。 表1は HSCR患者の情報を示しています。

準義医科大学付属病院付属小児外科で診断され手術を受けたHSCR患者から、神経節および神経節断片を含む大腸組織を採取します。2名の男性HSCR患者から神経節および神経節断片を含みます。詳細な臨床情報は 表1に記載されています。すべての試薬、化学物質、機器、ソフトウェアは 材料表に記載されています。

1. ヘマトキシリンとエオシンの染色

  1. 組織採取と固定
    1. 腸内組織サンプルを4%パラホルムアルデヒド固定液に少なくとも24時間固定してください。
      注意: パラホルムアルデヒドは有毒で、ホルムアルデヒド蒸気を放出します。すべての手順は化学換気フード内で行い、適切な個人用防護具を使用してください。
    2. メスで組織を約5 × 5 × 2 mm3 までトリミングします。ティッシュを埋め込みカセットに入れ、流れる水道水で24時間洗い流します。
      注: 組織の端を取り除き、少なくとも1面は平らなブロックを準備します。もし均一でなければ、すすぎ後にフィルターペーパーの間にティッシュを挟んでください。
  2. 段階的エタノール脱水
    1. 組織をエタノール溶液に順次浸します:70%エタノールを一晩、80%エタノールを3時間、90%エタノールを2時間、95%エタノールIを2時間、95%エタノールIIを1時間、100%エタノールIを1時間、100%エタノールIIを30分浸します。
      注: エタノール(≥99.7%)を超純水で希釈して所定濃度まで調整します。
      注意: 化学煙幕でエタノールを取り扱いを行います。
    2. 脱水バスケットを取り外し、工程の合間にしっかりと水を切ります。
  3. クリアリング
    1. 透明化を得るために組織をキシレンに移すと30秒間投与されます。
  4. パラフィン浸透と埋め込み
    1. パラフィンワックスは1日前に60°Cで溶かしてください。新しいワックスを3回の凍結・解凍サイクルでかけて気泡を取り除きます。3回目のサイクル後に溶けたパラフィンをろ過します。
    2. 組織に純粋なパラフィンワックス(パラフィンワックスI)を浸潤させて1時間浸透させます。
    3. パラフィン混合物(パラフィンワックスII;純粋なパラフィンワックス:蜜蝋=8:1)に2時間浸透させます。
      注: 使用前に蜜蝋とフィルターを完全に溶かしてください。
    4. パラフィンワックスIIを埋め込み型に注ぎます。組織ブロックを立てて平らに置き、ラベルを挿入して固化させます。
  5. 区画
    1. パラフィンブロックをトリミングして、組織を切り開かずに滑らかな表面に仕上げましょう。
    2. ブロックをマイクロトームにマウントします。向きを調整し、余分なパラフィンを取り除きます。4μm厚の連続断片を切断します。50°Cの水浴で断片を浮かべ、ガラススライドに移します。
    3. 60°Cのオーブンで乾燥させて、残留水分を取り除きます。
      注: 乾燥区間は12〜48時間。
  6. 脱パラフィン化
    1. 順次培養を行います:キシレンI(15分)、キシレンII(15分)、100%エタノールI(5分)、100%エタノールII(5分)、90%エタノール(5分)、80%エタノール(5分)、70%エタノール(5分)、蒸留水(5分)。
  7. ヘマトキシリン染色
    1. ヘマトキシリンで50秒間断片を染色します。
    2. 流れる水道水の下で10分間すすいでください。
  8. エオシン染色
    1. エオシンで40秒染めます。
  9. 脱水
    1. 切片を95%エタノールI(30秒)、95%エタノールII(30秒)、100%エタノールI(30秒)、100%エタノールII(30秒)に順次浸漬します。
  10. クリアリング
    1. セクションをキシレンIに10分、キシレンIIに10分移します。
  11. 架設と観察
    1. マウントメディウムを加えてください。ガラスのカバースリップで覆い、気泡を取り除きます。
    2. 取り付け媒体が固まるのを待ちます。光学顕微鏡で切片を調べてください。

