方法論記事

部分的な頸動脈結紮とPCSK9の過剰発現の両方によって誘導されるマウスの動脈硬化モデル

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DOI：

10.3791/69862

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2026年2月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 2State Key Laboratory of Complex, Severe, and Rare Diseases, Department of Pathophysiology, Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Qinghai Cardio-Cerebrovascular Specialty Hospital, Qinghai High Altitude Medical Research Institute, 4Research Center of High Altitude Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

再現可能なマウスモデルは、 PCSK9 腺関連ウイルス(PCSK9-AAV)-高脂肪食性高コレステロール血症と部分左頸動脈結紮(PCL)を組み合わせることで頸動脈動脈硬化を誘発し、人間の病態生理を再現します。これにより、ゲノム編集なしで野生型マウスにおけるヒト様頸動脈硬化病変の迅速な誘導が可能となり、頸動脈硬化研究を促進する標準化されたツールを提供します。

要約

野生型マウスにおける迅速かつ再現可能な頸動脈特異的動脈硬化モデルの欠如は、プラーク生物学や治療法の翻訳研究を制限しています。本プロトコルは、アテノ関連ウイルス(AAV)介在の PCSK9 過剰発現、アテローゲン性高脂肪食、左頸動脈部分結紮(PCL)を組み合わせることで、C57BL/6マウスにおいて再現可能な頸動脈硬化を誘導する、ゲノム編集を経ていない時間効率の良い方法を記述しています。目的は、遺伝子組換え動物を必要とせずに、ヒト頸動脈疾患の主要な病態生理的特徴である高脂血症と異常流を再現する標準化されたワークフローを提供することです。方法には PCSK9-AAVの投与量と投与、術前準備、左頸動脈の段階的な外科的結紮、術後ケア、食事療法、組織採取、Oil Red OおよびVerhoeff-Van Gieson染色を含む組織学的評価が含まれます。結果は、比較値と比較して循環中のコレステロールおよび低密度リポタンパク質のレベルが上昇していることを示しています。左結紮頸動脈には顕著な動脈硬化性プラークが発達し、右非結紮対照動脈に比べて脂質蓄積が有意に増加し、動脈内膜媒質の著しい肥厚が見られます。この標準化されたプロトコルは、頸動脈プラークの形成、進行、介入戦略を研究する研究者の再現性とアクセス性を向上させ、実験的治療の実験室間比較を促進します。

概要

心血管疾患(CVD)は依然として世界の死亡原因の主要な原因であり、動脈硬化がその共通の病理的基盤となっています1。頸動脈は動脈硬化病変の重要な部位であり、頸動脈動脈硬化の研究は、心血管疾患の病因性を理解し治療戦略を策定するために不可欠です。動物モデルは 生体内 動脈硬化研究に不可欠なツールですが、既存のモデルは利便性や人間の病態生理的特徴の再現能力に限界があることが多いです。

他の動脈部位(例:大動脈、大腿動脈)での動脈硬化と比較して、頸動脈硬化の形成は血行動態により強く影響を受けます。頸動脈は高いせん断応力(10-15 dyn/cm²、ダイネ数/平方センチメートル)を受け、冠動脈(6-45 dyn/cm²)に次いで2番目に大きい3。特に頸動脈の分岐部では渦流が発生し、これは乱れた振動的せん断応力を特徴とします。この異常な血行動態環境は、局所内皮細胞の持続的な炎症促進活性化を引き起こし、単球の募集を促進して動脈硬化の開始を促進する癒着分子やケモカインの発現が上方に起こることが特徴です。3。さらに、高リスクのヒト頸動脈動脈硬化病変では、狭窄度が70%を超えることが多く、これはプラークによる腔道径の減少率を指します。したがって、重度の動脈硬化性狭窄症を誘発できる動物モデルは重要です。

