Method Article

膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

DOI:

10.3791/69853

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March 20th, 2026

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1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、細胞膜タンパク質のナノスケール空間的組織を解消するための単一抗体標識(SAL)を記述しています。抗体とエピトープの累積相互作用を単一分子レベルで活用することで、膜SAL(mSAL)は局所的なエピトープ分布をマッピングしつつ、同時にネイティブ細胞環境における抗体結合挙動を捉えます。

Abstract

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細胞膜は細胞の形状を定義し、細胞間のコミュニケーションを支配するインターフェースとして機能します。膜タンパク質は治療標的の主要なクラスを構成しています。したがって、細胞膜を構成タンパク質を通じて超分解することは、細胞生物学および抗体治療の進展に大きな期待を秘めています。この点で、単分子局在顕微鏡(SMLM)は生物構造上のタンパク質組織のナノスケール可視化を可能にします。SMLMの重要性にもかかわらず、細胞膜タンパク質への応用には独自の課題があります。本プロトコルでは、膜SAL(mSAL)と呼ばれるタイムラプス単一抗体標識(SAL)を用いた効果的なアプローチを提案します。抗体濃度、レーザー出力密度、非照射間隔の持続時間、画像再構築、密度ベースのクラスタ解析など、ナノスケールの膜タンパク質分布や膜形態の解明を目的とした詳細な手順を提供します。テトラスパニンタンパク質CD81をモデル膜タンパク質として用いて、mSALが付着細胞および懸濁細胞の両方に作用することを実証します。細胞膜や膜タンパク質の分布を超分解するだけでなく、本技術により、治療用抗体がその膜標的と天然膜環境で相互作用する薬理力学の調査も可能にしています。

Introduction

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細胞膜には、細胞の移動性、接着、感知、細胞間コミュニケーションを調節する多様なタンパク質が含まれています。細胞膜タンパク質のナノスケール分布を理解することは重要であり、タンパク質の機能は発現レベルだけでなく、膜上の空間的配列によっても左右されることが多いからです。特に、多くの治療用抗体は膜タンパク質を標的としており、ナノスケールの研究は、局所的な膜タンパク質の組織によって抗体相互作用がどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。しかし、膜タンパク質分布の正確なマッピング、単一分子による存在比のプロファイリング、結合パートナーとの動的相互作用のリアルタイムモニタリングは依然として困難です。

直接確率的光学再構築顕微鏡(dSTORM)5,6やナノスケール地形画像撮影のためのDNA点蓄積(DNA-PAINT)7など、広く使われている単一分子局在顕微鏡(SMLM)技術は、試料標識に免疫蛍光(IF)....

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Protocol

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このプロトコルは確立されたJurkat E6.1およびU2OS細胞株を使用し、一次ヒトや生きた動物の材料は使用しません。

1. 細胞の種まき/着地および固定

注:サンプル調製は標準的な免疫蛍光(IF)染色プロトコルに従い、異なる細胞型にわたる細胞膜タンパク質の細胞内組織を維持するよう最適化されています。対象の対象に対して確立された免疫染色プロトコルが存在する場合、ユーザーはサンプルブロッキングステップ1.2.14までそのプロトコルに従うことができます。単一抗体標識(SAL)は、蛍光標識抗体が抗原に単一分子レベルで結合する際に累積的に検出されることに依存しています。イメージングバッファーで希釈された蛍光標識抗体が顕微鏡ステージの試料に加えられ、画像取得が進むにつれて蛍光標識が動的に行われます。試料準備段階では蛍光標識は行われません。

  1. 以前に発表されたプロトコル24に記載されたU2OS細胞株などの接着細胞を準備します。
  2. セル懸濁液
    1. ジュルカットT細胞を、10 mLの完全なRPMI培地(RPMI 1640に10%(v/v)胎児用牛血清、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLのストレプトマイシンを補給)を、加湿インキュベーターに5%C....

