このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

1.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/69853

⸱

2026年3月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

この記事について

サマリー

このプロトコルは、細胞膜タンパク質のナノスケール空間的組織を解消するための単一抗体標識(SAL)を記述しています。抗体とエピトープの累積相互作用を単一分子レベルで活用することで、膜SAL(mSAL)は局所的なエピトープ分布をマッピングしつつ、同時にネイティブ細胞環境における抗体結合挙動を捉えます。

要約

細胞膜は細胞の形状を定義し、細胞間のコミュニケーションを支配するインターフェースとして機能します。膜タンパク質は治療標的の主要なクラスを構成しています。したがって、細胞膜を構成タンパク質を通じて超分解することは、細胞生物学および抗体治療の進展に大きな期待を秘めています。この点で、単分子局在顕微鏡(SMLM)は生物構造上のタンパク質組織のナノスケール可視化を可能にします。SMLMの重要性にもかかわらず、細胞膜タンパク質への応用には独自の課題があります。本プロトコルでは、膜SAL(mSAL)と呼ばれるタイムラプス単一抗体標識(SAL)を用いた効果的なアプローチを提案します。抗体濃度、レーザー出力密度、非照射間隔の持続時間、画像再構築、密度ベースのクラスタ解析など、ナノスケールの膜タンパク質分布や膜形態の解明を目的とした詳細な手順を提供します。テトラスパニンタンパク質CD81をモデル膜タンパク質として用いて、mSALが付着細胞および懸濁細胞の両方に作用することを実証します。細胞膜や膜タンパク質の分布を超分解するだけでなく、本技術により、治療用抗体がその膜標的と天然膜環境で相互作用する薬理力学の調査も可能にしています。

概要

細胞膜には、細胞の移動性、接着、感知、細胞間コミュニケーションを調節する多様なタンパク質が含まれています。細胞膜タンパク質のナノスケール分布を理解することは重要であり、タンパク質の機能は発現レベルだけでなく、膜上の空間的配列によっても左右されることが多いからです。特に、多くの治療用抗体は膜タンパク質を標的としており、ナノスケールの研究は、局所的な膜タンパク質の組織によって抗体相互作用がどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。しかし、膜タンパク質分布の正確なマッピング、単一分子による存在比のプロファイリング、結合パートナーとの動的相互作用のリアルタイムモニタリングは依然として困難です。

直接確率的光学再構築顕微鏡(dSTORM)5,6やナノスケール地形画像撮影のためのDNA点蓄積(DNA-PAINT)7など、広く使われている単一分子局在顕微鏡(SMLM)技術は、試料標識に免疫蛍光(IF)染色を使用しています。これらは横方向分解能~10nmに達し、ヒト表皮成長因子受容体2(HER2)8,9、CD2010、T細胞受容体11,12,13、プログラムデスリガンド1 14、B細胞受容体15,16,17、CD19 17を含む治療用膜標的のナノスケールの組織化に関する広範な洞察を提供しました。18. 例えば、治療用モノクローナル抗体トラスツズマブを用いて乳がんに関与する主要な受容体HER2を直接検出したd STORM研究では、HER2陽性患者8に明確なクラスタリング状態が見られ、異なる治療用抗体がHER2クラスタリングを調節することが示されています。DNA-PAINTと格子光シート顕微鏡を組み合わせることで、治療用モノクローナル抗体リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ10と組み合わせて、B細胞におけるCD20のオリゴマー状態および相互作用プロファイルが明らかにされました。従来のSMLMはナノスケールの組織化に関する貴重な洞察を提供しますが、その潜在能力は従来のIF染色法によって制限されています。SMLM画像の品質はIF染色に依存し、さらに標識抗体の特異性と親和性によって決定されます。従来のSMLMは高親和性抗体を使用し、通常は優れたIF染色と画像品質を実現します。しかし、ほとんどの治療用抗体は、オフターゲットの副作用を最小限に抑えるために、生細胞の膜受容体と中程度の親和性で相互作用します19。例えば、二特異的T細胞関与株(TCEs)はCD3に対する親和性が低く、これがTCRの内在化を妨げます。このような相互作用は従来のIF手法では正確に捉えられません。

以前には、単一分子抗体とエピトープの相互作用を直接活用する戦略、単一抗体標識(SAL)を開発しました。SALは抗体-エピトープ相互作用の高密度マッピングを可能にしつつ、ネイティブ結合平衡を維持します。以前、細胞内細胞骨格およびミトコンドリアタンパク質24のプロトコルを報告していますが、膜タンパク質に対するSALはまだ実証されていません。本プロトコルでは、テトラスパニンCD81(治療的標的候補25,26,27,28)を懸濁細胞および付着細胞の両方で標識することで示した、膜タンパク質へのSAL適用のステップバイステップワークフローを提供します。蛍光標識された抗CD81抗体を用いて、U2OSおよびJurkat T細胞におけるCD81の空間分布を直接探査し、膜タンパク質のSALナノスケール研究の応用を示しました。この戦略を膜SAL(mSAL)と呼びました。最後に、細胞外で単離された単一分子検出を減らすためのクラスタリング戦略を記述します。

本質的に、SALはタイムラプス単一分子標識を用いて個々の抗体とエピトープの相互作用を捉え、その後の単一エミッター脱畳み込みによりSMLMに基づく超高解像度画像が得られます。抗体濃度を調整し、連続した画像フレーム間で適切な非照射区間(NII)を選択することで、SALは抗体オンレートを単一分子検出率に合わせ、単一分子の局在化を可能にします。SALは抗体の結合速度が本質的に遅いため、画像取得時間(~3〜17時間)を延ばすため、NII数が長くなります。SALは、エピトープの正確なナノスケールマッピングや個々の抗体-エピトープ相互作用動態の評価を必要とする応用に最適です。スループットは低いものの、生理学的条件下でのエピトープ組織や抗体結合に関する独自の洞察を提供し、治療用抗体の現場解析に特に価値があります。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

このプロトコルは確立されたJurkat E6.1およびU2OS細胞株を使用し、一次ヒトや生きた動物の材料は使用しません。

1. 細胞の種まき/着地および固定

注:サンプル調製は標準的な免疫蛍光(IF)染色プロトコルに従い、異なる細胞型にわたる細胞膜タンパク質の細胞内組織を維持するよう最適化されています。対象の対象に対して確立された免疫染色プロトコルが存在する場合、ユーザーはサンプルブロッキングステップ1.2.14までそのプロトコルに従うことができます。単一抗体標識(SAL)は、蛍光標識抗体が抗原に単一分子レベルで結合する際に累積的に検出されることに依存しています。イメージングバッファーで希釈された蛍光標識抗体が顕微鏡ステージの試料に加えられ、画像取得が進むにつれて蛍光標識が動的に行われます。試料準備段階では蛍光標識は行われません。

