再現可能なマクロスケール組織構造物のためのヒトASCベースのバイオファブリケーションの生物学的標準化

サマリー

本研究は、脂肪由来の幹細胞球体と3DプリントされたGelMAスキャフォールドを用いた再現可能なバイオファブリケーションワークフローを提示します。空間制御、融合能力、品質管理の指標を示し、再生医療への応用が期待される移植可能なマクロスケールの組織構造物を生み出します。

要約

実験室間で標準化されたプロトコルが存在しないことは、実験成果の比較可能性やバイオファブリケーション技術の効率的な移転に大きな障壁となっています。厳格な生物学的標準化は再現性を高めるだけでなく、組織工学戦略の臨床応用に不可欠な国内外の規制枠組みとの整合を促進します。本研究では、hADSCの単層培養、球状体形成、ゼラチンメサクリロイル(GelMA)足場の3Dプリント、球状体バイオアセンブリを含む標準化されたバイオファブリケーションワークフローを紹介します。品質管理指標は再現性を確保するために統合されました。3DプリントされたGelMA足場は、2つの中央孔を持ち、それぞれ数百個の球体を収容できる構造でした。印刷精度は、スキャフォールド寸法とCADモデルを比較することで確認され、わずかな有意でない偏差がありました。hADSCはアガロースマイクロモールド内で24時間以内に均一な球状体を形成しました。足場孔に種子をまくと、球体は72時間にわたって連続的に融合し、共焦点イメージングによってマクロスケールの構造が確認されました。足場の設計と印刷の精度により構造的支えが保証され、球状の均一性により構造の予測可能な形成が可能となりました。足場孔内で球体の融合により、足場の有無にかかわらず移植に適した組織構造が生まれ、このバイオアセンブリ手法の多様性が強調されました。これらの発見は、生物的標準化が生体組織構造物のバイオファブリケーションの再現可能な方法論を推進する上で極めて重要な役割を担い、将来の再生医療における臨床応用に有望な示唆を与えています。

概要

バイオアセンブリとバイオプリンティングは、組織工学における補完的なバイオファブリケーション手法であり、^{自動化技術1,2,3,4}を用いてマクロスケールで複雑な組織や臓器を構築することに重点を置いています。

球体は主にバイオアセンブルアプローチの構成要素としてバイオファブリケーションに組み込まれ^ました。球体は、細胞と周囲の組織微小環境との相互作用を生体内で再現する微小組織と考えられています。球状形成に用いられる細胞源の中で、脂肪由来幹細胞(ADSC)は分離の容易さ、長期培養維持、分^{化の可能性6,7,8}で際立っています。

球体はより大きな集合体を形成する固有の能力を持つため、バイオアセンブル法を受けるとより複雑な組織構造を生成することができます。この融合駆動型組織は幹細胞球体の再生および分化能力を高めます^9,10。

球状体バイオアセンブリは^{バイオマテ}リアルによって支援または誘導されることもあり、この戦略はスケーラブルで自動化されたバイオファブリケーションに適しています^12,13。

既存のバイオファブリケーション戦略は、足場を使わない球状体組み立てアプローチとハイドロゲル埋め^{込みバイオプリント}システムに大きく分類^{できます。}足場フリー法は、細胞間相互作用を活用し、自然発生的な細胞自己組織化と球体間融合のみに依存しています。しかし、外部の建築的誘導や幾何学的な閉じ込めがないため、これらのアプローチは空間制御が低下し、構造的^{予測可能性も}低い^5,15。これに対し、ハイドロゲルベースの封装アプローチは細胞をバルク行列内に埋め込み、構造的支持とあらかじめ定義された構造を提供します。^16,17は、融合初期段階での直接的な細胞間接触を部分的に制限し、細胞移動の動態に影響を与える^{可能性があります。}この枠組みでは、ゲラチンメサクリロイル(GelMA)などのプリント可能なバイオマテリアルが細胞接着モチーフを示し、球状体バイオアセンブリを促進する足場として機能^{する可能性があります。}3DプリントされたGelMA足場は、球体に幾何学的な閉じ込めと空間的誘導を提供し、融合を通じて制御された組織形成を促進し、より大きく構造的に定義された構造体に誘導すると仮説されています。このアプローチは、スキャフォールド誘導組織と定義されたハイドロゲル構造内での球状体融合を組み合わせることで、空間制御と構造再現性を向上させることを目的としています。しかし、現在のワークフローはプロセスの標準化や構造的バイオファブリケーションパラメータに焦点を当てており、長期的な組織成熟、機能的分化、大規模な自動化生産には対応していません。