部分頸動脈結紮(PCL)モデルは、持続的な血流障害によって誘発される動脈硬化モデルであり、モデル化時間が短く重篤な病変が起こるという利点があります5。アポリポプロテインE(ApoE)は、循環中のコレステロールおよびトリグリセリド豊富なリポタンパク質の代謝とクリアランスに関与する重要なタンパク質であり、血漿脂質恒常性の維持に重要な役割を果たします。しかし、ApoEノックアウト(ApoE⁻/⁻)マウスを用いた従来のPCLモデルは、5台を作るのに難しくコストもかかります。ターゲット遺伝子ノックアウトが必要な場合、ターゲット遺伝子とApoE遺伝子の両方の二重遺伝子ノックアウトが必要となり、モデリングプロセスがさらに複雑になります。対照的に、PCLに野生型C57BL/6マウスのみを使用した場合、このモデルはヒト動脈硬化の中核リスク因子である高コレステロール血症を欠き、顕著な脂質豊富な動脈硬化病変を形成することは稀です6,7。ApoE⁻/⁻やLDLRノックアウト(LDLRノックアウト、LDLR⁻/⁻)マウスに高脂肪食(HFD)を与えたモデルは、動脈硬化の大動脈硬化研究で広く用いられています。しかしながら、これらのモデルは血流の乱れの影響を組み込んでおらず、短期間で重篤な動脈硬化を形成することはできません。過去の研究では、HFDを3か月間摂食した後、ApoE⁻/⁻またはLDLR⁻/⁻マウスは大動脈または頭腕動脈領域に軽度の動脈硬化性プラークしか形成せず、頸動脈には明らかなプラーク病変が形成されないことが示されています。

プロプロテイン変換酵素サブティリシン/ケキシンタイプ9(PCSK9)は、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)代謝の重要な調節因子であり、LDL受容体の分解を促進し、血清LDL-Cレベルを増加させます。PCSK9を発現する組換えアデノ関連ウイルス(PCSK9-AAV)は、遺伝子改変を必要とせずにWTマウスで用量制御可能な高コレステロール血症を可能にします11。PCSK9-AAVによる高コレステロール血症、脂質代謝障害をさらに悪化させるHFD、局所血行動態障害を引き起こすPCLを組み合わせることで、ヒト動脈硬化の2つの主要なリスク要因である高コレステロール血症と血流障害を組み込んだ動物モデルを構築することができます。

先行研究の進展12を基に、本プロトコルはC57BL/6マウスにおける頸動脈動脈硬化の誘導方法を標準化した方法を確立します。既存のモデルプロトコルと比較して、3つの主要な利点があります。(1) 病態生理学的関連性:高コレステロール血症と血流障害を同時に再現し、中後期のヒト動脈硬化に似た特徴を示す頸動脈病変を生じさせること。(2) 再現性:AAV用量、手術的手技、食事管理の詳細なパラメータ化により、検査室間の変動性が低減されます。(3) タイムリー:モデリング期間は5週間で、モデル確立にかかる時間を大幅に短縮します。

このプロトコルは、血管壁生物学の研究、抗動脈硬化薬の有効性評価、動脈硬化における血行動態と脂質代謝の相互作用の探求に適しています。特筆すべきは、このプロトコルが頸動脈に焦点を当てたモデルであり、喫煙、糖尿病、高血圧、肥満などを含む全身的なヒトリスク要因の全てを完全に再現することはできません。以下はモデル確立および病変評価のためのステップバイステップガイドです。

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プロトコル

すべての処置は北京協和医科大学動物実験倫理委員会の動物倫理委員会(ACUC-A02-2024-006)によって承認され、実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠しています。

1. 実験動物の調製

  1. 6〜8週齢のオスC57BL/6匹マウス(体重:22〜25g)を購入してください。
  2. 特定の病原体フリー(SPF)環境で、厳格に管理された条件下で飼育します:温度(23 ± 1°C)、湿度(50 ± 5%)、12時間の明暗サイクル(照明:07:00〜19:00)。
  3. 実験前に、マウスに標準的なチャウ飼料(脂肪エネルギー比10%)と無菌水を提供し、1週間の順応期間を設けます。

