デジタル顕微鏡を用いた綿の葉および苞片蜜の可視化によるスコアリング精度とデータ保存の向上

Summary

ここでは、デジタル顕微鏡で生成された画像を用いて、綿花植物の葉や苞片の蜜腺の表現型化の段階的なプロセスを解説します。これは綿の葉と苞葉の両方の蜜腺を採点する効果的な方法であり、情報をデジタル画像の形で収集・保存することができます。

Abstract

蜜腺は多くの植物種に見られる、独自の蜜を産生する側です。蜜腺は多様な構造と機能を示します。綿では、伝統的な蜜腺形質のスコアリングは誤りが多く信頼性に欠け、この形質の表現型は肉眼ではしばしば見えないため制限があります。蜜腺形質の発現は 、Ne1 および/またはNe2という遺伝子によって制御 されます。 さらに、形質の発現は環境や成長段階によって影響を受けるため、正確なスコアリング方法の必要性が強調されます。特に、デジタル画像による表現型スコアリングは、蜜腺のスコアリング方法をより正確に行うことにつながります。この方法は従来のスコアリングの制約を克服し、高解像度の画像を生成する。さらに、これらのデジタル画像を将来の参照のために保存しつつ、蜜腺形質の微細な差異の識別と区別を容易にします。ここで説明するこの表現型スコアリング法は、腺体、毛、色など他の植物形質のスコアリングにも容易に応用できます。これらのスコアリング方法は他の植物種に合わせて調整可能です。この記事では、フィールドや温室からサンプルを採取し、デジタル顕微鏡で解剖して観察し、将来のスコア分析のために保存する方法を段階的に説明します。この方法では、例えば綿花の葉と子嚢のサンプルをスコアリングして、蜜腺(完全に発育した、縮小した、退化したもの)の有無と蜜腺の有無を区別します。

Introduction

植物には蜜腺と呼ばれる特殊な腺があり、ほとんどの被子植物、一部のシダ、一部の裸子植物では蜜を合成し生成します(1,2,3,4)。蜜腺は、蜜5を産生する細胞の起源に基づき、メソフィラリー型、トリコマティック型、上皮型の3種類に分類^{されます。}綿花中の蜜は、乳頭と呼ばれる乳頭状腺毛からなる修飾気孔であり、毛状タイプ^5,6に分類されます。ゴッシピウム属のほとんどの種は蜜腺を持ち、しかし、この属に存在する蜜腺の数は種ごとに^{異なります。}植物では花蜜(FN)は花外蜜腺(EFN)よりも一般的^です。これらの蜜腺は根^1,2を除く植物のどこにでも現れます。例えば、Gossypium hirsutumは花外の蜜腺^{の両方を示します。}国内綿花の植物は3つの花の多いものと1つの花の蜜腺を持つ¹⁰。3つの花外蜜腺は葉面、苞片、外側の3つの蜜腺^です。葉面の蜜腺は栄養性で、通常は中肋の下側の葉に存在しますが、苞片および周囲の蜜腺は生殖性で、苞片と腹側の花萼の基部に発達します。花蜜は花と関連しており、花は萼の上側(アダクシャル)に発達します。この蜜腺形質は単一の遺伝子座¹²によって制御されています。2つの独立した研究グループによる研究では、この菌形質は1つの遺伝子、すなわちAゲノムのNe1またはDゲノムのNe2によって制御されており、それぞれ染色体^12番と26番にマッピング^{されていることが明らか}になりました。この形質は二重劣性状態でのみ発現し、ホモ接合劣性状態のみが無蜜性形質を発します。