生物学的標準化は再現性と拡張性を確保するだけでなく、バイオファブリケーション組織の機能的完全性を維持するためにも不可欠です^19,20。したがって、工学的、幾何学的、構造的パラメータの正確な制御が極めて重要であり、これらの要因は組織機能や成熟を含む生物学的パフォーマンスに直接影響します^5,21。標準化され再現可能なバイオファブリケーションのワークフローを提示し、以下の重要なステップを含みます:(1) ASC単層培養;(2) ASC球状体形成;(3) GelMAスキャフォールドの3Dプリント;および(4)球状体バイオアセンブリ(図1)。このワークフローの中で、球状体の均一性と球度、印刷の忠実度、足場形状の完全性など、客観的な品質管理指標が確立されました。

プロトコル

試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. アガロースマイクロモールドの準備およびGelMA 3Dプリント足場の製作

1. 0.9%塩化ナトリウム(NaCl)溶液中の2%アガロースマイクロモールドの製造( 図2A参照)
   注:すべての化学廃棄物は、機関の化学物質安全規則および有害廃棄物ガイドラインに従って取り扱い、処分されなければなりません。
   1. 0.9%のNaCl溶液を超純水に準備し、121°Cで30分間オートクレーブします。 使用までは滅菌状態で保管してください。
   2. 滅菌超純度アガロース1gを0.9%NaCl溶液50mLに希釈します。アガロースを電子レンジで10秒間隔で3〜5サイクル、均質化・脱重合し、完全に溶解するまで行います。
   3. 生体安全キャビネットで、市販のシリコーン型(81個の円形くぼみ)を滅菌ガーゼに置きます。
   4. シリコーン型の中央に600μLのアガロースを慎重に沈着させ、40分間休ませて完全な重合を確実にします。
   5. 完全に重合されたアガロースマイクロモールドを慎重に脱臼し、12ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに移します。
   6. アガロースマイクロモールドの位置を調整し、600μLのアガロースを充填して井戸の底に固定します。
   7. マイクロモールドを事前にキュベートするには、Dulbecco's Modified Eagle Medium Low Glucose(DMEM、2 mL/ウェル)で15分間培養します。この手順を2回繰り返し、3回目のインキュベーションでは、DMEMにアスコルビン酸(50 μg/mL)、ヒト血清アルブミン(1.25 μg/mL)、ペニシリン・ストレプトマイシン(PS, 1×、100×ストック溶液から)、およびITSサプリメント(1×、100×ストック溶液から)を補完した三次元(3D)培養培地に置き換えます。
      注:3D培養培地は、胎児用牛血清(FBS)を含まず、細胞間相互作用と細胞外マトリックスのサポートを促進する明確なサプリメントを含み、球状体の自己組織化と安定化を促進する点で単層培養培地と異なります。カビの製造と細胞メッキが異なる日に行われる場合は、2回目のDMEMインキュベーション後に手順を一時停止し、型は37°Cの加湿インキュベーターで最大5日間無菌状態で保管する必要があります。3次元培養培地による3回目の培養は、平板当日のみ行う必要があります。細胞をまく前に、ウェルとマイクロモールドの両方から培地を完全に取り除いてください。
2. ゼラチンメサクリロイル(GelMA)ハイドロゲルの製剤
   注意:試薬は感度が高いため、全て暗闇で行うべきです。本研究では、GelMA(ゲル強度300 g Bloom、置換度60%)および光開始剤リチウムフェニル-2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィネート(LAP)が使用されました。10% w/v GelMA溶液10 mLを調製するには、0.5% w/v LAP含有液:
   1. 50 mgのLAP粉末を1 mLのDMEMに溶かし、ピペットで優しく混ぜて透明で均質な溶液が得られるまでします。
   2. LAP溶液を9mLのDMEM入り遠心分離機チューブに移し、十分に混合します。