  1. 以前に発表されたプロトコル24に記載されたU2OS細胞株などの接着細胞を準備します。
  2. セル懸濁液
    1. ジュルカットT細胞を、10 mLの完全なRPMI培地(RPMI 1640に10%(v/v)胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補給)を、加湿インキュベーターに5%CO2を添加した状態で、37°Cで10 x 10 5〜10 x 106 cells/mLの密度で維持します。
      注:推奨される10mLの完全培地はT25フラスコに適用されます。異なる培養容器を使用する場合、ユーザーはそれに応じて体積を調整すべきです。
    2. 8ウェルのチャンバー付きカバーガラスで使用するためのウェルに0.01%ポリLリジン(PLL)溶液200μLを加えてガラス表面を準備します。4°Cで一晩、または37°Cで2時間培養します。
    3. ヘモサイトメーターで培養中の細胞数を数え、3.5 x 10 x4 細胞を1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。
      注意:単一セルの分布を適切にするためにセル数の調整が必要になる場合があります。3万〜6万個のジュルカットT細胞のシード範囲は、単一の細胞が明確に分離されつつもまばらに分布しない理想的な密度を実現します。細胞数は新しい細胞タイプに合わせて調整する必要があるかもしれません。
    4. 300 x g で遠心分離機で3分間かけて細胞ペレットを得ます。上澄液を廃棄し、細胞ペレットを200μLの予備加温(37°C)1倍ドルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に再懸濁させます。できた細胞ペレットは、マイクロ遠心分離機チューブの底部に小さな白い堆積物として見えます。
      注意:バイオハザード廃棄物は、機関のガイドラインおよび適用される地方、州、連邦の規則に従って処分してください。
    5. 準備済みのチャンバー付きカバーガラスからPLL溶液を吸引します(ステップ1.2.2)。PLLを4°Cで一晩培養する場合は、8ウェルチャンバー付きのカバーガラスを37°Cまで予温めてから溶液を吸引します。
    6. ステップ1.2.4のセルサスペンションを追加します。PLLコーティングされたチャンバーウェルに取り付けます。37°Cの加湿インキュベーターで30分間培養し、5%CO2 を補給して細胞が表面に付着できるようにします。プレートを塗る前にセル懸濁液を十分に混ぜ、ピペットで上下にかけてセルの塊を砕き、井戸全体に均等に分布させます。
    7. 光学顕微鏡でガラス表面へのセルの付着を確認しましょう。10倍倍の拡大で、顕微鏡をカバーガラスの底に焦点を合わせます。
      注:顕微鏡で観察しながらチャンバー付きのカバーガラスを優しく叩くことで、細胞が表面に付着しているか、まだ浮いているかを判断するのに役立つかもしれません。
    8. 固定バッファー200μL(DPBSにパラホルマルデヒド4%、グルターアルデヒド0.1%)を準備し、水浴で37°Cまで予温します。
      注:提供される固定バッファーはCD81に最適化されており、一般的に膜タンパク質の保存に適しています。新しい膜タンパク質標的の場合、最適な保存を達成するためにバッファー組成の調整が必要になることがあります。ユーザーは新たなターゲットに合わせた固定条件については文献を参照することが推奨されています。
      注意:パラホルムアルデヒドは有毒かつ発がん性があります。グルターアルデヒドは有毒で腐食性があります。この試薬を扱う際は、適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに石鹸と水で患部をしっかり洗ってください。試薬は使用者の所属機関のガイドラインおよびすべての適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。
    9. 各サンプルウェルからDPBSをマイクロピペットで吸引します(ステップ1.2.6以降)。
      注意:溶液交換の手順は、カバーガラスから細胞が剥がさないようにゆっくり行うことが重要です。バイオハザード廃棄物は、利用者の機関のガイドラインおよび適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。
    10. ウェルの隅に予熱した37°Cの固定バッファー200μLを加え、室温で15分間キュベーションします。
      注意:パラホルムアルデヒドは有毒かつ発がん性があります。グルターアルデヒドは有毒で腐食性があります。これらの試薬を扱う際は、適切なPPEを着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに石鹸と水で患部をしっかり洗ってください。試薬は使用者の所属機関のガイドラインおよびすべての適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。
    11. 固定セルは500μLのDPBSで3回洗います。ステップ1.2.12を進む場合はこのステップを省略してください。
    12. オプション:固定液をゆっくりと除去し、DPBSに新たに調製した0.1%ホウ水素化ナトリウム200 μLを加え、室温で7分間培養します。このステップを飛ばして、ホウ水素化ナトリウム還元を使わない場合はステップ1.2.14に進みましょう。
      注:ホウ水素化ナトリウムによる還元は、グルターアルデヒドによって生成される自己蛍光を消滅し、未反応のアルデヒドを中和するのに役立ちます。水素化ナトリウムが水溶液と反応して水素ガスが放出されると、気泡の放出として現れます。水素ガスの放出が見られない場合は、新たに作られたホウ化ナトリウム溶液を使用します。
      注意:ホウ化ナトリウムは有毒で腐食性があります。この試薬を扱う際は適切なPPEを着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに石鹸と水で患部をしっかり洗ってください。試薬は使用者の所属機関のガイドラインおよびすべての適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。
    13. 各井戸からホウ水素化ナトリウム溶液を吸引し、500μLのDPBSで3回洗浄します。
    14. ブロッキングバッファー200μLを準備し、井戸に加えます。室温で30分間孵育します。透過性試薬(例:TritonX-100、サポニン)は膜タンパク質を除去する可能性があるため使用しないでください。ここで紹介したCD81の膜SAL(mSAL)プロトコルにはブロッキングステップが含まれていませんでした。
      注:新しいターゲットを持つmSALには、DPBS中に5%(w/v)の牛血清アルブミン(BSA)を含むブロッキングバッファーが推奨されます。二次抗体を使用する場合は、対応する血清がブロッキングに使用されます。例えば、ヤギ宿主二次抗体を用いたDPBS中に10%(v/v)のヤギ血清を投与します。確立されたブロッキングバッファのレシピとターゲットに対するプロトコルが存在する場合、ユーザーはそのプロトコルに従うことができます。ブロッキングバッファーは、アイソタイプコントロール抗体や血清由来抗体を補うためにオプションで補うことができ、抗体のオフターゲット結合を減らすことができます23,24。遮断バッファーに透過試薬は、抗体が膜タンパク質の細胞内エピトープを標的とする場合のみ含めてください。
    15. mSALで染料結合した一次抗体の場合は、直接ステップ1.2.20に進みます。
    16. 一次抗体染色液(ブロックバッファーで希釈した所定濃度の抗体)を150μL準備します。mSALの場合は、このステップを省略してください。
      注意:一次抗体染色については、推奨条件についてはベンダーのデータシートを参照してください。濃度情報が提供されていない場合は、全長のIgG23,24に対して4 μg/mL(27 nM)から始めます。
    17. ブロッキングバッファーを一次抗体溶液に置き換えます。室温で2時間、または湿度の高いチャンバーで4°Cで一晩孵化します。mSALの場合は、このステップを省略してください。
    18. サンプルを400μLのDPBSで2回洗います。井戸に200μLのブロッキングバッファを追加してください。
    19. オプション:ブロッキングバッファーを200μLの固定後バッファー(4%パラホルムアルデヒド)に交換し、室温で10分間培養します。
      注:固定後はSAL23,24のサンプルブロッキングの保存に役立ちます。しかし、エピトープのアクセスが低下するなら、このステップは省略すべきです。抗体による固定後定着がエピトープ認識に与える影響を評価するために、固定後固定の有無にかかわらず標準的な免疫蛍光染色を行い、染色の質を比較します。
    20. オプション:サンプルをDPBSで2回洗います。
    21. 各ウェルに200μLのDPBSを加え、蒸発を防ぐためにチャンバーを透明膜で覆います。サンプルは4°Cで最大1か月間保存可能です。ステップ1.2.14直後、または1.2.19で後固定なしでmSALを行う場合は、試料をブロッキングバッファ内に保持し、直接ステップ2.2に進みます。
      注:サンプルをDPBSに5 mMアジドナトリウムを補足して保管することで、保存中の細菌増殖を防ぐことができます。
      注意:アジドナトリウムは非常に有毒で、摂取すると致命的になる可能性があります。この試薬を扱う際は適切なPPEを着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに石鹸と水で患部をしっかり洗ってください。試薬は使用者の所属機関のガイドラインおよびすべての適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。

