皮膚再生研究のための効率的なマウス組織拡張モデルの開発

サマリー

本研究は、ラットにおける連続的な組織拡大モデルを確立するための実用的かつ効率的なプロトコルを提示し、皮膚再生のメカニズム調査と技術の発展を促進します。

要約

皮膚再生は様々な浅い傷の治癒に不可欠であり、機械的刺激によって促進されます。組織拡張は、制御された機械的伸縮によって皮膚再生を促進する広く使われている戦略です。しかし、その臨床的有効性はしばしば機械的負荷と皮膚の再生能力の不一致によって制限されます。この制約に対処するために、組織拡大の標準化された動物モデルの開発が緊急に求められています。本研究では、スプラグ・ドーリーラットにおける組織拡張モデルを確立しました。10 mLの組織拡張器を背側に埋め込みた後、手術直後に5 mLの生理食塩水が注射されました。2週間の回復期間の後、動物たちは週2回の生理食塩水注射(1回あたり10 mL)の投与を受けました。膨張速度論は、急速な皮膚成長の後、徐々に減速する特徴的な傾向を示しました。後期段階では、皮膚壊死、組織の劣化、拡張器の曝露などの重篤な合併症が観察されました。この研究は、ヒト組織の拡大の生理学的および病理学的プロセスを密接に模倣した再現可能な前臨床的枠組みを確立し、再生メカニズムの調査と臨床プロトコルの最適化のための基礎モデルを提供します。

概要

皮膚は体の第一防衛線として機能し、機械的な保護を提供し水分の流出を防ぐだけでなく、体温調節、外部刺激への反応、免疫調節にも重要な役割を果たし^ます。皮膚傷は臨床現場でよく見られ、外傷、微生物感染、化学的損傷、外科^的切除2によって引き起こされます。小さな傷は普通に治ることもありますが、大きな傷は一般的に重度の線維化性瘢痕を残し、組織の機能を損なうもので、生命を脅かすことさえ^{あります3。}自己同胞全層皮膚移植は、大きな傷の管理と瘢痕防止のゴールドスタンダードと広く考え^{られています。}しかし、十分な粘着性皮膚を獲得することは依然として重要な臨床課題です。その結果、革新的な皮膚再生技術の開発が再生医療および^{バイオマテ}リアルの分野で中心的な焦点となっています。

ノイマンが1957年に耳の変形を再構築するために耳の変形を復元するために、耳の後乳様突起領域にポリエチレンバルーンを挿入することで組織拡張の原理を初めて^{導入して以来}、この技術は大きく進化してきました。現在では再建手術で最も広く採用されている方法の一つであり、広範な皮膚欠損に対処するための重要なアプローチとして依然として重要です。具体的には、組織拡張は隣接する皮膚を動員し再生を刺激することで追加の自家組織を生成します⁷。機械的刺激により、新たに形成された皮膚は外観と構造の両面でネイティブスキンに非常に似ており、^{臨床応用に}理想的です8。しかし、後期段階の皮膚の成長速度と荷重力の大きさの不一致により、採取された皮膚の量は大規模な創傷被覆には不十分であることが判^{明しました。}さらに、組織拡張技術の進歩は、最適でない拡張効果、重篤な合併症、不完全な定量的評価指標、そして不十分な分子メカニズムによって妨げられています¹⁰。in vivoでの調節ネットワークの複雑さを考えると、適切な動物モデルによる組織拡張は、皮膚組織の機械的刺激に対する生理学的および病理学的応答を忠実に再現するために不可欠です。