これらの遺伝子に加え、環境条件や成長段階も発現度合いの制御に関与しています。したがって、この特性を正確に評価する方法が必要です。本研究は綿花中の葉と苞片の表現型解析に焦点を当てています。蜜を分泌する蜜腺が目に見える植物は蜜持ちと評価され、この特徴を持たない植物は^{蜜なし1,2,3,4}と評価されます。本記事の主な目的は、デジタル顕微鏡技術を用いて蜜腺形質の正確なスコアリング方法を提示することです。従来の直接目視によるスコアリングでは、肉眼では蜜腺形質の発現変異の違いを簡単に検出できません。これらの蜜腺形質の微妙な違いはデジタル顕微鏡で可視化できます。例として、綿葉の蜜腺では、スコアリングルーブリックは標準的なスケール1から4に従います。1は蜜嚢なし、2は静脈表現型の突起、3は蜜のない未発達のパッドや隆起、4は透明なパッドと隆起を持つ完全な蜜腺¹³を表します。この表現型スコアリングは、葉の蜜腺のデジタル画像(葉の中脈の下側のデジタル画像を用いて)を用いて作成されました。一般的に蜜腺の欠如は0と評価されますが、統計的有意性のために値は0を使わず、値1に置き換えることはできません。そのため、表現型のスコア範囲は標準化された分類の0-4¹³から1-4に修正されました。花のスコアリングルーブリックは1から4の類似したスコアリングパターンに従います。1は蜜腺がなく、目立つ腺がなくパッドや隆起がない状態、2は蜜腺がわずかなパッド模様で蜜がない混濁腺、3は薄いまたは欠如する隆起やパッドが欠如する不完全な腺、4は蜜腺が完全に形成されたものを表します。このスコアリングパターンは、蜜腺付き表現型(遺伝子のうち1つがホモ接合/ヘテロ接合優性)で4、蜜腺形質の差異発現で3、2、蜜腺なし(両遺伝子ともホモ接合劣性)で1、

同様に、花は本記事で説明する通り、段階的に採集・解剖され、胸片の蜜をスコアリングするためのデジタル画像を収集します。この表現型は顕微鏡で可視化され、正確なスコアリングを行い、デジタル画像の形で保存できます。綿花では、蜜の特性は花粉媒介者を引き寄せるだけでなく、収量を減らす害虫も引き寄せます¹⁴.この問題を解決するため、育種家は化学農薬を使わずに害虫を自然に駆除するために、蜜具を持たない(無蜜)形質の植物を選びました^9,15.無蜜性状は元々 Gossypium tomentosum から Gossypium hirsutum (栽培された高地綿花)⁸.このスコアリング方法は、蜜を持つ親と蜜を持たない親を交配して生成される個体群における無蜜形質の分離を特定するのに特に有用です。多様な親の交配の結果として、F₂ (第二親子世代)はホモ接合蜜具、異質接合蜜腺、ホモ接合蜜なしの異なる遺伝子型を示します。蜜腺形質の発現には1つの優性遺伝子のみが必要で、分離比は15:1(9:3:3:1)に従います。したがって、16匹に1匹がホモ接合劣性状態で無蜜性形質を発現し、遺伝子型は一致します ne1ne1ne2ne2.しかし、繁殖プログラムの研究者たちは、期待される1/16の比率よりも多くの無蜜系統を観察しました。これは、遺伝子が次のように発現したときに蜜の形質が発現することを意味します。 Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2.ホモ接合の蜜腺集団における蜜腺形質の多様な発現パターン(Ne1Ne1Ne2Ne2)、ヘテロ接合体の蜜腺(Ne1ne1Ne2ne2)、およびホモ接合の蜜腺なし(ne1ne1ne2ne2)植物は、デジタル画像で視覚化された変化を検出することで完全にスコアリングできます^12,13.蜜腺が減少したヘテロ接合植物は視覚的に蜜腺形質を示さず、蜜腺がない形質に似ていることもあるため、視覚的な表現型付けはこの形質の信頼できる選択に課題をもたらします。これらの問題は、特定の綿花品種では蜜腺が存在しない晩年には顕著になります。ヘテロ接合植物とホモ接合の蜜を持たない植物の違いはデジタルイメージングで容易に検出できます。ヘテロ接合植物は蜜腺が小さく減少するのに対し、ホモ接合植物はこの特徴が全くありません。表現型的には、蜜腺の存在は蜜腺(少なくとも1つの優性遺伝子を持つホモ接合/ヘテロ接合体)、小型または退化性の蜜腺の存在はヘテロ接合、蜜腺の不在はホモ接合の無蜜腺植物に分類されます。デジタル画像スコアリングは、ヘテロ接合植物を無蜜植物として誤ったスコアリングを減らすことに成功しました。同様に、形質発現が最も大きい中期開花期が好まれます。したがって、この段階で葉と花のサンプルを収集し、蜜腺形質の正確かつ信頼性の高い評価のための表現型得点実験を実施しました。さらに、デジタル顕微鏡を用いた蜜腺形質の可視化は、蜜腺形質を持たない集団の偽陽性を防止・減少させます。この蜜腺特性の表現型スコアリングは、蜜を持たない形質に関連するDNAマーカーを特定するマッピング研究にも用いられており、繁殖者は蜜を使わない形質のマーカー補助選択(MAS)に利用できます¹³.このスコアリング技術は、腺、毛、色などの他の形質の研究に加え、他の植物種にも拡張可能です。全体として、デジタル画像スコアリングは高解像度画像を提供することで不正確な蜜状スコアリングの問題を解決するだけでなく、微妙な表情の変化を特定し、デジタル画像を将来の利用のために保存します。無蜜性特性を持つ綿花は害虫の生物防除にも利用されるほか、この特性が昆虫同士の有益な相互作用を促進する研究課題にも答えます。