2. PCSK9 -AAVの準備と実施

注意:AAVを生物安全の危険として扱い、すべての手順は適切な機関のバイオセーフティレベル(通常はBSL-2)で実施してください。二重手袋、目保護、防護服を着用してください。取り扱い中のエアロゾル発生は避けてください。AAV汚染物質は適切な消毒剤(例:10%漂白剤)で除染し、明確に定義された責任およびインシデント対応プロトコルを遵守してください。すべてのウイルス汚染廃棄物は、塩素含有消毒剤に浸して不活化しなければなりません。

  1. 組換え PCSK9-AAV(rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9)を購入してください。
  2. CMVプロモーターを標的とした定量的リアルタイムPCRでAAV抗体価を検証し、最終的な抗体価は6.10×¹³ vg/mL(ベクターゲノム数/ミリリットル)でした。AAVは-80°Cで保存し、冷凍解凍サイクル(≤3回)を繰り返さないようにしてください。
  3. AAVを氷で15〜20分解凍し、その後遠心分離機チューブを3〜5回優しく反転させて混ざらせます(渦巻きを避けるため)。
  4. PCSK9-AAVを滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈し、最終濃度2×10¹¹ vg/200 μL/マウスごとに増やします。
  5. 尾部静脈注射による投与(点外):静脈可視化マウスの尾部注射ホルダーでマウスを固定し、インスリン注射器で希釈したAAV200μLをゆっくりと注射します(注射速度:10 μL/s)。注射の時期はPCLの1週間前です(図1A)。

3. 部分的な頸動脈結紮のための術前準備

注意:トリブロモエタノールは過剰摂取のリスクがある管理試薬です。体重に応じた厳格な投与、繰り返しの注射を避け、投与時間と量を正確に記録してください。施錠された容器に保管し、準備と使用は訓練を受けたスタッフのみが行うようにしてください。過剰摂取が疑われた場合は緊急対応を開始し、事故の記録を行ってください。

  1. トリブロモエタノール(2.5% Avertin、0.18 mL/10 g)を腹膜内注射(ip)でマウスに麻酔し、右立反射が失われるまで(約2〜3分)投与します。その後、マウスを温熱パッド(37 ± 0.5°C)に移します。つま先をつまんで麻酔効果を確認しましょう。
    注:手術成功には麻酔が不可欠です。麻酔リスクを最小限に抑えるために、複数回の麻酔注射は避けるべきです。手術開始前に、麻酔用量は予想される手術期間に基づいて決定されるべきです。さらに、長期手術のリスクを軽減するため、各マウスの手術期間は<30分が推奨されています。
  2. 手術中は、5分ごとに鉗子で後足の肉球を優しくつまんで、マウスの呼吸数(正常:40〜60回/分)と足底反射をチェックします。
  3. マウスの頸部前方皮膚に脱毛クリームをしっかり塗布してください。2〜3分後に綿棒で前方の頸部の毛を除去し、残留毛は生理食塩水で洗浄します。露出した皮膚を5%ポビドンヨウ素で3回消毒します。
  4. 無菌マウスの部屋にあるバイオセーフティキャビネットで手術を行います。手術室は紫外線で消毒し、無菌を維持し、すべての金属器具はオートクレーブ消毒してください。
    注:無菌環境と徹底的な消毒は、術後の生存とマウスの生理的安定性を確保するために不可欠です。