現在、生体内研究ではマウス(マウスおよびラット)および豚モデルが主な選択肢となっています¹¹。マウスの背側または頭皮拡張モデルは操作が容易なため広く使われています。しかし、皮膚が薄すぎて長期的または連続的な膨張に耐えられません¹²。ラットの背側拡張モデルは、その広範な皮下空間により連続的拡大に適していますが、拡張を終える決定的なプロトコルが存在しないため臨床的応用は制限されています^13,14。豚の皮膚は人間の皮膚と最も高い相同性を持っていますが、弾力性が低いため機械的伸縮への反応が遅れ、プロセス中に深い鎮静が必要になるため、実験的な操作はかなり困難^{になります。}したがって、臨床プロセスを模倣した適切な連続的拡大モデルの開発は依然として科学的な課題です。

本研究の目的は、ラットの皮膚連続拡大モデルの開発でした。短時間、Sprague-Dawley(SD)ラットの背側に10 mLのシリコーン拡張器を挿入し、手術直後に5 mLの生理食塩水を注射しました。2週間の回復期間の後、週2回10 mLの生理食塩水を投与し、累計体積が155 mLに達した時点で皮膚生成の有意な減少が観察され、再生能力の枯渇を示唆しました。再生の枯渇は皮膚再生能力の重大な低下を意味し、細胞レベルでは増殖能力の低下と細胞外マトリックスの分解が特徴^です。巨視鏡的には、皮膚質感の著しい劣化として現れ、皮膚の薄さ、虚血、張筋、壊死や^{組織分解へ}進行する可能性があります。技術的に単純であるだけでなく、この前臨床モデルは連続的な皮膚拡大を成功裏に再現し、研究者は特定の研究目的に合わせた異なる拡張段階を調査できます。このモデリング手法は遺伝子組み換えラットにも適用でき、主要な遺伝子機能の解明を促進し、その基礎となるメカニズムの解明につながります。さらに、背側皮膚の十分な表面積により自己制御研究設計が可能となり、同じ動物内で実験的治療と対照治療の両方を適用可能にします¹⁸。このモデルは、組織拡張に関与する特定のメカニズムを調査するための有用なツールを提供し、現在の技術的制約を克服するのに寄与します。

プロトコル

すべての動物処置は上海第九人民病院の倫理委員会(番号:19999年)によって承認されました。SH9H-2025-A1673-1)および国立衛生研究所(NIH)の実験動物ケア・利用ガイドに従って実施されました。

1. 準備

1. 研究の7日前にすべてのSDラットを順応させてください。SDラットを動物施設で飼い、12時間の光と12時間の暗いサイクルがあります。実験 中は 標準的な小麦・大豆ベースの食事と水を自由に提供してください。
2. 実験用に10 mLの半円形組織拡張装置を設計し(図1A)、拡張性バルーン、注射ポート、結合カテーテルを含みます。電子ビーム照射(25 kGy)でエキスパンダーを滅菌します。手術前に、各エクスパンダーの安全性を確認して安全性を確保してください。注射ポートから生理食塩水10mLを注入し、結合カテーテルの開通度と拡張を確認して水漏れがないことを確認します。
   注意:事前に注射された生理食食塩水を排出してください。

2. 術前および術中の動物ケア

1. 生後6〜8週、体重240〜260gのSDラットのオスを入手。
2. SDラットはイソフルランを吸入して麻酔します。ラットを誘導チャンバーに入れ、5%イソフルランを3L/分の流量で麻酔を誘導します。手術中は2%イソフルランを1.5 L/minの流量で麻酔を維持します。
3. 麻酔を受けたSDラットは手術中に温かさを保つために綿パッドの上に置き、回復後は約28°Cの温められたパッドに20分間置いて低体温症を防ぎます。
4. 足のつまみの引き上げ反射を使って麻酔の深さを評価してください。
   注意:麻酔下のSDラットの呼吸数とパターン、体温、足の指の皮膚色を監視してください。