Protocol

1. 温室/圃場の葉のサンプリング(図1)

1. サンプルIDを記載したサンプルのジップロック袋を用意してください。サンプル袋は使用まで室温で保管してください。
2. サンプル採取の前日に冷蔵庫に入れてください。冷凍庫から氷嚢をクーラーの底に置きます。クーラーの中の氷嚢の上にプラスチックのトレイを置いてください。
   注意:この目的にはどんなポータブルクーラーでも使用できます。冷蔵庫に氷嚢を入れ、その後プラスチックトレイを置きます(この分離により、サンプルが氷に直接触れて凍結損傷が起こるのを防ぎます)。その後、クーラーをサンプル採取場所へ運びます。
3. サンプル採取のために、クーラーボックスとラベル付きのジップロックバッグを温室や畑まで運びます。野外植物では害虫のないサンプルを採取するための定期的な散布が予定されていました。同様に、温室植物については健康な植物に対して定期的な散布と肥料のスケジュールが守られていました。
4. ラベル付きのサンプル袋に、8〜12週間の温室または畑で育てられた綿花の若い葉組織を採取してください。
   1. 標本選定は花期の中間段階を選びましょう。この段階で蜜腺形質が最も多く発現しているためです。この発達段階のすべての植物から若い葉を選びます。遺伝的・環境的影響に加え、蜜の特性は発達段階にも影響を受けます。
   2. F2集団内の異なる遺伝子型比較のために発生段階を一定に保つために、葉標本を一様に採取してこの段階との比較を制限します。葉の大きさ5〜7cmを基準にしますが、すべてのサンプルから同じ大きさの若い葉を採取できます。古い葉は蜜腺の形質を示しますが、一部の系統では発育の後期段階では蜜腺の形質が現れないこともあります。このばらつきを避け、データ収集の一貫性を高めるために、サンプル採取時に以下の指示に従ってください。
5. サンプルの葉組織を採取し、それぞれのサンプルバッグに入れます。植物サンプルごとに少なくとも2枚の葉を採取してください。
6. 葉組織については、植物の上枝から葉の葉片横に5〜7cmの健康な葉を選びます。
   注意:すべてのサンプルで上部の枝に生えている若い葉が好まれます。この種のサンプル採取は、特定の発達段階にサンプリングを限定するだけでなく、サンプルの種類を一定に保つことで表現型の誤差を減らすことができます。その他の条件として、アクセスしやすさと健康な葉が挙げられます。同一発生段階から複数の植物の葉を採取した場合、一貫したデータ比較を行い、集団内の遺伝子型に基づく表現型の違いを特定します。
7. 葉の組織を入れた密封されたサンプル袋をクーラーに入れます。クーラーを研究所に運んでください。
8. 個々のサンプルを冷蔵庫に移し、4°Cの冷却条件を保ちます。 蜜のデジタル画像化までサンプルを冷蔵庫で保存します。葉はデジタル画像撮影のために最大2日間保存可能ですが、当日または翌日に撮影するのが望ましいです。
9. 大量の葉片サンプルをスクリーニングする場合は、収穫後1日以内に画像診断を完了するために、バッチで採取してください。10〜20個のバッチでサンプルを採取するか、複数のクーラーを使って組織損傷や組織の折りたたみを防ぎましょう。良いデジタル画像のためにサンプルの収集には注意が必要です。

2. 温室/圃場での花の採取(図1)