2. 単細胞RNAシーケンシング

  1. 単一セル懸濁液の調製
    1. はさみを使って腸組織を~1 mm 3 の断片に細かく刻みます。
    2. 1 mg/mLのコラーゲン酵素IIと0.1 mg/mLのDNase Iを含む組織断片を、37°Cの揺れるプラットフォーム(60 rpm)で30分間、穏やかに攪拌しながら30分間培養します。
    3. 消化を終えるために、胎児用牛血清(FBS)を含む同量の冷DMEMを追加します。
    4. 懸濁液を70μmのセルストレーナーでろ過します。遠心分離機で300 × g、4°Cで5分間。
    5. 上清液を捨て、細胞ペレットを残します。0.04%の牛血清アルブミン(BSA)を含むリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で一度洗浄します。
    6. 優しいピペッティングで細胞塊を解離し、単一細胞懸濁液を得る。
    7. 懸濁液を40μmのセルストレーナーでろ過します。
    8. 遠心分離機で300 × g、4°Cで5分間加熱します。 上澄液を捨ててペレットを集めます。
    9. DMEM中に10%のFBSおよび1%のペニシリン–ストレプトマイシン(P/S)を含む細胞を再懸浮させます。
    10. トリパンブルー排除法を用いて細胞の生存率と密度を測定します。生存率>80%のサンプルを使用し、濃度を700〜1,500 cell/μLに調整します。
      注: 細胞懸濁液とトリパンブルー(1:1)を混ぜ、ヘモサイトメーターで生存可能な細胞を数えます。
  2. 図書館の準備
    1. ライブラリ準備のために1回のランで約15,000セルをロードします。
      注: ゲルビーズ・イン・エマルジョン(GEM)マイクロドロップレットでは、mRNAがゲルビーズ上のポリ(dT)オリゴヌクレオチドにハイブリダイズします。
    2. PCRを用いて逆転写とcDNA増幅を行います(95°Cで10分、95°Cで40サイクル15秒、60°Cで35秒、72°Cで25秒、最終延長は72°Cで25秒)。3′ scRNA-seq ライブラリ構築には増幅cDNAを使用します。
      注: cDNA合成時にCCCオーバーハングが追加され、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド(TSO)配列と対になります。
    3. 乳剤を破壊し、GEMからcDNAを回収します。
  3. ライブラリの品質管理とシーケンス
    1. 遺伝子発現を定量化し、断片サイズの分布を評価します。
    2. 蛍光qPCR装置を用いて正確な定量を行います。
      注: 図書館の濃度≥10 nMを確保してください。
    3. シーケンス機器を用いたシーケンスライブラリ。
      注: リード構造:リード1(26ベーシスベーター)、リード2(91ベーシスポイント)、i7インデックス(8ベーシスポイント);ターゲット深度~50,000本のリード。
  4. データ品質管理
    1. 生の読み取り値を参考データベースに整合させます。UMIカウントを行い、細胞ごとの遺伝子マトリックスを作成します。
    2. 下流解析のためにAnnData(注釈付きデータ)形式で結果をインポートしてください。
    3. UMI、遺伝子カウント、ミトコンドリアリードに基づくQCフィルタリングを行います。
      注: ダブレット(スクラブレット)を除去する;<200または>5,000遺伝子を持つ細胞、total_counts >40,000、すなわちmt_ratio >20%の遺伝子を持つ細胞は除外します。
  5. 次元削減と注釈
    1. 正規化固有分子識別子(UMI)は細胞ごとに10,000個までカウントされます。
    2. 非常に変異性の高い遺伝子を特定しましょう。
    3. 主成分分析(PCA)を実施してください。
    4. k-最近傍グラフを構築します。
    5. UMAP埋め込みを実行してください。
    6. Scanpy(v1.9.3)のライデンアルゴリズムを用いたクラスタセル。
      注: sc.pp.neighborsとsc.tl.leiden(解像度=0.5)を使いましょう。
    7. 単一細胞RNAシーケンス(scRNA-seq)データにおける細胞型の自動かつ高精度な注釈用に設計されたツールを使用して、細胞型を注釈付けします。
  6. 微分解析
    1. Seurat(v4.3.0)を用いてR(v4.2.2)で差別遺伝子発現解析を行います。
      注: FindMarkers関数とウィルコクソンのランク-総和検定を組み合わせて使用してください。
    2. enrichGOを用いてclusterProfiler(v4.8.1)を用いてGO濃縮解析を行います。
      注: CC、MF、BPの各カテゴリーを含みます。
    3. enrichKEGG10を用いてclusterProfiler(v4.8.1)を用いてKEGG経路濃縮解析を行います。

3. 廃棄物処理

  1. パラホルマルデヒドおよびキシレンを含む廃棄物は別々に収集してください。
  2. 適宜は酸性溶液を中和するか、有害廃棄物として処分してください。
  3. 機関の環境衛生・安全(EHS)規制を遵守してください。

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結果

ヘマトキシリンおよびエオシン(HE)染色(図1)により、神経節節と神経節節の間に明確な組織学的差異が明らかになりました。神経節節と比較すると、無神経節節は粘膜剥離が増加し、ゴブレット細胞および粘膜下ニューロンの著しい減少、粘膜層と筋層の境界が曖昧になっていました。一部の切片では、組織保存が最適とは言えず、部分的な上皮剥離や組織構造の乱れが見られ、これらの領域での組織学的評価が制限されていました。

品質管理(QC)のろ過後、各グループにつき6,000個以上のセルが下流解析のために保持されました(表2; 図2)。次元削減とクラスタリングには一様多様体近似射影(UMAP)が適用されました。標準マーカー遺伝子発現に基づき、細胞は24の転写的に異なるクラスターに分類されました(図3)。

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ディスカッション

単細胞RNAシーケンシングを用いて、ヒルシュスプルング病患者の外科的に切除された大腸組織(神経節および神経節断片)の転写特徴をプロファイリングしました 4,5。特に組織解離戦略に注目し、解離パラメータが細胞回復、細胞型表現、RNAの完全性に影響を与えるためです。酵素的消化条件は、十分な組織解離と細胞の生存能力およびトランスクリプトム品質の維持のバランスを取るために最適化されました。高密度な細胞外マトリックスと複雑な腸組織構造を考慮し、中程度の酵素強度と制御された潜伏時間が用いられ、細胞損傷、ストレス誘発性転写アーティファクト、RNA分解を最小限に抑えました。

