マウス角膜からの単細胞懸濁液採取プロトコル

サマリー

ここでは、コラーゲンAとトリプシンを用いた逐次消化を通じて、マウス全角膜から高品質な単細胞懸濁液を得るプロトコルを紹介します。この方法は高いRNA完全性を持つ生存可能な単一細胞を生成し、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリyなどの後続応用にも適合します。

要約

眼球の最外層である角膜は、眼表面の恒常性と視力の維持に重要な役割を果たします。単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)の最近の進歩により、角膜細胞の異質性の高解像度解析が可能になりましたが、角膜組織からの高品質な単一細胞懸濁液の製造は、その密度が高く複雑な構造のため依然として困難です。本研究では、マウスの全角膜から単一細胞懸濁液を生成する堅牢なプロトコルを確立します。この処置は角膜を細かい断片に刻み、その後コラーゲン酵素Aとトリプシンを用いた連続的な酵素消化を行います。得られた細胞懸濁液は複数の指標で品質評価されました。トリパンブルー染色法を用いて細胞の生存率と数を評価し、パンサイトケラチンおよびケラトカンの免疫蛍光染色により、主要な角膜細胞の同定と定量が可能となりました。RNAの完全性はバイオアナライザーを用いて検証されました。このプロトコルは、高い細胞数、優れた生存率(≥94.6%)、単一細胞の割合(96.3%)を持つ単一細胞製剤を一貫して得ており、scRNA-seqを含む要求の高い下流応用に対応しています。

概要

眼球の最外層に位置する角膜は、上皮層、ボウマン層、ストローマ層、デスケメ膜、内皮¹層の5つの明確な層からなる高度に組織化された構造により、バリアおよび屈折機能に不可欠です。角膜上皮は角質化されていない層状の扁平構造で、外部病原体に対する物理的なバリアを提供し、強力な抗菌および再生能力を示します。基質は正確に整列したコラーゲン線維で構成されており、角膜の透明性と均一な屈^折率2を維持しています。内皮は単細胞層であり、間質と房水間の液体移動を調整し、角膜の水分補給と栄養供給を維持します³.それにもかかわらず、この複雑な構造的・細胞的複雑さは、角膜の生物学的機能やその根本的なメカニズムの研究において、歴史的に大きな課題をもたらしてきました^。

細胞間相互作用の研究や細胞型特異的マーカーの同定には、フローサイトメトリーソート⁵ や単細胞RNAシーケンシング(scRNA-seq)⁶ などの技術が広く用いられています。しかし、両アプローチに共通する大きな技術的課題は、高品質な単一セル懸濁液の準備です。全細胞収量、単一細胞の割合、細胞生存率などのパラメータは、角膜細胞機能および表面マーカー発現の特性評価を目的とした後流応用の信頼性に^{不可欠です。}重要性があるにもかかわらず、マウスの全角膜から単細胞懸濁液を生成する標準化かつ効率的なプロトコルは依然として不足しています。

角膜組織から単細胞懸浮液を得るためのいくつかの方法が確立されています。コラーゲンA、トリプシン、またはトリプLEを用いた逐次酵素消化は、ヒトおよびマウスの角膜から単一細胞を分離するために用い^{られています。}角膜解離のためにも繰り返しトリプシン化が用いられています。さらに、Miltenyi Biotecのような市販の多組織解離キットが角膜単一細胞懸濁液の生成に成功裏に適用^{されています。}以前の角膜消化法の比較研究では、コラーゲン酵素とトリプシンによる連続治療が最適なアプローチであることが示されました。この方法は一貫して高い細胞数、優れた生存率(≥94.6%)、単一細胞の高い割合(96.3%)、そして良好に保存されたRNA完全性を得ています^。

本プロトコルでは、確立された経験と既存研究に基づき、最適化された酵素消化戦略を用いて、マウス角膜全体から高品質な単細胞懸濁液を生成する詳細な段階的な手順を提供します。

プロトコル

貴州医科大学実験動物センターから提供された6〜8週齢の雌C57BL/6(B6)マウス。動物たちは12時間の光と12時間の暗いサイクルで飼育され、 自由 に食べ物と水を得られていました。すべての手技は貴州医科大学実験動物倫理委員会(承認番号2305185)により承認され、眼科および視覚研究における動物利用に関するARVO声明に準拠して実施されました。