2. 画像取得

注:付着細胞と懸濁細胞の両方のイメージング手順は類似しており、全反射蛍光顕微鏡(TIRF)を用いて行われます。ただし、画像診断条件は各細胞タイプに最適化されるべきです。

  1. 画像撮影前に、ガラスの結露を防ぐために、保存されたサンプル(4°C)を室温に保ちます。試料準備後に直接画像診断に進む場合は、このステップを省略してください。
  2. 顕微鏡システムの電源:顕微鏡、sCMOSカメラ、レーザーユニット、そして画像取得ソフトウェアを搭載したコンピュータ。電源オン後、顕微鏡システムを5〜10分間安定させて、システムの部品が動作温度に達し、熱漂流を最小限に抑えるようにしましょう。
    注:mSALは任意のTIRF顕微鏡セットアップおよび対応ソフトウェアで実行可能です。機器の指示に従ってシステムの電源を入れてください。
  3. 浸漬油をTIRF対物レンズ(例:100x/1.49)に塗布し、チャンバー付きのカバーガラスを顕微鏡ステージに取り付けます。
    注意:対物レンズに補正カラーが付いている場合は、カバーガラスの厚さが23°Cで正しい設定になっていることを確認してください。 本研究で使用されたカバーガラスの厚さは0.13〜0.17mmでした。
  4. 装備が完了したら、パーフェクトフォーカスシステム(PFS)を作動させ、慎重に対物レンズをカバーガラスに持ち上げてサンプルをピント合わせます。
  5. 金コロイドをフィデューシャルマーカーとして準備します(超純水で1:2の希釈)。希釈前に金コロイドを3分間ソニック化して凝集体を分散させます。
  6. サンプルウェルから貯蔵バッファー(DPBSまたはブロッキングバッファ)を優しく吸引し、200μLの金コロイド溶液を試料に加えます。1分間培養して溶液を取り除きます。
  7. 明視野照明を使って、溶液を吸引する前に十分な金コロイドが沈着しているか確認してください。理想的な密度は、指定された関心領域(ROI)内に5〜10個の金コロイドからなります。
    注:あるいは、蛍光マイクロスフィア( 材料表参照)はDPBSで1:1,000の希釈で使用可能です。
  8. 過剰な金コロイドを除去するために超純水500μLで1回洗い、その後200μLのDPBSを加えます。
  9. イメージングソフトウェアでは、蛍光色素(抗体プローブの)の光学構成を作成し、適切な二色性、レーザー励起波長、出力密度、カメラの積分時間、放出フィルター、カメラのピクセルビニング(該当する場合)を設定します。最適な解像度を得るためには、150〜160 nmのピクセルサイズが推奨されます。
  10. 光漂白の工程のための光学的配置を作成します。レーザー出力は380 W/cm以上 、カメラの積分時間は1秒が推奨されます。
    注:獲得時の光漂白は、個々の蛍光抗体結合イベント間の重複を最小限に抑えるのに役立ちます。収集された光は、カメラの飽和を避けるために波長の非マッチングの発光フィルターを通して導かれます。
  11. レーザー角度を調整してTIRF照明を確立します。明視野照明を用いて、mSAL用のセルを特定します。画像再構成時の段階ドリフトを補正するために、ROI内に少なくとも5個の金コロイドが見えるようにしてください。イメージングレーザーの出力密度における金コロイドからの自己蛍光を確認してください。
  12. 画像取得ソフトウェアで画像パラメータを設定する:非照明間隔(NII)、フレーム数、光漂白の周波数(必要に応じて)です。CD81抗体を用いたU2OSおよびJurkat T細胞のCD81のmSALでは、最適なNIIは5秒、合計2,000フレーム、5フレームごとに光漂白のステップを行っていました。
    注:これらのパラメータは、関心のある各タンパク質、mSALに使用される抗体、細胞型に応じて最適化する必要があります。最適化の詳細についてはステップ3を参照してください。最適なフレーム数は抗体標的や細胞タイプによって異なる場合があります。新しいターゲットシステムでは、2,000〜3,000フレームのキャプチャを出発点として推奨します。NIIは画像取得時間を延長します。例えば、NIIが20秒の3,000フレームmSAL取得の場合、取得時間は約17時間となります。
  13. 画像バッファーを、CD81抗体を200μLの5% BSA(w/v)DPBS中に1μg/mL濃度に希釈して準備します。CD81のmSALでは、最終抗体濃度はJurkat T細胞で0.5 nM、U2OS細胞で2 nMでした。
    注:抗体濃度は局所的な基質の存在比と抗体の親和性に依存します。各タンパク質標的、画像に使用される抗体、細胞型ごとに抗体濃度を最適化することが極めて重要です。最適化の詳細についてはステップ3.1を参照してください。
  14. 準備済みのイメージングバッファを井戸に追加し、取得を開始します。