   3. 生物学的安全キャビネット内で、0.22μmフィルターを通して溶液をろ過して滅菌します。
   4. 溶液にGelMAを1g加え、50°Cで磁気攪拌を用いて約3時間均質化し、透明で均質な溶液が得られるまで続けます。フラスコを光にかざして、溶液に目に見える粒子や濁りがないか確認してください。
   5. 得られたハイドロゲルを10 mLの注射器に詰めて次の印刷にするか、すぐに使わない場合は光を遮った状態で2〜8°Cで保存し、使用まで保管してください。
      注:GelMAおよびLAP溶液は調製から約24時間後に使用されました。この溶液の長期保存は推奨されません。GelMAとLAPの粉末は、メーカーの指示に従って2〜8°Cで保存されるべきです。LAPフォトイニシエーターは、ABNT NBR 14725および規則(EC)第1272/2008号などの基準により非有害に分類されています。しかし、製造元は呼吸器や皮膚、目の刺激を防ぐために個人用保護具の使用を推奨しています。NIOSH(米国国立労働安全衛生研究所)やEN 166(EU)などの関連政府基準に従って試験・承認された安全メガネの使用、および厚さ0.11mm以下のニトリルゴム手袋の使用が推奨されます。呼吸器用防護は、ほこりが発生する場合にのみ必要です。フィルターによる呼吸保護に関するメーカーの推奨は、DIN EN 143、DIN EN 14387、その他使用されている特定の呼吸保護システムに関連する補完的な規格に基づいています。メーカーはP1タイプのフィルターの使用を推奨しています。
3. 3Dモデル設計、スライシング、Gコードファイルの生成
   注:3D足場モデルはオンラインの3Dコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアTinkercadを使用して設計されました。このプロトコルのために、直径15mm、底厚1mm、直径5.50mm、深さ2mmの円形孔2つの円筒形足場が生成されました。
   1. 3Dモデル設計が完成したら、*.stlファイル(補足ファイル1)としてエクスポートします。
   2. Repetier-Host V2.3.2ソフトウェアを開くと、設計モデルをスライスします。
   3. 「スライサー」タブで、希望するスライサーオプションを選択してください。この研究では CuraEngine が使用されました。
   4. 適切なパラメータプロファイルを設定してください。この作業では、速度10 mm/s;層高0.2mm;インフィルパターン:グリッド;ノズル径0.41mmが使用されました。
   5. 印刷する3Dモデルの*.stlファイルを読み込みます。
   6. 「スライサー」タブで、以前作成した設定を選択します。
   7. 「CuraEngineでスライス」をクリックしてください。スライスされた3Dモデルはソフトウェアインターフェース上で可視化されます。
   8. 「ファイルに保存」をクリックして、Gコードファイルを希望の場所に保存してください。
4. 球状体バイオアアセンブリ用のゼラチンメサクリロイル(GelMA)ハイドロゲル足場の3Dプリント
   注意:3Dプリントは無菌条件下で行う必要があります。したがって、印刷工程を始める前に、プリンターを収めた生物学的安全キャビネットが作動し、空気の流れが正常に機能しているかを確認してください。キャビネット保護ガラスの高さが機器センサーのマーキングと同じ高さであることを確認してください。
   1. バイオプリンターの安全ロックを外してください。
   2. 金属クリップを外してガラス板を印刷ベッドから取り出します。
   3. 適切な形状のアクリルガイドを取り付け、金属クリップを使って培養皿を印刷プラットフォームに固定します。
   4. プリンターを電源に接続してください。この機器はデュアル電圧(110/220 V)に対応していることにご注意ください。
   5. プリンターのUSBケーブルをパソコンに接続してください。
   6. オン/オフボタンを押してプリンターを起動します。