1. ステップ1.1から1.6までに従ってください。8〜12週間の温室や畑で育てた綿花から花を集めましょう。植物サンプルごとに少なくとも2花を採取してください。
   1. 通常、植物が開花の途中の最上部の枝から花を集めます。蜜腺の特徴は開花中期で最も高い表現を示します。
2. 健康的な花を摘みましょう。密封されたサンプル袋には少なくとも2本の花を入れてクーラーに入れます。クーラーを研究所に運んでください。
3. 個々のサンプルを冷蔵庫に移し、4°Cの冷却条件を保ちます。 胚皮の鼻桃のデジタル画像化までサンプルを冷蔵庫で保存してください。
   1. サンプルは採取当日または翌日に処理されます。花のサンプルを採取し、4°Cで保存し、同日に苞蜜腺を処理します。翌日後半または週の後半に咲く花を採取し、同日に苞蜜のデジタルイメージング処理を行います。

3. デジタル顕微鏡の初期セットアップ(補足図1)

注:他の同等の顕微鏡もデジタルで画像を撮影・保存するために使用できます。

1. 顕微鏡(VHX 600)を起動し、最初の手順を進めます。顕微鏡ステージのサイズに合わせて半折りたたんだA4の白い紙を置きます。
2. コンソールコントローラーにある小さなライトノブを使って顕微鏡のプラットフォーム/ステージの光を調整します。
3. 照明スイッチ(コンソールの小さなノブ)を最大にして最大にし、明るさスイッチ(コンソールの大きなノブ)を3/4回して中高にします。
4. 内蔵のVHX 600ソフトウェアは、パソコン画面上でレンズ調整のオプションを表示します。画面の10倍レンズオプションを選択してレンズを10倍に調整します。パソコンの前面画面のモニター電源スイッチをオンにすると、メインメニューが表示され、レンズと画像録画のオプションが表示されます。
5. 冷蔵庫から少量(3〜5個)のサンプルをクーラーに取り込み、デジタル画像撮影を行います。サンプル入ったクーラーを顕微鏡のそばに置いてください。
6. まな板と滅菌刃は、顕微鏡の近くの作業台に置いておきましょう。クーラーから1つのサンプルを取り出し、デジタル画像診断を進めます(図1)。

4. 葉の蜜のデジタルイメージングとスコアリング(図2)

1. ステップ1と3を進めてください。サンプルのジップロック袋を開けて、葉のサンプルをまな板の上に置きます。葉柄を無菌の刃で切ります。
   注意:刃物を安全に使用するためには、手袋を着用し、刃の鋭い刃先を指から外向きにし、切開時は組織を指の間に挟んでください。
2. 葉の組織をステージに置いたあらかじめカットされた白いシートに移します。顕微鏡ステージの中央の葉組織を裏返し、背面を上にします。
3. 顕微鏡のノブの粗い調整と細かい調整を優しく回して、葉の中央肋に集中してください。画像にぼやけがなくなるまで調整を続けてください。
4. 蜜は中脈の下端に存在するため、中央脈と後の分岐脈が観察された中央に保ちます。葉っぱは舞台の中央にピントを合わせておきましょう。
   注:家庭綿では葉の蜜腺が1つしか見られませんが、野生種では3つの蜜腺が見られ、中央脈と両側の側脈にそれぞれ1つずつあります(蜜腺総数:3)。
5. 顕微鏡の粗い調整と細かい調整を調整し、デジタル画像の鮮明さを向上させます。葉の蜜の画像を撮影し保存するために、すべての画像調整を行いましょう。
   1. デジタル画像に光が反射しないように、すべての照明を消して画像をコンピュータ画面に記録してください。部屋のすべての照明を消し、テーブルランプで各サンプルを処理してください。すべての手順が終わったら、ランプを消し、顕微鏡の光だけを点灯させて画像を記録します。
6. プログラムが複数の保存オプションを表示するウィンドウを表示したら画像を保存してください。各画像にサンプルのID番号をラベル付けして保存します。蜜腺の表現型に基づいて、葉の蜜腺デジタル画像を1、2、3、4と評価します。各サンプルIDのスコアシートを更新してください。

5. ブラクテア蜜腺のデジタル画像およびスコアリング(図3)