3. イメージングパラメータの最適化

注:mSALイメージングパラメータは、タンパク質の発現、局所的な組織、および画像に使用される抗体の選択によって影響を受けます。イメージングパラメータの最適化の目的は、空間的に分解された単一分子イベントを生み出しつつ、十分な密度を維持してエピトープサンプリングを最大化する抗体濃度とNIIを特定することです。

  1. 抗体濃度
    1. 抗体をジュルカット細胞用に0.5 nM、U2OS細胞用2 nMに、DPBS中5%(w/v)BSAを含んだ200 μLに希釈し、抗体溶液をウェルに加えます。最適な単一抗体標識のために、抗体濃度は平衡解離定数(Kd)またはその近辺に用いてください。 Kd が未知の場合、1 nMから始めるのが推奨されます。
    2. mSAL用に設定された画像診断ソフトウェアのライブビュー機能を利用して抗体結合を監視してください。
    3. TIRFの角度とイメージングパラメータを調整し、信号対雑音比(SNR)を≥ 3にします。
      注:最適なTIRF角度は、画像バッファー内の拡散抗体によるピントの合わない蛍光を抑え、SNRを向上させます。開始時に100〜200 W/cm²のレーザー出力密度と50msのカメラ積分時間を使用できます。SNRが低い場合は、レーザー出力やカメラの積分時間を徐々に増やし、最適な値に達するまでSNRの変化を監視します。
    4. 画像取得ソフトウェアでイメージングパラメータを設定し、NIIが5秒の少なくとも10フレームの取得を得られるようにします(ステップ2.12参照)。
      注:5sのNIIを出発点として推奨します。新しい抗体標的システムに最適なNIIを特定するためにNIIスキャンを行うべきです(ステップ3.2)。
    5. 買収を開始してください。記録された映画の単一分子局在のスパース性を評価する。
      注:局在密度を得るための詳細な手順は、以前の出版物24で説明されています。mSALにおいて、0.02から0.15イベント/μm²の単一分子局在密度が最適であることが判明しました。
    6. 画像バッファーを追加した直後に複数の重複抗体結合イベントが観察されたり、記録が進むにつれて単一分子の局在が蓄積した場合は、取得を中止してください。抗体濃度を2倍に減らし、新しいサンプルで採取を繰り返します。このプロセスを繰り返し、抗体濃度を2倍に減らし、単位面積あたりのイベント数を再評価し、望ましい単一分子局在イベント密度を達成するまで続けます。
      注:重複する事象は、最初の抗体の回折限界内で新しい抗体が結合すると、複数の大きな点が明るくなったり大きくなったりします。
    7. イベント密度が低い場合は、イメージングバッファー内の抗体濃度を2倍に増やし、新しいサンプルで再度取得を行います。このプロセスを繰り返し、抗体濃度を2倍に増やし、単位面積あたりの結合イベント数を再評価し、望ましい単一分子局在イベント密度を達成するまで続けます。
      注:後続の局在化密度評価において、プレ結合抗体による干渉を避けるため、各濃度最適化試験では新鮮なサンプルを使用することが推奨されます。
  2. NII最適化
    1. 画像取得ソフトウェアでイメージングパラメータを設定し、50フレームの取得を実現します(ステップ2.12参照)。NIIを0に設定してください(遅延なし)。
    2. イメージングバッファーをステップ3.1の最適化された抗体濃度に準備し、サンプルウェルに加えます。買収を開始してください。
    3. ステップ3.2.1から3.2.2を繰り返し、NIIを1、3、5、10、または20秒に調整します。新しいサンプルに対して各採集を行いましょう。
    4. 記録された映画の単一分子局在の密度と希薄さを評価してください(ステップ3.1.5-3.1.7参照)。最適な単一分子事象密度を持つ最低NIIが最適NIIとされます。
      注:対応するNIIに対して最適な単一分子局在密度を達成するために、抗体濃度をさらに最適化する必要がある場合があります。ステップ3.1を参照してください。以前の報告では、NIIが長い(10〜20秒)ほど高密度結合イベントに対して選択的であることが示されていますが、NIIを20秒以上延長しても追加の改善は見られませんでした(23,24)。画像取得の進行中に空間的に重なり合う結合イベントが発生した場合は、結合抗体から蛍光を除去するのに十分な間隔で光漂白を導入します。例えば、5フレーム目までに重複する事象が現れた場合、5フレームごとにフォトブリーチを適用します。空間的に重なり合うイベントの出現は、ステップ3.1.6の注意事項に記載されています。

4. データ分析

注:mSAL画像再構成は、無料のNIHソフトウェアFiji29とThunderSTORM30 プラグインを使用しています。このプロトコルではFijiバージョンv1.54rとThunderSTORMバージョン1.3が使用されました。詳細な画像解析は以前のプロトコル 24で記述されています。このセクションでは、mSAL専用の解析ワークフローを概説します。このプロトコルで示された解析は、光電子数1A/Dが0.98、カメラ基準レベルが100のPrime95B sCMOSカメラ(シリアルナンバー A18B203004)を用いました。イメージングピクセルサイズは147 nmに設定されています。