解離効率は細胞の種類によって異なり、特に免疫細胞は酵素的消化や機械的解離の際に失われやすい場合があります。したがって、scRNA-seqデータで観察される細胞型存在比の違い、特に神経節における免疫細胞の表現減少は、生物学的差異と手続き関連バイア...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は貴州科学技術プロジェクト(貴州科学技術協力基金 - ZK - [2024] General 344)(楊元輝)および尊義科学技術プロジェクト契約(科学技術協力)(尊義科学技術協力HZ(2023)番号)の支援を受けました。(Y. Quへ)

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ミツ蝋シノファーム化学試薬株式会社8012-89-3 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
ミツ蝋シノファーム化学試薬株式会社8012-89-3 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8012-89-3
牛血清アルブミンサーモフィッシャー30066575 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/30066575?SID=srch-srp-30066575
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セルタイピスト該当なしNAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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クラスタプロファイラーパッケージバイオコンダクターv4.8.1https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.html
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コラーゲンIIサーモフィッシャー17101015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015?SID=srch-srp-17101015
コラーゲンIIサーモフィッシャー17101015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015?SID=srch-srp-17101015
カバーガラスCITOTEST80340-0130 https://cn.citotest.com/pd40971476.html
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使い捨てミクストームブレードフェザーS-35 https://www.feather.co.jp/en/m_Products/pathology01.html
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DNase Iサーモフィッシャー18047019 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019?SID=srch-srp-18047019
DNase Iサーモフィッシャー18047019 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/18047019?SID=srch-srp-18047019
乾燥オーブンボルクDHG-9140A http://www.shboruike.com/sys-pd/84.html
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ダルベッコ改良型イーグル中型サーモフィッシャー12491015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/12491015
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エチルアルコールシノファーム化学試薬株式会社10009218 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10009218
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胎児用牛血清サーモフィッシャーA5669801https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/A5669801
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ヘマトキシリンとエオシン染色キットビヨタイムC0105S https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&コード=C0105S
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塩酸シノファーム化学試薬株式会社10011028 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
塩酸シノファーム化学試薬株式会社10011028 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10011028
顕微鏡スライドCITOTEST80302-3111 https://cn.citotest.com/pd530614548.html
顕微鏡スライドCITOTEST80302-3111 https://cn.citotest.com/pd530614548.html
取り付け媒体ビヨタイムC0173-100ml https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&コード=C0173-100ml
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光学顕微鏡ニコンエクリプスSI https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
光学顕微鏡ニコンエクリプスSI https://www.microscope.healthcare.nikon.com/ja_JP/products/upright-microscopes/eclipse-si
パラフィンワックス シノファーム化学試薬株式会社8002-74-2 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
パラフィンワックス シノファーム化学試薬株式会社8002-74-2 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/8002-74-2
パラホルマルデヒドフィックス溶液ビヨタイムP0099-3L https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&コード=P0099-3L
パラホルマルデヒドフィックス溶液ビヨタイムP0099-3L https://m.beyotime.com/mobilegoods.do?method=code&コード=P0099-3L
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシンサーモフィッシャー15140122 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122
ペニシリン&ナッシュ;ストレプトマイシンサーモフィッシャー15140122 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/15140122?SID=srch-srp-15140122
リン酸塩緩衝塩水サーモフィッシャー10010023 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
リン酸塩緩衝塩水サーモフィッシャー10010023 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/10010023
定性フィルターペーパーソーラービオYA0166https://www.solarbio.com
定性フィルターペーパーソーラービオYA0166https://www.solarbio.com
RソフトウェアパッケージR統計計算財団v4.2.2https://www.r-project.org/
RソフトウェアパッケージR統計計算財団v4.2.2https://www.r-project.org/
ロータリーミクロトームライカライカ RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
ロータリーミクロトームライカライカ RM2125 RTShttps://www.leicabiosystems.com/en-jp/histology-equipment/microtomes/histocore-biocut/
スキャンピーコミュニティ開発v1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
スキャンピーコミュニティ開発v1.9.3https://scanpy.readthedocs.io/en/latest/?utm_source=chatgpt.com
スーラクランv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
スーラクランv4.3.0https://cran.r-project.org/web/packages/Seurat/index.html
組織脱水機武漢軍傑電子有限公司JT-12H http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
組織脱水機武漢軍傑電子有限公司JT-12H http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46166.html
組織埋め込み装置武漢軍傑電子有限公司JB-L8 http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
組織埋め込み装置武漢軍傑電子有限公司JB-L8 http://www.whjjbl.com/front/page/126495/product_id/46064.html
トリパンブルー ソーラービオC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
トリパンブルー ソーラービオC0040https://www.solarbio.com/haveRegion?id=48&all=0&key=%20Trypan%20Blue
キシレンシノファーム化学試薬株式会社10023418 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418
キシレンシノファーム化学試薬株式会社10023418 https://www.reagent.com.cn/ProductSearch/10023418

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