1. ステップ2と3を踏みます。少量の花のサンプル(2〜3個)を画像検査用に移します。ジップロック袋から花のサンプルを取り出してください。
2. 苞片はピンセットや手作業で花から取り除きます。花をきれいなまな板の上に置きます。滅菌の刃で花の茎を切ります。除去された苞片の縁に沿って無菌の刃を使ってまっすぐ切開します。
3. 組織を逆さま(葉柄が上向きに)顕微鏡ステージに敷いたあらかじめ切られた白いシートの上に置きます。
4. 画面に表示される画像の鮮明さを向上させるために、粗い調整と細かい調整を行ってください。すべての画像調整を行い、コンソールコントローラーの録画ボタンをクリックして葉っぱの画像をキャプチャしてください。
   1. 画像調整は、小さなノブ/ライトスイッチを最大に、大きなノブ/明るさスイッチをミディアム・ハイに設定することで行います(ノブを3/4^秒に回すことで)。次に、顕微鏡の粗い調整と細かい調整を回転させて画像の解像度を向上させます。これらの調整は一定に保ち、サンプル全体を撮影するまでサンプルを切り替えます。デジタル画像に光の反射を避けるために、すべての照明を消し、画像をコンピューターに記録してください。
5. その後、プログラムは画像を保存するためのすべてのコンピュータ位置を表示するウィンドウを表示します。サンプルのID番号とともにデジタル画像をコンピューターに保存します。
6. 取得したデジタル画像で観察された表現型に基づき、苞片の蜜腺(補足図2)に1、2、3、4のスコアをつけます。今後の分析のために、サンプルIDと該当スコアをスコアシートに更新してください

Results

本研究では、8〜12週間畑で栽培した綿花が選ばれました。各植物ごとに少なくとも2つの技術的複製が収集されました。健康な若い葉のサンプルは、葉葉の長さが5〜7cmの上部枝から採取されます。健康な花のサンプルは、同じ日に開く開花や花蕾から採取されます。フィールドから異なる植物系統から葉や花のサンプルを採取し、顕微鏡を用いて両方の組織タイプのデジタル画像を研究室で生成しました(図1)。サンプル採取から画像診断までの手順は、上記の手順に従って行われました(図2および図3に説明されています)。葉と苞片の両方の代表的な結果は、通常、蜜腺が欠如(1)、中間表現型の蜜腺(2, 3)、そして蜜を産生する完全に発達した蜜腺(4)を示しています。図4で生成されるデータは、2種類の異なる綿花植物(蜜花付きと無糖)から取得したデジタル画像です。葉の側面(中脈下側)のデジタル画像スコアリングの結果、2つの表現型が示され、スコア1(中脈に蜜がない)と4(蜜が完全に発育した蜜と蜜を持つ)が示されました。図4A、B)。同様に、花のサンプルから苞片の蜜腺を分析したところ、1(蜜腺なし)と4(完全に形成された蜜腺産生の蜜)の2つの表現型が示されました。図4C,D)。理想的には、同じ植物から採取した葉と花は同じパターンに従うべきであり、つまり蜜のない葉と蜜のない花は同じ植物に属し、蜜のついた葉と蜜の花は同じ植物に属すべきです。図5は、蜜具を持つ植物の葉と苞片の蜜腺を10倍、20倍、40倍でデジタル画像で収集し、蜜腺の特徴を明確に視覚化することで作成されました。さらに、蜜腺を持つ綿花の親と無蜜の_F2個体群を分離する際のスコアリングの付与を理解するために、これらの個体群の一つから葉組織を採取し、各葉の蜜腺サンプルごとにデジタル画像を作成しました。標準フォーマットのスコアリングである1、2、3、4に対応する選択された葉のデジタル画像は図6¹³にハイライトされています。よく見分けやすいパターンは、蜜腺の不在と蜜の存在です。蜜腺が欠如した場合は最低スコアが与えられ、完全に発達した蜜腺には最高得点が4点とされます。1から4までのスコア範囲(2、3)は未発達で、通常の蜜腺よりも小さいです。このパターンはホモ接合の無蜜腺(1つ(欠損)、2および3のスコア(蜜腺減少)、4個(完全に発育した)のホモ接合状態で観察できます。さらに、蜜を持つ親系統と無蜜の親系統を個体群とともに育てて、これらの違いを比較・理解することができます。