4. 部分頸動脈結紮術 - 外科的手技

  1. 滅菌外科用ハサミを使ってマウスの首に約1.0〜1.5cmの中央切開を行います。鈍器鉗子で皮下組織と胸鎖乳突筋を分離し、左総頸動脈(LCCA)を露出させます。
    注意:手術部位は温めた生理食塩水で継続的に湿らせ、血管や組織の乾燥によるさらなる外傷を防ぐ必要があります。
  2. 迷走神経を損傷し(呼吸抑制を引き起こす可能性がある)、LCCAを迷走神経(動脈の隣接)から鈍く分離します。
  3. LCCAに沿って上方に切り離し、内頸動脈(ICA)、外頸動脈(ECA)、後頭動脈(OA)、上甲状腺動脈(STA)を露出させます(図1B)。
  4. STA上の左外頸動脈を結紮するために6-0無菌シルク縫合糸を使用します。その後、別の6-0無菌シルク縫合糸を使ってICAとOAの根を同時に結紮します。
    注意:神経や周囲の組織の結紮は避けてください。ECA/ICA/OAのシャントフローを完全に遮断しつつ、LCCAの逆行性出血は一定程度保持します。結紮効果は出血・血流の状態および遠位動脈脈動を観察して評価します。
  5. 手術部位の出血を確認しましょう。出血がある場合は、滅菌綿棒で30〜60秒ほど優しく押さえて止血効果を得ます。皮膚は組織接着剤や外科用縫合糸で縫合します。
    注意:過剰な組織接着剤が皮下組織に浸透しないように注意してください。

5. 部分的頸動脈結紮後のケアおよび高脂肪食介入

  1. 術後、腹腔内注射で温かい生理食塩水0.5mLを投与し、輸液を行います。
  2. 手術直後および術後12時間以内にメロキシカム(0.1 mg/kg)を皮下注射して痛みを和らげます。
  3. マウスを加熱されたリカバリーケージ(37°C)に入れ、右回り反射が回復するまで(約15〜30分)過ごします。手術後24時間以内にマウスの異常行動(例:無気力、呼吸困難)を監視してください。
  4. 獣医師の指示に従い、術後7日間は抗生物質を含む飲料水など、抗生物質を含む抗生物質を手術後に提供してください。
  5. 西洋式HFD(脂肪エネルギー比40%、コレステロール含有量1.25%)を、病変評価(術後4週間)まで与えています。
    注意:HFDは脂肪酸化を防ぐために4°Cで保存し、開封後2週間以内に使用してください。新鮮さを確保するためにHFDは2日ごとに交換し、マウスの食事摂取量を毎日監視してください(通常の食事量:1匹あたり約4〜5g)。HFD摂食と PCSK9-AAV誘発性高コレステロール血症を同期させることで、頸動脈内の脂質沈着が最大化されます。HFDの開始を遅らせることで病変の重症度が軽減されます。

6. サンプル採取と処理

注意:パラホルマルデヒドは有毒な蒸気を放出します。準備、使用、除去は化学煙幕の中で、適切なPPE(手袋、安全ゴーグル、白衣)を着用した状態で行う必要があります。廃棄物は確立された中和および化学廃棄物収集手順に従って処理します。固定剤は中和され、機関の液体廃棄物処理プロトコルに従って中央集体で回収されるべきです。

注:本研究におけるヒト頸動脈動脈硬化標本は、頸動脈狭窄症患者で頸動脈内膜摘出術を受けた患者から採取されました。本研究はヘルシンキ宣言に準拠しており、北京協和医科大学病院(PUMCH)の倫理審査委員会(No.JS-2966)。すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

  1. 術後4週間で、トリブロモエタノール腹腔内注射でマウスを麻酔します。
  2. 麻酔マウスに両側開胸術を行い、心臓を穿刺して血中脂質検査のための血液サンプルを採取します。その後、左心室に20 mLの氷冷PBSを灌流し、3〜6 mL/分で血管内の残留血液を洗い流します。組織の色の変化を灌流完了の視覚的指標として観察してください。
    注:施設の倫理や規則で許可されている場合、地域の施設動物ケア・利用委員会(IACUC)の要件に準拠し明確に実施される場合、代替方法を使用することが可能です。動物の死骸は、生物廃棄物規制に従い、機関の獣医チームまたは認可された業者によって焼却されるか、承認されたバイオハザード処理手順で処理されなければなりません。
  3. 心臓とともに頸動脈を解離・採取し、顕微鏡で両側頸動脈を分離し、4%パラホルマルデヒド(PFA)で4°Cで24時間固定します。
  4. 固定された頸動脈を30%ショ糖溶液(PBSに溶けたもの)に移し、4°Cで24時間(組織が沈むまで)培養します。動脈を最適切断温度(OCT)化合物に埋め込み、-80°Cで保存します。
  5. クライオスタットを使って左総頸動脈の厚さ5μmの断面を切断します(切断位置:結紮部位の近位1mm;切断温度:-20°C ~ -22°C、組織水分量に基づいて微調整)。事前に冷やしておいた細かいブラシを使い、その部分をクライオスタットのアンチロールプレートに優しく移し、平らに保ちます。ポリLリジンコーティングされたスライドをほぼ垂直の角度で持ち、ゆっくりと切断面に接触させます。
    注:灌流のステップは残留血液を除去するために非常に重要です。そうしないと病変の着色に干渉します。組織の形態を保存するため、安楽死後30分以内に動脈を完全に固定すること。