  1. 再構築のパラメータは「実行分析」ウィンドウで設定します。CD81 mSAL画像再構成に使用されるパラメータは以下に説明します。プレビュー機能は、選択されたフレーム内で検出された単一分子結合イベントを評価するために使用し、その後に完全な解析を行うべきです。
    画像フィルタリング:
    フィルター:ウェーブレットフィルター(Bスプライン)
    Bスプラインの順序:2
    Bスプラインスケール:4
    分子のおおよその局在:
    方法:局所最大
    ピーク強度閾値:標準(Wave.F1)
    接続性:8地区
    分子のサブピクセル局在化:
    方法:PSF:積分ガウス
    フィッティング半径[px]:2
    フィッティング方法:最尤
    初期シグマ[px]:0.75
    マルチエミッターフィッティング解析:選択されていません
    結果の可視化:
    方法:正規化ガウス
    倍率:7.3
    更新頻度[フレーム数]:50
    横方向不確実性:20
    注:事前フィルタリングパラメータは、背景での単一エミッタ検出を強化するために使われます。これらは出発点として機能しますが、各データセットごとに最適化されるべきです。単一分子結合イベントには、近似局在および検出法パラメータが用いられます。局所強度最大値と8近傍連結性を用いることは信頼性の高い性能をもたらすことが示されています。31。最尤フィッティングを用いた統合ガウス法が選ばれました。これは広く使われており、単一分子イメージング用途32,33,34,35における点拡散関数(PSF)の信頼性の高い近似を提供します。このプロトコルで用いられる可視化手法は正規化ガウス法です。ユーザーは自分のデータに最適な可視化方法を選択できます。倍率は再構成ピクセルサイズを20nmに設定しており、抗体ベースの標識で得られる推定局在精度(連結誤差は約10nm)に適しています。倍率7.3は、回折制限ピクセルサイズを希望される再構成ピクセルサイズ(147 nm / 20 nm = 7.3)で割って計算されました。更新頻度は再構成画像の処理時にどれくらいの頻度で更新されるかを決定しますが、最終的な結果には影響しません。横方向不確実性は20に設定されています(強制はせず)、再構成に計算された局所不確実性を取り入れます。利用可能なオプションの詳細については、ThunderSTORMユーザーガイド30を参照するか、入力欄の隣にある疑問符をクリックしてください。
  2. ThunderSTORM解析は、初期シグマ1.6ピクセル、フィッティング半径3から開始します。必要に応じてパラメータを細かく調整してください。回折制限画像ではイベント密度が重なり合わないようにするため、マルチエミッターフィッティングは使用されませんでした。
  3. 復元を実行するには OK をクリックしてください。入力が完了すると、結果ウィンドウが自動的に開きます。
  4. プロットヒ ストグラム 機能を使ってピークシグマを見つけてください。この値(nm)を生データピクセルサイズで割ってピクセルに変換し、新しい初期シグマの値とフィッティング半径を初期シグマ30の3倍に近い整数に設定してThunderSTORM解析を再実行します。
  5. 選択されたフィデューシャルマーカーを用いてドリフト補正を算出します。
  6. 画角全体にわたって画像を再構成し、計算されたドリフト補正を適用します。
  7. 画像の後処理は、結果ウィンドウの フィルター タブをクリックしてください。フィルターを適用して局所的に捉えにくいイベントを除去しましょう。CD81の表示結果では、シグマが200 nmを超え、不確実性が20 nmを超える事象は除去されました。プロットヒストグラム関数を使ってシグマ分布を調べ、適切なカットオフを決定します。
    注:シグマ値が大きい単一分子の局在化は、通常、光子数の少ない暗い蛍光素や重なり合うエミッターから生じます。不確実性が20 nmを超えるローカライズも除去されました。これは最終ピクセルサイズを超える不確実性はローカライゼーション精度が低いことを示しています。フィルタリングパラメータに関する追加のガイダンスについては、ThunderSTORMユーザーガイド30を参照してください。
  8. 単一分子局在データとともに結果表を保存し、下流解析のためにエクスポートを選択し てください。エクスポートされたファイルは.csvファイル形式で、このプロトコルでは「mSAL.csv」と呼ばれます。得られる正規化ガウス像を保存します。

5. クラスタ分析

注:エピトーププロービング中、抗体は意図した標的(特異的相互作用)および非特異的相互作用の分子と相互作用します。mSALは単一抗体-抗原結合イベントの累積検出に依存しているため、非特異的な相互作用が再構築画像に不可避的に寄与します。抗体-エピトープ相互作用は、特異的結合と非特異的結合を区別できる明確な動態的指紋を示します。非特異的結合は、単一分子の滞留時間36ではなく、局所的な相互作用密度によって区別されます。ここでは、ノイズ解析を用いた密度ベースの空間クラスタリング(DBSCAN)37を用いて、低密度イベントを除去し、特定の抗体結合を反映しやすい高密度イベントを保持することを記述します。さらに、密度ベースのクラスタリングは、特にCD81がテトラスパニンリッチ化されたマイクロドメイン38,39,40,41,42のように自然にクラスターに組織化することが知られているタンパク質のナノスケール空間的組織に関する定量的な洞察も提供します。提供されたDBSCAN解析はMATLAB 2025aを用いて実施されました。MATLABにアクセスできないユーザーには、PythonやR43、44、45などのオープンソース代替ツールを用いた同様のDBSCAN解析を行うことが推奨されます。このプロトコルで使用されるコードは以下の場所から取得できます:https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main。