図1:葉と苞片の蜜腺の概要:サンプリングからデジタル顕微鏡までの可視化ステップ。 (A) 葉と花の両方のサンプル採取のために、花期中期の綿植物を選定。(B) 葉の蜜の特性を観察するために圃場から葉のサンプルを採取すること。(C)葉を裏返して葉の背面が上向きになるようにし、強調された黒い箱の部分にある蜜腺の特徴を観察します。(D)葉を顕微鏡ステージに置き、ピントを強調されたブラックボックス領域に保ち、葉の蜜腺のデジタル画像を記録します。(E) 花の中間段階で畑から花を採取する(A)。(F)まな板に花を置き、矢印の方向に白い箱の部分を直線的に切り込み、花の根元を分けます。(G) 切開した切片を顕微鏡ステージに置き、苞片の蜜腺のデジタルイメージングを行います。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:綿花の葉の蜜のデジタル画像化およびスコアリングの段階的な手順。 1. ラベル付きのサンプル袋で畑の葉を採取し、冷却容器に入れる 2.サンプルを積んだクーラーをラボ3に運びます。クーラー4から個別のサンプルを取り出します。個別のサンプル袋を開けて、5枚の葉を取り出します。葉柄を手で切るか刃を使うことができます。6. 葉をあらかじめ設定された顕微鏡ステージに置き、下側(アバキシャル)を上にします。コンピューター画面のVHX 600プログラムでズームを10倍に調整してください。顕微鏡の粗い調整と細かい調整をして、画像の最良の解像度を得ます。8. コンピュータ画面で観察された画像の調整(大小のノブで調整できる光や明るさを回転させて調整し、顕微鏡の細かいボタンや粗いボタンを使い、反射除去のために他のライトを消すなど)を観察します。デジタル画像はスコアリング用に保存してください。葉の蜜の周りをダッシュ円で描くと、画像8と9の葉の蜜腺の領域が強調されています。葉の蜜腺を顕微鏡で10倍(100μm)で観察してください。家庭綿花では葉の蜜腺が1つしか見られません(この画像で観察されています)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:綿における苞片蜜腺のデジタル画像およびスコアリングの段階的手順。 1. ラベル付きのサンプル袋に花のサンプルを採取し、クーラーに入れておく 2.クーラーからサンプルを1つ取り出します。3。花を一つ取る、4。苞は花から離して手動で切り取ってください。無菌刃を使って、苞片の縁に沿って直線的に切開します( 図1 の白いボックスで、その後のデジタルブラクティアの蜜の画像化に進む前)6.刻んだセクション7をひっくり返します。切開した葉柄面が上向きな切開部を顕微鏡ステージ8に置きます。顕微鏡に取り付けられたコンソールの照明と明るさのスイッチを使って光の調整を行います。顕微鏡の粗い調整と微調整を使い、良好な解像度の画像を収集しましょう。すべての画像は10倍(100μm)の顕微鏡で観察されます。腕の蜜を評価するためのデジタル画像を収集してください。腕蜜腺のデジタル画像に丸が描かれており、家庭用綿には3つの苞片蜜腺があります。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:綿葉の蜜腺および苞片蜜腺のデジタル画像。 (A) 蜜を含む葉;(B)蜜のない葉;(C) 3つの苞蜜を持つ花、(D) 苞片蜜腺のない花。葉と花の蜜腺を顕微鏡で10倍(100μm)で観察してください。ダッシュサークルは、葉の蜜腺および苞片の蜜腺の有無を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:葉と苞片の蜜腺を10倍、20倍、40倍で拡大し、デジタル画像で蜜腺を明確に識別しました。 (A) 蜜腺の中脈の蜜腺形質を観察するために葉のサンプルを採取します。(B)顕微鏡で10倍拡大で葉の蜜を観察します。(C)顕微鏡で20倍の拡大で葉の蜜を観察します。(D) 顕微鏡で40倍の拡大で葉の蜜腺を観察する。(E)苞片の花の切開。(F)顕微鏡で10倍の倍率で苞片の蜜腺を観察する。(G)20倍拡大で顕微鏡で腕袋の蜜腺を観察する。(H) 40倍の拡大で露顕鏡で苞片の蜜腺を観察する。各画像のスケールバーは、葉の蜜片や苞片の蜜具画像が撮影された倍率を示しています(ここでは10倍、20倍、40倍を示しています)。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:1、2、3、4のパターンに従う葉の蜜腺の標準的なスコアリングパターン。 (A) 破線円で強調された蜜腺のない葉サンプル(蜜腺なしの場合スコア1)。(B)観察された小葉の蜜腺は、ヘテロ接合状態のいずれかのパターン(蜜腺の点線円の図でスコア2)を示しています。(C) 葉の蜜腺、スコア3、ヘテロ接合体の別のパターン。(D) スコア4の完全形成された蜜腺。スケール10xは、画像撮影時の倍率を表します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:顕微鏡を使わずに見た葉の蜜腺と苞片の蜜腺。 図は伝統的なスコアリングで蜜腺がどのように現れるかを示しています。この数字は¹³から適応されたものです。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図8:集団の可能な遺伝子型 図は、多様な蜜を持つ親と無蜜を持つ両親の交配から生じた_F2 集団の遺伝子型を示しています。この表は¹³から適応しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