1. 準備

1. 手術器具の準備:眼用ハサミ2組、眼用鉗子2組、組織鉗子1組、2mL遠心分離機チューブを二重蒸留水(DDW)で2回洗浄して洗浄します。器具とチューブは蒸気オートクレーブで滅菌します。すべてのアイテムは65°Cの通常のオーブンで一晩乾燥させます。
2. 溶液調製
   1. 補助ホルモン上皮培地(SHEM):DMEM/F12培地に以下の成分を補足してSHEMを調製します:5%(v/v)胎児用牛血清(FBS)、0.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)、10 ng/mLマウス表皮成長因子、5.5 μg/mLトランスフェリン、0.5 μg/mLヒドロコルチゾン、1%(v/v)ペニシリン-ストレプトマイシン(100 U/mLペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン)。
      注:SHEMは処理中の細胞生存率を維持するために使用されます。これは、少なくとも10%(v/v)のFBSを含む基礎DMEMやリン酸緩衝生理食塩水(PBS)などの代替培地で置き換えることが可能です。
   2. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)
      1. 磁気攪拌器を使って22.4gのPBS粉末を2Lの二重蒸留水(DDW)に溶かし、1×PBSを得る。
      2. PBS溶液を1日前にオートクレーブして冷ましてください。
      3. 滅菌条件下で、無菌1×PBS47.5 mLを50 mL遠心分離機チューブに移し、1%(v/v)ペニシリン・ストレプトマイシンを2.5 mL加えます。
         注:1×PBS製剤(2L)には137 mM NaCl、8 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄、pH 7.2が含まれています。
   3. コラーゲンA溶液
      1. ストック溶液:1gのコラーゲンA粉末をDDW40mLに溶かします。0.2μmフィルターで滅菌し、-20°Cで保存します。
      2. 作業液:1mLのコラーゲナーゼAストック溶液を4mLの滅菌DDWに希釈し、最終濃度5mg/mLにします。
   4. トリプシン溶液:市販の0.25%(w/v)トリプシン/EDTA溶液(0.91 mM EDTAを含む)を氷上で溶けてから使用します。
   5. トライパンブルー溶液(0.4%):0.4gのトリパンブルーを100mLのDDWに溶かします。ろ過紙で濾し、4°Cで保存します。
      注:0.4%のトリパンブルー溶液は、総細胞数、単一細胞比率、生存可能性の評価に使用されます。市販の生死染色キットや自動細胞計数システムで代替されることもあります。

2. マウス角膜の調製

1. 解剖顕微鏡と作業エリアを75%エタノールで拭き取り滅菌し、その後、生物学的安全キャビネット内で30分間紫外線を照射します。
2. 無菌条件下で以下のものを準備します:60mmペトリ皿1皿に5 mLのSHEM培地、5 mLの1× PBSを5 mLに5%ペニシリン・ストレプトマイシン(P-S)添加した60 mmペトリ皿3皿、60 mmペトリ皿3皿(それぞれ1× PBSを5 mL入り)、および無菌の2 mL遠心分離機管を1つ
3. マウスを窒息させた後、頸部脱臼を施す。
4. 摘出前に、マウスの頭部と閉じたまぶたを5%のP-Sを含むPBSに3回浸して十分に洗い流します。
5. 眼科ハサミを使い、各眼球の後極に沿って切開をし、分離した目を氷のように冷たいSHEM培地を入れたペトリ皿に慎重に置きます(図1A)。
   注意:細胞の生存率を最大化するために、すべての溶液は4°Cまで事前に冷却し、すべての解剖作業は氷の上で行う必要があります。
6. すぐに眼球付きのペトリ皿を生物学的安全キャビネットに移してください。眼球を5%のP-Sを含む1×PBSに3回洗い、1回の洗浄で5分間孵化します。
7. 解剖顕微鏡の下で角膜組織を慎重に分離します。眼底ハサミと鉗子を使い、後端から角膜縁部に向かって切開します。角膜を強膜から優しく切り離し、縁状縁に沿って結膜を外します。レンズと虹彩は2対の鉗子を使って完全に取り除きます(図1B)。
8. 眼用鉗子を使い、角膜組織を1×PBSを含むペトリ皿に移し、残留した角膜以外の組織と抗生物質を3回(各5分)洗浄します。
   注:虹彩はしばしば角膜にしっかりと付着します。汚染を防ぐために鉗子で優しく完全に除去し、透明な角膜組織だけを残してください。
9. 眼用鉗子を使い、洗浄した角膜組織を2 mLの遠心分離機管に移し、1 mLのコラーゲナーゼA作動液(5 mg/mL)を加えます。
10. 眼科用ハサミを使い、角膜組織をチューブ内で約0.5mm×0.5mmの断片に細かく刻みます。
11. 角膜断片とコラーゲンA溶液を含むチューブを細胞培養インキュベーターで37°Cで1時間培養します(図2A-C)。
12. コラーゲンA消化中は10分ごとに組織を観察してください。大きな組織断片が残らなくなった時点で遠心分離で消化を終了します。300 x g の量で遠心分離機を室温で5分間遠心分離します。上清液を慎重に吸引してください。
13. ペレットを0.25%トリプシン/EDTA溶液200μLに再懸浮させます。
14. チューブを細胞培養インキュベーターで37°Cで10分間培養し、残った組織断片を消化します。