  1. コードの実行
    1. 上記のGitHubリンクからMATLABファイルをダウンロードしてください。
    2. MATLABを起動してコードを開いてください。37行目と38行目で、クラスタリングパラメータの最小点数(minPTS)とイプシロンを設定します。以下のパラメータが利用されました:
      ジュルカットT細胞:
      minPTS: 7
      イプシロン:60
      U2OSセル:
      minPTS: 7
      イプシロン:80
      注:これらのパラメータの最適化についてはステップ5.2を参照してください。
    3. MATLABソフトウェアでファイルパスを、再構築されたmSAL.csvファイルを含むフォルダに設定します。
    4. 「 実行」をクリックしてコードを実行してください。コードはユーザーにファイルを選択するよう促します。 mSAL.csv ファイルを選択して「 開く」をクリックします。
    5. クラスタ化されたデータは、コード内で指定されたファイルパス内のMATLAB Dataというフォルダに自動的に保存されます。ThunderSTORMで「 プラグイン」>ThunderSTORMをクリックして、インポート/エクスポート>結果>インポートしてください。
    6. その結果得られた単一分子局在顕微鏡画像を保存します。
  2. クラスタリング入力の最適化
    注:DBSCANアルゴリズムの入力パラメータはminPTSとイプシロンの2つです。イプシロンは点の近傍を定めるために半径を定義し、minPTSはその近傍内で密な領域を形成するために必要な最小点数を指定します。この密度要件を満たす点はコア点と分類され、それらの近傍はクラスタに再帰的に加えられます。密度要件を満たしていないがコア点の近傍内に位置する点は境界点と呼ばれ、残りの点はすべてノイズ点とみなされます。
    1. 上記の入力(ステップ5.1.2)を出発点として解析を実行します。ノイズの局在数より大きく、セル上の局在数より少ないminPTS値を選択します。minPTSを選択した後、イプシロンを調整し、代表的なオンセル領域の近傍半径内でこの局在数を捉えられるようにします。
      注意:minPTSとイプシロンは互いに独立して調整可能です。これらのパラメータを選択する実用的な方法は、まずセル外のノイズ点の散乱図を調べ、セル内の同じ大きさの領域内で観測された局在数と比較することです。
    2. クラスタ化されたデータを示す 図2 のウィンドウを評価します。データが予想される表現型を含むセル上でクラスタを保持し、セル外の局在が最小化されている場合、クラスタリング入力は十分です。
      注:クラスタ化されたデータは、mSALで取得したデータの構造を保持すべきです。クラスタが小さく、元のデータの非常に高密度領域に局在し、期待される表現型に関連する多くの結合イベントを除外している場合、クラスタリングパラメータは制限が強すぎる可能性があります。細胞外の非特異的結合が大きなクラスターで十分に減少しない場合、クラスタリングパラメータがあまりにも包括的になることがあります。
    3. クラスタリングパラメータが厳しすぎる場合は、minPTSを減らし、クラスタ化されたデータにより多くのポイントを含めるようにイプシロンを増やします。クラスタリングパラメータがあまりにも包括的すぎる場合は、minPTSを増やし、イプシロンを減少させます。
    4. minPTSとイプシロンを調整した後、コードを再度実行します。最適なクラスタリングが得られるまで、ステップ5.2.2-5.2.3を繰り返します。

6. 抗体が標的に結合しているかどうかの検証

注:明確な形態を持たない膜タンパク質の場合、分離された構造の正確性の検証は困難です。抗体の特異性を検証するために、ユーザーは標的タンパク質の蛍光タンパク質(FP)融合を発現させることがあります。初期のチェックとして、FP融合を発現する細胞に対して従来の免疫蛍光染色を行うことができます。新規抗体の評価におけるより正確な検証のために、FP発現細胞に対してmSALを用いて、局所結合イベントが蛍光標的に対応することを確認することができます。ここでは、CD81-mStayGoldによるU2OS細胞のトランスフェクションプロトコルを例として紹介し、CD81 mSAL局在が細胞表面のFP標識CD81に対応することを確認することを可能にします。ユーザーは、検証対象の抗体の蛍光チャネルと発光が重複しない限り、適切な蛍光タンパク質を置換できます。

  1. U2OS細胞を8ウェルチャンバーにシードし、約70%のコンフルージョンに成長させます。細胞は200μLの完全成長培地(DMEMに10%(v/v)胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補足)で維持します。
  2. タンパク質をコードするDNA構成体100 ngと蛍光リポーター、5 μLのリポフェクタミン2000を組み合わせます。30秒間渦巻き、室温で30分間孵化します。
    注:本研究ではCD81をmStayGoldに融合させて使用しました。標準的な分子クローニング技術がDNAプラスミドの生成に用いられましたが、本プロトコルでは記載されていません。提供されるDNA:リポフェクタミン比率は、8ウェルチャンバースライドにシードされた細胞に最適化されており、他のサンプルフォーマットでは製造元の指示に従って調整が必要になる場合があります。
  3. 細胞に5μLのDNA/リポフェクタミン溶液を加えます。37°Cで4時間培養し、湿度の高い環境で5%のCO2 を補給します。
  4. 培地は予温された完全成長培地に置き換えてください。湿度の高い環境で37°Cで8時間>8時間、5%CO2 を補足してタンパク質発現を検出できるようにします。
  5. 蛍光顕微鏡やイメージャーを用いて細胞の蛍光発現レベルを評価します。トランスフェクション効率は≥30%が推奨されます。蛍光発現レベルが最適でない場合は、製造者のガイドラインに従ってDNAとリポフェクタミンの比率を最適化してください。
    注意:一時的に発現する細胞は、トランスフェクション後24〜48時間以内に抗体検証に使用すべきです。
  6. セルを修正するには、手順1.2.8-1.2.13に従ってください。
  7. 固定サンプルは5 mMアジドナトリウムを含む200 μLのDPBSに保存し、イメージング準備が整うまで保存します。サンプルは4°Cで最大1か月間保存可能です。
    注意:アジドナトリウムは非常に有毒で、摂取すると致命的になる可能性があります。この試薬を扱う際は適切なPPEを着用してください。皮膚が触れた場合は、すぐに石鹸と水で患部をしっかり洗ってください。試薬は使用者の所属機関のガイドラインおよびすべての適用される地方、州、連邦の規制に従って処分してください。
  8. 2.1-2.12の手順に従って顕微鏡をセットアップし、サンプルをマウントしてください。蛍光信号を使って目的のタンパク質を発現する細胞を特定します。
  9. 参考までに、セルのTIRF画像をキャプチャしてください。mSAL抗体と同じイメージングチャネル内の蛍光タンパク質を使用する場合、その蛍光タンパク質の光漂白を行います。タンパク質を光漂白するには、信号が検出されなくなるまで最大>レーザー出力を10分間使います。
  10. 準備済みイメージングバッファーを井戸に加え、イメージングを開始します。分析は前述の手順(ステップ4)に従って完了します。
  11. mSAL取得前に取得した蛍光タンパク質の再構築画像とTIRF画像の両方を開いてください。回折限定TIRF画像に示された発現タンパク質の外観と局在をmSAL画像と比較して、mSAL抗体結合部位を評価します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

このプロトコルで説明されているmSAL技術は、単一抗体が対応する細胞膜タンパク質標的に結合する事象を可視化し、膜タンパク質分布の超分解能マップを作成します。ここではCD81を代表例として用いていますが、このアプローチは他の膜タンパク質にも容易に適応可能です。

細胞間に十分な間隔を設けてJurkat T細胞を固定することで、抗体やガラス面による膜エピトープへのアクセスを確保し、フィデューシャルが沈殿しやすくなります(図1A)。さらに、ピペッティング技術は繊細な膜構造の保存に直接影響を与えることがあります。したがって、溶液交換の際にはピペットを優しく使うことが推奨されます。サンプルチャンバーを角度をつけて溶液を井戸の隅にピペットで固定することで、溶液の流れが細胞を動かし繊細な膜構造を破壊するのを防ぐことができます(図1B)。