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Results

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このプロトコルで説明されているmSAL技術は、単一抗体が対応する細胞膜タンパク質標的に結合する事象を可視化し、膜タンパク質分布の超分解能マップを作成します。ここではCD81を代表例として用いていますが、このアプローチは他の膜タンパク質にも容易に適応可能です。

細胞間に十分な間隔を設けてJurkat T細胞を固定することで、抗体やガラス面による膜エピトープへのアクセスを確保し、フィデューシャルが沈殿しやすくなります(図1A)。さらに、ピペッティング技術は繊細な膜構造の保存に直接影響を与えることがあります。したがって、溶液交換の際にはピペットを優しく使うことが推奨されます。サンプルチャンバーを角度をつけて溶液を井戸の隅にピペットで固定することで、溶液の流れが細胞を動かし繊細な膜構造を破壊するのを防ぐことができます(図1B)。

金コロイドは、画像再.......

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Discussion

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細胞膜タンパク質の組織化は細胞機能の調節に重要な役割を果たします。従来の蛍光顕微鏡技術は回折限界によって制限されており、ナノスケールの組織を覆い隠しています。SMLMはこの制約を克服し、10〜20 nm47の空間分解能を実現し、ナノスケールアセンブリ10、48、49の特性評価を可能にしています。SMLMにおけるクラスタリングアーティファクトは、同じ蛍光分子50が繰り返し検出されることから生じ、これがタンパク質クラスターの外観を与えることがあります。単一分子検出は蛍光素の光入れ特性に依存しているため、局所的なエピトープ濃度51,52,53,54,55を完全に

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Disclosures

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すべての著者は、開示すべき利益相反がないと宣言します。

Acknowledgements

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本出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立一般医学科学研究所(Award Number No.R35GM146786)およびイリノイ大学シカゴ校リベラルアーツ・サイエンス学部の支援を受けています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を代表するものではありません。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
抗CD81 Alexa fluor 488抗体サーモフィッシャー・サイエンティフィックMA5-44132画像検査抗体
ベンチトップ遠心分離機エッペンドルフ5424
牛血清アルブミンミリポーアシグマA7906-100G
チャンバー付きカバーガラス、8ウェルセルヴィスC8-1-N
DMEMメディアサーモフィッシャー・サイエンティフィック11960069
ダルベッコのリン酸塩緩衝塩水サーモフィッシャー・サイエンティフィック14190-144
胎児用牛血清ミリポーアシグマF0926-500ML
グルターアルデヒド、10%電子顕微鏡科学16120
金コロイド、100nmテッド・ペラ15711年以降;20受託マーカー
浸漬油 カーギル研究所16245
逆立顕微鏡 TIRFモジュールを装備ニコン・インストゥルメンツエクリプス Ti2-E顕微鏡
ジュルカット E6.1 細胞株ミリポーアシグマ88042803-1VLサスペンションセル
レーザーローンチ、6ラインオクシウスL6CC-CS8-1511励起レーザー
リポフェクタミン 2000サーモフィッシャー・サイエンティフィック11668019トランスフェクション試薬
マイクロ遠心分離機チューブ、1.5 mL VWR89000-028
顕微鏡イメージングソフトウェアニコン・インストゥルメンツNIS-エレメンツ先端研究画像取得ソフトウェア
目的値、100倍/1.49 CFI APO TIRF ニコン・インストゥルメンツMRD01991顕微鏡対物レンズ
パラホルマルデヒド、16%電子顕微鏡科学15710
ペニシリン・ストレプトマイシンサーモフィッシャー・サイエンティフィック15140-122抗生物質
ポリL-リジン溶液、0.01% ミリポーアシグマP4707-50ML
プライム95B sCMOSカメラテレダイン・ビジョン・ソリューションズ01-プライム-95B-R-M-16-Cカメラ
RPMI 1640メディアサーモフィッシャー・サイエンティフィック11875-093懸濁セル用媒体
アジ化ナトリウムサーモフィッシャー・サイエンティフィック19038-1000
ホウ水素化ナトリウムミリポーアシグマ213462-25G
T25培養フラスコサーモフィッシャー・サイエンティフィック169900
テトラスペック微小球受託マーカー
組織培養皿、100mm コーニング353003
U2OS細胞株ATCCHTB-96粘着細胞

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zulueta Diaz, Y., de las, M., Arnspang, E. C. Super-resolution microscopy to study membrane nanodomains and transport mechanisms in the plasma membrane. Front Mol Biosci. 11, 1455153(2024).
  2. Levental, I., Lyman, E. Regulatio....

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