3. 角膜単細胞の単離

1. 混合物(組織とトリプシン/EDTA溶液)を、幅広の先端を持つP1000ピペットで繰り返し優しく乾燥させ、組織を単細胞懸液状に解離します。
2. 細胞懸濁液を300 x g で5分間遠心分離し、上清液を捨てます。細胞ペレットを0.04%の牛血清アルブミン(BSA)を含むPBS1 mLに再懸浮させ、単一細胞懸濁液を得る。
   注意:シーケンシングやフローサイトメトリー用の細胞については、血清フリーPBSにリサスペンドしてください。培養する細胞には、0.04%のBSAを補いたPBS1回を使用します。
3. 細胞懸濁液を事前に湿らせた40μmの細胞濾し器で新しい50 mL遠心分離機管に通し、細胞の塊や破片を除去します。
   注意:細胞損失を最小限に抑えるために、PBSでセルストレーナーを事前に湿らせてください。必要に応じて、ろ過したセルを再度遠心分離し、濃縮のために所定の体積に再懸浮させることもあります。

4. 細胞計数

1. 細胞懸濁液9μLと0.4%トリパンブルー溶液1μLを混ぜて優しく混ぜます。
2. 指定されたローディングチャネル を通じて 、混合液をゆっくりとヘモサイトメーターチャンバーに注入します。細胞数を4象限法で数え、細胞数、生存率、単細胞の割合を決定します。少なくとも2回の技術的なレプリケートを実行してください。

結果

単細胞懸濁液の品質は、総細胞収量、単一細胞の割合、細胞生存率に基づいて評価されました。懸濁液はトリパンブルーで染色され、複数の場にわたる位相差顕微鏡で分析されました(図3)。マウスの目4個(8個の角膜)から合計1.05個×10個の⁵ 細胞が得られ、平均細胞生存率は94.6%、単細胞比は96.3%を超えました。これらの結果により、準備された細胞懸濁液がフローサイトメトリーの選別や単細胞RNAシーケンスなどの下流用途に適していることが確認されます。

懸濁液中の上皮細胞、ストロマル細胞、内皮細胞の比例組成を調べるために、上皮マーカーのパンサイトケラチン(Pan-CK)および間質マーカーのケラトカン⁸を用いて免疫蛍光染色が行われました。Pan-CK陽性細胞は上皮細胞、角膜陽性細胞は間質細胞、陰性細胞は内皮細胞または他の^{細胞タイプとして}同定されました...

ディスカッション

単一細胞RNAシーケンシングの導入により、^眼科研究におけるゲノミクス、トランスクリプトミクス、エピジェネティック、プロテオミクス技術の利用が大幅に^{増加しました。}したがって、高品質な単一細胞懸濁液の調製はますます重要となっており、これにより個々の細胞間のシグナル伝達変異を検出でき、従来のバルク遺伝子発現プロファイリングでは得られない細胞異質性の深い洞察が得られる^13,14これまでの研究では、トリプシン/EDTAが精製された上皮細胞および内皮細胞の解離に依存することが多かった^15,16。し...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Alexa Fluor 594 ロバアンチラビット	アブカム	ab150064
抗角化素	アブカム	AB230175
抗パンサイトケラチン	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AE1/AE3、Alexa FluorTM 488
オートクレーブ滅菌器	安沈	LDZH-100KBS
牛血清アルブミンV	ソーラービオ	A8020
セルフィルター	ネスト	258369	40 & mu;m
遠心機	エッペンドルフAG	22331 ハンブルク
コラーゲン酵素A型	ロッシュ	10103578001
共焦点顕微鏡	オーバーコーヘン	ツァイスLSM 880
カウントプレート	マリエンフェルト	M407859
遠心管	ネスト	620611	2mL、50mL
カバースリップ	マリエンフェルト	M407859
ダピ	ソーラービオ	C0065
解剖顕微鏡	カール・ツァイス	VISU150
DMEM/F12 メディア	ギブコ	11320033
DMSO	ソーラービオ	D8371
胎児 bovine 血清	ギブコ	16140071
ヒドロコルチゾン	ソーラービオ	IH0100
その	ギブコ	23337619
マウス表皮成長因子	インビトロジェン	PMG8041
眼科外科 鉗子	ドゥモット	0208-5-PO
眼科外科はさみ	FST	15021-15
オーブン	AISITE	DH6000 II
ペニシリン&ストレプトマイシン	ギブコ	15070063	100mL
ペトリ皿	ネスト	705201	60mm
リン酸塩緩衝塩水	ソーラービオ	P1010
サーモスタティックインキュベーター	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	3111
トライトン-X 100	ソーラービオ	T8200
トリパンブルー	ソーラービオ	T8070
トリプシン/EDTA	ギブコ	R001100
超洗浄テーブル	幽気	VS-840-2
4% パラホルマルデヒド	ソーラービオ	P1110