金コロイドは、画像再...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

細胞膜タンパク質の組織化は細胞機能の調節に重要な役割を果たします。従来の蛍光顕微鏡技術は回折限界によって制限されており、ナノスケールの組織を覆い隠しています。SMLMはこの制約を克服し、10〜20 nm47の空間分解能を実現し、ナノスケールアセンブリ10、48、49の特性評価を可能にしています。SMLMにおけるクラスタリングアーティファクトは、同じ蛍光分子50が繰り返し検出されることから生じ、これがタンパク質クラスターの外観を与えることがあります。単一分子検出は蛍光素の光入れ特性に依存しているため、局所的なエピトープ濃度51,52,53,54,55を完全に

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

すべての著者は、開示すべき利益相反がないと宣言します。

謝辞

本出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立一般医学科学研究所(Award Number No.R35GM146786)およびイリノイ大学シカゴ校リベラルアーツ・サイエンス学部の支援を受けています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を代表するものではありません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗CD81 Alexa fluor 488抗体サーモフィッシャー・サイエンティフィックMA5-44132画像検査抗体
ベンチトップ遠心分離機エッペンドルフ5424
牛血清アルブミンミリポーアシグマA7906-100G
チャンバー付きカバーガラス、8ウェルセルヴィスC8-1-N
DMEMメディアサーモフィッシャー・サイエンティフィック11960069
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水サーモフィッシャー・サイエンティフィック14190-144
胎児用牛血清ミリポーアシグマF0926-500ML
グルターアルデヒド、10%電子顕微鏡科学16120
金コロイド、100nmテッド・ペラ15711年以降;20受託マーカー
浸漬油 カーギル研究所16245
逆立顕微鏡 TIRFモジュールを装備ニコン・インストゥルメンツエクリプス Ti2-E顕微鏡
ジュルカット E6.1 細胞株ミリポーアシグマ88042803-1VLサスペンションセル
レーザーローンチ、6ラインオクシウスL6CC-CS8-1511励起レーザー
リポフェクタミン 2000サーモフィッシャー・サイエンティフィック11668019トランスフェクション試薬
マイクロ遠心分離機チューブ、1.5 mL VWR89000-028
顕微鏡イメージングソフトウェアニコン・インストゥルメンツNIS-エレメンツ先端研究画像取得ソフトウェア
目的値、100倍/1.49 CFI APO TIRF ニコン・インストゥルメンツMRD01991顕微鏡対物レンズ
パラホルマルデヒド、16%電子顕微鏡科学15710
ペニシリン・ストレプトマイシンサーモフィッシャー・サイエンティフィック15140-122抗生物質
ポリL-リジン溶液、0.01% ミリポーアシグマP4707-50ML
プライム95B sCMOSカメラテレダイン・ビジョン・ソリューションズ01-プライム-95B-R-M-16-Cカメラ
RPMI 1640メディアサーモフィッシャー・サイエンティフィック11875-093懸濁セル用媒体
アジ化ナトリウムサーモフィッシャー・サイエンティフィック19038-1000
ホウ水素化ナトリウムミリポーアシグマ213462-25G
T25培養フラスコサーモフィッシャー・サイエンティフィック169900
テトラスペック微小球受託マーカー
組織培養皿、100mm コーニング353003
U2OS細胞株ATCCHTB-96粘着細胞