補足図1:デジタル顕微鏡のセットアップ。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

補足図2:観察された苞花の個数が異なります。このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

Discussion

蜜腺は、植物内で蜜を生成し、成功した交配のために特化した腺トリコームです。植物には栄養性および生殖性の蜜腺の両方が存在します。 ゴッシピウム 属(綿花)には50種以上があり、その大部分は葉の蜜腺を含み^ます。しかし、この特性は綿花では害虫を引き寄せ、さらなる収量減少を引き起こします^。育種者は、この問題を解決するためにG . tomentosum で最初に発見された自然に存在する無蜜性形質(蜜腺の欠如)を選びました。このため、この無花性特性を栽培された高^地綿花に取り入れました。最終的に、蜜を持つ系統と無蜜系統を親として選択することで、いくつかの個体群が生成されました。ホモ接合の無蜜腺群とヘテロ接合無蜜の個体群は肉眼で観察しても違いが見られないため、これらの植物を区別するための特別なツールが必要です。したがって、デジタル顕微鏡によるこのスコアリング方法は、従来のスコアリング( 図7参照)とは異なり、減少した蜜腺を可視化するだけでなく、ホモ接合の蜜を使わない植物としての不正確なスコアリングを防止します。

デジタル画像を用いた表現型スコアリングは、サンプル採取の具体的な時間点、サンプルの選択、葉や苞片の蜜の標準スコアリングスケールの使用、可能な遺伝子型、そしてスコアリングデータの解釈方法など、いくつかの重要な要素に依存します。まず、蜜分泌が最も多い成長期、一般的に7月の花期に葉や花を集めることが重要です。次に、適切な大きさと段階の葉や花の選択が表現型スコアリングにおいて重要な役割を果たします。葉については、葉の蜜に傷をつけるために、葉の葉片が5〜7cmの上部枝が好まれました。同様に、苞片の蜜腺のスコアリングには、上部の枝から健康な花が選ばれました。特定の発生段階でのサンプル選択は、発生段階依存の形質表現を除外して集団内の全植物を比較する場合でも役立ちます( 図8参照)。スコアリングの再現性を確認するため、1株あたり少なくとも2つのサンプルのデジタル画像が作成されました。同じ植物の複数複製を収集することは、一貫したデータ収集に役立ちます。

この方法の制約は、サンプル採取まで害虫のない植物を保つことにあります。害虫の被害地域は、組織内に産み付けられた組織や卵の斑点、またはアブラムシや他の昆虫に食べられたため蜜腺の見えない黒い部分の損傷によって識別できます。これは数百件のサンプルのスクリーニング中に観察されました。そのような場合、健康な葉や花を再度採取し、サンプルからの一貫したデータを得るために分析しました。これは定期的な害虫駆除スケジュールを維持し、肥料を補給することで健康な植物を育てることができます。説明したすべての重要なステップを踏むことで、表現型スコアリングのトラブルシューティングに役立ちます。

この技術は、DNAマーカーの同定を図譜化するなど、いくつかの応用があります。これにより、育種者がマーカー補助選択のために遺伝子型を特定するのに役立ちます。この表現型スコアリングは、環境や発達段階の影響に加え、この形質を制御する遺伝子のため、DNAマーカーによる確認が必要です。したがって、デジタル顕微鏡を用いてこの形質を表現型化することで、複数の集団から多数の植物から、蜜を失うと考えられる少数の系統に絞り込む出発点となります。DNAマーカーを用いて、これらの系統は新開発品種における無蜜形質性介病耐性の開発育種プログラムでの利用がさらに検証されています。この方法は、植物における蜜の形質や有益な昆虫との相互作用の理解にも役立ちます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
デジタル顕微鏡	キーエンスVHX	VHX 600	他の顕微鏡も使用可能です
ファーバーウェアまな板	ファーバーウェア	モデル番号78892-10	14インチ長 X 11インチ幅 X 0.5インチ幅。どのブランドでも使えます。この製品は amazon.com で入手可能です
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