   7. Repetier-Host V2.3.2ソフトウェアを開いて、3Dモデルの閲覧と印刷に使います。
   8. ソフトウェアインターフェースの「Connect」オプションをクリックしてください。
   9. ソフトウェアの手動操作を使い、エクストルーダー(1または2)を選択し、プリントヘッドをホーム位置(X = 0, Y = 0, Z = 0)に送ります。
   10. 選択したエクストルーダーを調整し、Repetierの手動操作の適切なツールを使って適切なシリンジの取り付けを行います。
   11. すでにハイドロゲルを充填し、押出ノズルに接続したシリンジを慎重にエクストルーダーに挿入します(本研究では内径0.41mmの円錐形ポリプロピレンノズルを使用しました)。
   12. 培養板を印刷ベッドに取り付けたアクリルガイドに収めます。
   13. バイオプリンター左側にあるZエンドストップスクリューを使ってZのホーム位置(Z=0)を調整します。つまり、押出ノズルと印刷面の間の希望の距離を設定します。理想的には、ノズルが基質に軽く触れているべきであり、本研究では培養プレートが基質でした。
   14. プリントヘッドをホーム位置に戻してください。
   15. 以前に生成されたGコードファイルを読み込みます。
   16. ソフトウェア内の適切な手動制御ツールを使い、シリンジから一部のハイドロゲルを押し出し、ノズル内の材料の流れを確保します。
   17. 印刷工程を始めてください。
   18. 印刷後、3DバイオプリンターのUVライトシステム(395-400nmのLED2つ)を使って、得られた足場のフォトクロスリンクを行います。足場を5分間紫外線(光強度20 mW/cm^²)にさらします。
   19. マイクロモールドの製造に使われているのと同じ脱重合2%アガロース溶液を使い、3Dプリントされた足場を12ウェル培養プレートのウェルに取り付けます。スキャフォールドを井戸の底部に固定することは、安定性を高め、球状種子栽培や培養期間中の移動を防ぐために必要です。
       注意:ステップ4.16を行う際は、押出時にハイドロゲルが連続したフィラメントを形成しているか確認してください。通常、ゼラチン溶液は液体状態(約37°C)の状態で注射器に注入されます。室温(22〜25°C)で数分以内に、この生体材料はゲル状の質地に移行し始めます。押出中に材料が滴り落ちるのは避けるべきです。これは印刷品質に悪影響を及ぼします。押出時に連続的にフィラメント形成が進むことは、ハイドロゲルが印刷に最適な濃度に達していることを示しています。DMEMで希釈したGelMAおよびLAP溶液はややオレンジ色を帯びます。紫外線誘発による光架橋の後、色の変化が一般的に観察され、物質が白っぽくなったり半透明になったりします(図3D,Eに示されています)。紫外線システムを操作する際は、紫外線から十分な目の保護を確保するために安全メガネの着用が義務付けられています。
5. 印刷精度解析
   注:GelMA足場の3Dプリント忠実度解析では、足場径、孔径、足場厚のパラメータが考慮されます。測定はImageJバージョン1.54ソフトウェアを使用していました。
   1. まず、立体顕微鏡で観察した足場の画像を撮影します。定規やノギスを基準に使ってください。
   2. 画像を解析する前に、ImageJでキャリブレーションし、スケールを設定して測定を行います。
   3. 直線ツールを使って測定を行います。
   4. 足場と孔の形状はどちらも円形なので、統計解析には足場と孔径の算術平均を用います。
   5. 印刷精度分析については、ImageJが印刷した足場から得た測定値と、Tinkercadで生成された3Dモデルで定義された値を比較してください。
      注:測定された印刷足場の厚さは、Tinkercadで投影された孔深と底部厚さの合計値と比較されています。
   6. 得られたデータの統計解析を行います。この場合、測定された足場の値を期待値と比較するために、マン・ホイットニーU検定(非パラメータ)を用いることができます。シャピロ・ウィルク検定は正常性を評価するために用いられます。pが0.05<とき、差は統計的に有意と見なされます。