参考文献

  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulation of membrane protein structure and function by their paralipidomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (2), 107(2022).
  3. Stephens, A. D., Wilkinson, T. Discovery of Therapeutic Antibodies Targeting Complex Multi-Spanning Membrane Proteins. Biodrugs. 38 (6), 769(2024).
  4. Chan, A. C., Martyn, G. D., Carter, P. J. Fifty years of monoclonals: the past, present and future of antibody therapeutics. Nat Rev Immunol. 25, 745-765 (2025).
  5. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  6. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  7. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  8. Tobin, S. J., et al. Single molecule localization microscopy coupled with touch preparation for the quantification of trastuzumab-bound HER2. Sci Rep. 8 (1), 15154(2018).
  9. Wakefield, D. L., et al. Using quantitative single molecule localization microscopy to optimize multivalent HER2-targeting ligands. Front Med. 10, 1064242(2023).
  10. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  11. Lillemeier, B. F., et al. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11 (1), 90-96 (2010).
  12. Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (26), 7201-7206 (2016).
  13. Rossboth, B., et al. TCRs are randomly distributed on the plasma membrane of resting antigen-experienced T cells. Nat Immunol. 19 (8), 821-827 (2018).
  14. Civita, S., et al. Nanoscale engagement of programmed death ligand 1 (PD-L1) in membrane lipid raft domains of cancer cells. FEBS J. 292 (22), 5979-5997 (2025).
  15. Lee, J., Sengupta, P., Brzostowski, J., Lippincott-Schwartz, J., Pierce, S. K. The nanoscale spatial organization of B-cell receptors on immunoglobulin M- and G-expressing human B-cells. Mol Biol Cell. 28 (4), 511(2017).
  16. Ferapontov, A., et al. Antigen footprint governs activation of the B cell receptor. Nat Commun. 14 (1), 976(2023).
  17. Mattila, P. K., et al. The actin and tetraspanin networks organize receptor nanoclusters to regulate B cell receptor-mediated signaling. Immunity. 38 (3), 461-474 (2013).
  18. Nerreter, T., et al. Super-resolution microscopy reveals ultra-low CD19 expression on myeloma cells that triggers elimination by CD19 CAR-T. Nat Commun. 10 (1), 3137(2019).
  19. Slaga, D., et al. Avidity-based binding to HER2 results in selective killing of HER2-overexpressing cells by anti-HER2/CD3. Sci Transl Med. 10 (463), eaat5775(2018).
  20. Haber, L., et al. Generation of T-cell-redirecting bispecific antibodies with differentiated profiles of cytokine release and biodistribution by CD3 affinity tuning. Sci Rep. 11 (1), 14397(2021).
  21. Abdelmotaleb, O., Schneider, A., Gassner, C., Märsch, S., Klein, C. The impact of CD3 affinity-attenuation on T cell engaging bispecific antibodies: is it really that simple. Expert Opin Drug Discov. 20 (8), 943-949 (2025).
  22. Dang, K., et al. Attenuating CD3 affinity in a PSMAxCD3 bispecific antibody enables killing of prostate tumor cells with reduced cytokine release. J Immunother Cancer. 9 (6), e002488(2021).
  23. Gunasekara, H., et al. Superresolution Imaging with Single-Antibody Labeling. Bioconjugate Chem. 34 (5), 825-833 (2023).
  24. Perera, T., Gunasekara, H., Hu, Y. S. Single-Molecule Localization Microscopy Using Time-Lapse Imaging of Single-Antibody Labeling. Curr Protoc. 3 (10), e908(2023).
  25. Küppers, R. CD81 as target for B cell lymphomas. J Exp Med. 216 (7), 1469-1470 (2019).
  26. Vences-Catalán, F., et al. CD81 is a novel immunotherapeutic target for B cell lymphoma. J Exp Med. 216 (7), 1497-1508 (2019).
  27. Vences-Catalán, F., et al. Targeting the tetraspanin CD81 reduces cancer invasion and metastasis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (24), e2018961118(2021).
  28. Bailly, C., Thuru, X. Targeting of Tetraspanin CD81 with Monoclonal Antibodies and Small Molecules to Combat Cancers and Viral Diseases. Cancers. 15 (7), 2186(2023).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  31. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. Image analysis for single-molecule localization microscopy. In: Super-Resolution Imaging in Biomedicine. , 79-94 (2016).
  32. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  33. Stallinga, S., Rieger, B. Accuracy of the Gaussian point spread function model in 2D localization microscopy. Opt Express. 18 (24), 24461-24476 (2010).
  34. Huang, F., Schwartz, S. L., Byars, J. M., Lidke, K. A. Simultaneous multiple-emitter fitting for single molecule super-resolution imaging. Biomed Opt Express. 2 (5), 1377-1393 (2011).
  35. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nat Methods. 7 (5), 373-375 (2010).
  36. Chatterjee, T., et al. Direct Kinetic Fingerprinting and Digital Counting of Single Protein Molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (37), 22815-22822 (2020).
  37. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise. Ester, M., Kriegel, H. P., Sander, J., Xu, X. Int Conf Knowledge Disc Data Mining, 240, 226-231 (1996).
  38. Termini, C. M., Gillette, J. M. Tetraspanins Function as Regulators of Cellular Signaling. Front Cell Dev Biol. 5, 242379(2017).
  39. Levy, S., Shoham, T. Protein-protein interactions in the tetraspanin web. Physiology. 20, 218-224 (2005).
  40. Rubinstein, E., et al. CD9, CD63, CD81, and CD82 are components of a surface tetraspan network connected to HLA-DR and VLA integrins. Eur J Immunol. 26 (11), 2657-2665 (1996).
  41. Schmidt, S. C., Massenberg, A., Homsi, Y., Sons, D., Lang, T. Microscopic clusters feature the composition of biochemical tetraspanin-assemblies and constitute building-blocks of tetraspanin enriched domains. Sci Rep. 14 (1), 2093(2024).
  42. Zuidscherwoude, M., et al. The tetraspanin web revisited by super-resolution microscopy. Sci Rep. 5, 12201(2015).
  43. Comparative performance analysis of K-means and DBSCAN clustering algorithms on various platforms. Shahriar, N., Akib Al Faisal, S. M., Pinjor, M. M., Sharif Zobayer Rafi, M. A., Rahman Sarkar, A. Proceedings of the 22nd International Conference on Computer and Information Technology (ICCIT), , 1-6 (2019).
  44. Hahsler, M., Piekenbrock, M., Doran, D. dbscan: Fast Density-Based Clustering with R. J Stat Softw. 91 (1), 1-30 (2019).
  45. Pedregosa, F., et al. Machine Learning with PyTorch and Scikit-Learn: Develop machine learning and deep learning models with Python. J Mach Learn Res. 12, 2825-2830 (2011).
  46. Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. Non-specific binding of antibodies in immunohistochemistry: fallacies and facts. Sci Rep. 1, 28(2011).
  47. Bond, C., Santiago-Ruiz, A. N., Tang, Q., Lakadamyali, M. Technological advances in super-resolution microscopy to study cellular processes. Mol Cell. 82 (2), 315-332 (2022).
  48. Garcia-Parajo, M. F., Cambi, A., Torreno-Pina, J. A., Thompson, N., Jacobson, K. Nanoclustering as a dominant feature of plasma membrane organization. J Cell Sci. 127 (23), 4995-5005 (2014).
  49. Tan, H. L., Bungert-Plümke, S., Kortzak, D., Fahlke, C., Stölting, G. Determination of oligomeric states of proteins via dual-color colocalization with single molecule localization microscopy. eLife. 11, e76631(2022).
  50. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).
  51. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
  52. Shivanandan, A., Deschout, H., Scarselli, M., Radenovic, A. Challenges in quantitative single molecule localization microscopy. FEBS Lett. 588 (19), 3595-3602 (2014).
  53. Endesfelder, U., Heilemann, M. Art and artifacts in single-molecule localization microscopy: beyond attractive images. Nat Methods. 11 (3), 235-238 (2014).
  54. Lambert, T. J., Waters, J. C. Navigating challenges in the application of superresolution microscopy. J Cell Biol. 216 (1), 53-63 (2017).
  55. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Quantitative photo activated localization microscopy: unraveling the effects of photoblinking. PloS One. 6 (7), e22678(2011).
  56. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  57. Unterauer, E. M., Jungmann, R. Quantitative Imaging With DNA-PAINT for Applications in Synaptic Neuroscience. Front Synaptic Neurosci. 13, 798267(2021).
  58. Stein, J., Stehr, F., Jungmann, R., Schwille, P. Calibration-free counting of low molecular copy numbers in single DNA-PAINT localization clusters. Biophys Rep. 1 (2), 100032(2021).
  59. Youn, Y., et al. Quantitative DNA-PAINT imaging of AMPA receptors in live neurons. Cell Rep Methods. 3 (2), 100408(2023).
  60. Yin, H., Flynn, A. D. Drugging Membrane Protein Interactions. Annu Rev Biomed Eng. 18, 51-76 (2016).
  61. Jin, S., et al. Emerging new therapeutic antibody derivatives for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 39(2022).
  62. To'a Salazar, G., Huang, Z., Zhang, N., Zhang, X. -G., An, Z. Antibody therapies targeting complex membrane proteins. Engineering. 7 (11), 1541-1551 (2021).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

細胞膜超解像顕微鏡法CD81タンパク質密度ベースクラスタリング抗体結合ドリフト補正治療用抗体
膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。