7. 動脈硬化病変評価 1 - オイルレッドO染色

  1. セクションを室温(20〜25°C)で30分間自然乾燥させます。60%イソプロパノールに1分間浸け、その後、オイルレッドO作業液(60%イソプロパノールで3:2で希釈)を室温(20-25°C)で10分間培養します。
  2. スライドを60%イソプロパノールに室温で完全に浸し、5〜10秒ほど優しく攪拌して未結合染料を除去することで差別化します。ヘマトキシリンで30秒染色;水道水で5秒ほどすすいで(細胞核を青くします)。
  3. スライドスキャナーや光学顕微鏡(5倍、10倍、20倍の拡大)で断面画像を撮影;ImageJソフトウェア(バージョン1.54p)を使って脂質沈着面積を定量的に分析し、オイルレッドO陽性面積の内膜面積に対する割合を計算します。
  4. 画像Jの定量化手法
    1. 画像を開いてみて;手動 選択 ツールを選択して、intima-media領域を手動で輪郭を描きます。 ROIマネージャー>分析>ツール にアクセスし、「 追加」をクリックしてください。
    2. 画像> 色の閾>値を調整する;色相と明るさのパラメータをオイルレッドのOポジティブ領域に合わせて調整してください。選択をクリックし、次にROIマネージャーに追加します。
    3. 内層メディアROIと染色されたROIの両方を選択し、 AND をクリックすると内層メディア領域内のオイルレッドO陽性領域が得られます。
    4. 追加して測定をクリックして、内膜メディアとオイルレッドO陽性領域の面積を計算してください。
    5. 計算式:
      オイルレッドO面積(%) = (オイルレッドO_positive_area / intimal_media_area) × 100

8. 動脈硬化病変評価2 - ヴェルホエフのヴァン・ギーソン染色

  1. スライド上のOCT化合物埋め込みの凍結断片を回収します。
  2. スライドを室温(20〜25°C)の蒸留水に10〜15分間浸し、2〜3回軽く攪拌してOCT化合物を完全に溶かします。
  3. OCT化合物を含む水は捨て、残留OCT化合物を除去するために新鮮な蒸留水で2分間洗浄します。
  4. 切片をベアホエフ染色(ヘマトキシリン、ヨウ素、塩化鉄を含む)で室温(20-25°C)で15分間培養し、培養中にスライドラックを2〜3回優しく振って均一な染色を確保します。
  5. 蒸留水で素早く2回、10秒ずつすすいでください。
  6. 2%の塩化鉄溶液で30〜60秒分化します。顕微鏡で観察し、弾性繊維が青黒色になり背景が灰色になるまで観察します。蒸留水で2回、各1分ずつすすぎます。
  7. 残留ヨウ素を除去するために、5%チオ硫酸ナトリウム溶液で1〜2分間切片を処理します。
  8. 蒸留水で2分間すすぐ後、Van Giesonステイン(酸性フクシン+ピクル酸)でカウンターステインを5分かけて、コラーゲン繊維を鮮やかな赤色に染めます。
  9. 95%エタノール(2回、各1分)と100%エタノール(2回、各1分)で順次脱水します。キシレンに5分間透明化;セクションは合成樹脂の取り付け媒体でカバースリップされました。
  10. 断面画像を撮影;デジタル画像解析ソフトウェアを使って、長さ測定ツールを使ってプラークの内膜厚または内膜厚(前方、後方、左側、右側)を測定し、平均値を計算します。
    1. スライドを開き、ターゲット容器の断面にズームし、 測定ツールをクリックしてください。
    2. 内膜の内側と内側の外縁を前、後、左、右の方向に順にクリックし、4つの厚さ値を記録します。
    3. 平均値を計算し、測定値を記録します。
      平均値 = (前方 + 後方 + 左 + 右) ÷ 4