2. hADSCの調製および球状体形成

注: 市販のヒト脂肪由来間葉幹細胞(hADSC)を細胞特異的培地で培養し、製造元の推奨に従い80%〜90%の合流度で配管しました。このプロトコルでは細胞が第7号まで使用されました。すべての生物廃棄物は、処分前に適切に除染または滅菌され、機関のバイオセーフティガイドラインに従って取り扱われなければなりません。その後の共焦点可視化のために、単分子層は球状体形成前に蛍光染料で標識し、製造元の推奨に従って培養する必要があります。球状形成はラベル付けから30分後に開始されることがあります。

1. ASC単分子層のトリプシン化
   1. 生物学的安全キャビネットで培養フラスコを開け、その内容物を廃棄物容器に移します。
   2. 単分子層を1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗い、溶液を捨てます。
   3. 単分子層を覆うのに十分な0.125%のトリプシン/EDTA溶液を加えます。フラスコを閉じて、37°Cの加湿インキュベーターで最大5分間孵化します。
   4. トリプシン/EDTAを不活化させるには、同じ量のDMEMを10%胎児用牛血清(FBS)を補足して不活化します。
   5. 細胞懸濁液は血清学的ピペットで採取するか、遠心分離機管に移します。400 x g で室温(20〜25°C)で5分間遠心分離機で加熱します。
   6. 上澄液は慎重に捨てます。
   7. 細胞ペレットをDMEMに再懸浮させ、均質化します。細胞数と生存可能性評価のために別名を受けてください。
2. 球状培養( 図2B参照)
   1. 各型ごとに適切な数の細胞を15mLの遠心分離機チューブに分離します。hADSCの場合、81個の凹みを持つアガロース型には10個^の6 セルが1×つずつ入れられ、各マイクロウェルに1つの球状フォームが1つずつ形成され、1マイクロモールドあたり81球体が得られます。
   2. PBSを1×加え、室温で500 x g で遠心分離機で5分間加熱します。上澄液を捨ててPBSを1×追加します。この手順を2回繰り返してください。
   3. 3回目の遠心分離後、上清液を慎重に捨て、無菌ガーゼでチューブの開口部を乾燥させてから垂直に戻します。
   4. 細胞ペレットを120μLの3D培養培地に再懸浮させて球状培養と均質化を行います。必要に応じて追加の3D培養培地を用いて、懸濁液を200μLに調整してください。
      注:81回の切断がある各型は200μLの容量です。
   5. 200μLを吸引し、型の中央に慎重にメッキし、気泡の発生を防ぎます。
      注:この工程は、前述の²²通り、ロボットピペッティングシステムを用いて自動化可能です。
   6. 細胞が切除部に定着するまで、プレートを生物学的安全キャビネットに5分間置いておきましょう。
   7. 皿を加湿インキュベーターに40分間入れます。
   8. この期間終了後、各ウェルに3D培地2mLを慎重に加えます。プレートを37°Cの加湿インキュベーターに戻します。
3. 球状体測定と統計解析
   1. デジタルカメラと10×対物レンズを備えた逆立光学顕微鏡を用いて、アガロースマイクロモールドの2本の斜めに配置された球状体を「X」パターンに形成する画像を撮影します。直径を測定する前に、100μmスケールバーを使って画像スケールをキャリブレーションしてください。
   2. 球体の長径と短径を決定するには、ソフトウェアの「ライン」ツールを使い、撮影された各球体に対して約90°の角度で垂直に2回測定します。
   3. 各球体の平均直径を、先に測定した2つの垂直直径の算術平均として計算します。球面性は各球体の最大直径と最小直径の比率として計算し、1に近い値は均一性が高く球形が強くなることを示します。
   4. 得られた直径と球面度の値を用いて統計解析を行います。

3. 球状体融合およびバイオアセンブリのためのGelMA足場への球体シーディング

1. 球状形成が24時間経った後、広口径のピペットでアガロースマイクロモールドから採取し、2mLのマイクロチューブに移します。
2. 球体がマイクロチューブの底に沈んだら、上清液を捨てます。
3. 球状体を50μLの3Dメディウムに再懸浮させます。
4. ワイドボアの先端を持つピペットを使い、球体を集めてGelMA足場の孔に優しく埋め込みます。
   注:直径約5.50mm、深さ約2mmのGelMA支持孔で、約480〜640個の球体(6〜8個のアガロースマイクロモールドに相当、各81個の直径200〜400μmの球体を生成)を50μLに種子をまきます。この推定は孔体積と平均球状体径に基づいており、個々の球体数えではなく、完全なマイクロモールド数で定量化され、孔内の球状体密度の実用的かつ再現性のある推定が可能となりました。
5. 球体をGelMA支持孔に沈着させた後、20〜40分待って球体が沈殿します。各ウェルに1mLの3D培地を加えます。
6. 24時間後、各ウェルに1mLの3D培地を加えます。
7. 位相差顕微鏡および立体顕微鏡を用いて、GelMA足場の孔内での球体の融合を監視します。画像は、播種直後0日目から3日目(72時間)まで24時間ごとに取得してください。
8. 72時間後に4%パラホルマルデヒドで生物学的構造を固定し、共焦点顕微鏡で可視化します。有害かつ刺激性のある特性があるため、認証済みの化学煙幕で適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を用いて取り扱い、廃棄物は機関の化学物質安全ガイドラインに従って処分してください。共焦点観察のために、細胞は球状体形成前に蛍光染料で単層内にあらかじめ標識されるべきです。
   注意:GelMA孔から構成要素を除去する必要がある場合は、精密ピンセットまたは適切なサイズの生検パンチで慎重に回収してください。

結果

ヒト脂肪由来幹細胞(hASCs)を単層で培養した結果(図2C)、アガロースマイクロモールドにシードされてから24時間以内に球状体を形成させることに成功しました(図2D)。その結果生まれた球体は、コンパクトで明確な形態を示しました。形態計測解析では、24時間時点で平均直径239.8μm±87.0μm(図2E)、球面度の値はほぼ1(0.947±0.123)で、均一かつ対称な球体を示しました。

3Dプリント足場のCADモデルは、足場の全直径の約3分の1を占める2つの孔で設計されています(図3A,B)。モデルはスライスされ、対応するGコードが生成されました。Gコードファイルが生成されると、印刷ソフトウェアのRepetier Hostに読み込み、スライスさ...

ディスカッション

本研究の結果は、品質管理指標を標準化されたバイオファブリケーションワークフローに統合し再現性を確保していることを示しています。事前に確立された設計に基づく3Dプリント足場の使用により、球状体バイオアセンブリの構造的支えが提供されます^19,23。概念実証として、高密度球状荷重と誘導バイオアアセンブリを支える寸法の2つの中央多孔質領域を持つ堅固な足場が設計されました。

最初の品質管理チェックポイントとして、球状体測定が評価され、3DプリントされたGelMAベースの足場にシードされました。アガロース微成形ハイドロゲルを用いて、24時間後に均一な球状体を生成しました(図2D)。形態計測解析では、一貫した直径と高い球面度の値が示されました(図2E,F)。これ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	実験室で調製		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 with Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrifuge	Eppendorf	-	5702
Class II Biological Safety Cabinet	Streamline	-	Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell culture	Thermo Fisher Scientific	-	Series 8000 WJ
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%	Sigma-Aldrich	900622	Lot/Batch number: MKCS2673. Documentation for each batch, including the Safety Data Sheet (SDS) and the Certificate of Analysis (CoA), can be obtained from the manufacturer’s website.
GraphPad Prism 6.0 software	GraphPad Inc	-	-
Hot plate magnetic stirrer	IKA	Z671797	Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroids	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicillin-streptomycin 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)	Lonza	PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Trypsin/EDTA	Gibco	27250018	-