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結果

Oil Red O染色の結果、結紮された動脈は重度の動脈硬化性プラーク形成、明らかな脂質コア、壊死領域を示しました。脂質領域の割合は左頸動脈で右頸動脈対照部よりも有意に高かった(p < 0.001)(図2A)。VVG染色により、内膜の弾性繊維の破壊または消失、プラーク内膜の著しい厚化が明らかになりました。左頸動脈では、腸膜-中隔層厚(IMT)および内膜厚(IT)が右頸動脈対照部と比較して有意に増加しました(p < 0.001)(図2B)。これらの発見は、PCL+PCSK9 AAV+HFDモデル(図2A、 2B RCA群)が、ヒト頸動脈(図2C)に見られる中等度から進行期の重度動脈硬化性プラークを誘導し、同様の脂質コアや壊死領域の形成を促すことを示しています。脂質分析では総コレステロー...

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ディスカッション

本プロトコルは、 PCSK9-AAV誘発性高コレステロール血症、高脂肪食(HFD)、および総頸動脈部分結紮(PCL)を組み合わせて、C57BL/6マウスにおける頸動脈動脈硬化モデルを標準化する方法を説明しています。

従来のモデルであるApoE -/-やLDLR-/-モデル、WT マウス5を用いたPCLモデルと比較して、このモデルは動脈硬化研究において独自の利点を提供します。まず、マウスにPCSK9-AAVを投与しHFDを与えて高コレステロール血症を誘発し、PCLは頸動脈の血流を乱すために行われます。これらはヒト頸動脈動脈硬化の最も重要な2つのリスク要因です。病変は初期の脂質沈着から中等度の内膜肥厚へと進行し、マクロファージ浸潤と脂質の大量沈着を伴う。これはヒト病変の進行と非常に類似している。第二に、PCSK9-AAVは遺伝子改変なしで高コレステロール血症(12週間以上...

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開示事項

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金(82470516、8227022021)、中央大学特別研究基金、北京協和医学院(3332025111)、国家高水準病院臨床研究資金(2025-PUMCH-A-181、2025-PUMCH-D-001)、および四川省自然科学基金(2024NSFC0715)から資金提供を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6-0 滅菌ナイロン縫合糸金環医療F602NA
C57BL/6マウス上海モデル生物センター株式会社(SMOC)SM-001NA
チャウ・デイト謝通略歴いいえ。XT93GNA
クライオスタット ライカ CM1950NA
除毛クリームヴェートRBヘルスLLCNA
高脂肪食謝通略歴XT108cNA
OCTさくら4582NA
オイルレッドO溶液ServiceBio G1017-100mLNA
光学顕微鏡ライカDM4BNA
パラホルムアルデヒド Servicebio G1101-500mLNA
PCSK9-AAVWZBioscience AV208001-AV8NA
ポリLリジンコーティングスライドシグマP0425NA
スライドスキャナー3DHISTECHパノラミックスキャンNA
スルファメトキサゾールセレックS1915 NA
組織接着剤3Mベットボンド1469SBNA
静脈可視化マウスの尾注射ホルダー 濟南一言科学・発展テクノロジー開発株式会社YLS-Q9GNA

参考文献

  1. Vaduganathan, M., Mensah, G. A., Turco, J. V., Fuster, V., Roth, G. A. The global burden of cardiovascular diseases and risk: A compass for future health. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2361-2371 (2022).
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PCSK9 C57BL 6 O

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