3. 組織拡張器の埋め込み

1. SDラットの背中の皮膚をヘアクリッパーで剃りましょう。皮膚の色、質感、病変の有無を評価し、拡大の適性を判断します。
2. 背中の中央に横線を引いて切開箇所を示します。剃った部分は75%アルコールで消毒し、無菌の開口部で覆います。
3. 標識された線に沿って1mLの注射器と直径30G(0.31mm)の針を使い、自然生理食塩水を皮下投与し、メスで水平切開を行います。背側筋膜に沿って切開部の上下の皮下組織を広範囲に解離します。膨張バルーンと注射口を蚊用鉗子で収入できる十分なポケットを作りましょう。膨張バルーンの下極を切開から3〜5cmの位置に置き、頂点は皮膚層に向かい、ベースプレートは筋肉の上に乗せます。さらに、結合カテーテルと注射ポートの接合部に隣接する両側の筋膜を縫合して、ポートを安定させます。バルーンと注入ポートの位置を調整し、接続チューブに鋭い曲がりや曲がりがないことを確認します(図1B)。
   注意:生理食塩水注射は皮膚切開や解剖面の識別を容易にします。注入ポートの柔らかい側を皮膚層に向けるようにして、その後の溶液注入が可能になります。
4. 切開部は中断した4-0縫合糸で閉じます。その後、直径25G(0.5mm)の頭皮針で最初の5mLの生理食塩水を注射します。
   注意:切開部は、縫合針の先端でエクスパンダーを刺さらないように注意してください。頭皮針を注射口に垂直に挿入し、垂直に抜きます。
5. SDラットが麻酔から回復するまで待ち、個別のケージに入れます。

4. 連続膨張過程

1. エクスパンダーを持つSDラットは2週間回復し、切開部の完全な治癒を確実にしてください。皮膚の変化を視覚化しやすくするために、拡大部に2.5cm×2.5cmの線のボックスをマークしてください(図2A)。
2. SDラットはステップ2.2から2.4で説明された方法で麻酔します。観察を容易にするために膨張領域を削りましょう。皮膚の拡大が感染症、皮膚膿腫、壊死で複雑になる場合は、直ちに拡大手術を中止してください。
   注意:急激な毛の成長に対応するために、拡大した部分は少なくとも週に一度は剃ってください。
3. 注射口周辺を剃り、75%アルコールで消毒してください。ポートを固定し、25Gの頭皮針を使って自然生理食塩水10mLをゆっくり注射します。無菌ガーゼで注射点を2分間押して止血を確認します。
4. SDラットが麻酔から回復するのを待ち、温めたパッドに20分間置いてから個別のケージに移します。
5. 生理食塩水は週に2回注射してください。フォローアップ中に拡張関連の合併症、拡大装置漏れ、接続管の曲がり、拡大装置の露出、皮膚の赤血症、壊死、感染、分解などを監視します(図2E)。生理食塩水注射時に抵抗が発生した場合のカテーテルのねじれの可能性を調査します。膨張バルーンが柔らかくなった場合は、エキスパンダーの漏れが疑われます。局所的なエキキモーシスは灌流障害の兆候であり、皮膚の暗色は壊死と特定します。局所的な赤み、腫れ、局所皮膚温度の上昇が確認され、感染が疑われます。治癒しない傷は皮膚の損傷として分類し、拡張剤の曝露の可能性を調べてください。
   注意:各注射の前後に拡大した皮膚を検査し、有害事象の早期発見を容易にしてください。拡大装置の漏れ、皮膚の破損や壊死、拡張器の曝露など深刻な合併症が発生した場合は、生存可能な皮膚の保存を最大化するために、直ちに拡大手術を中止してください。

5. 拡大面積測定と再生皮膚採取

1. 高精度3Dスキャナーで膨張面積を測定してください。エクスパンダー上部の皮膚をスキャンすることで、スキャン領域の表面積が自動的に計算されます(図2B)。
   注意:各注射前に麻酔をかけたSDラットのスキャンを必ず行ってください。
2. デジタルカメラで膨張した皮膚を撮影します。破線のボックスで区切られた面積を測定・計量し、表面積(図2C)と質量(図2D)の変化を記録します。
3. 実験の終了時に過剰な二酸化炭素に曝露してSDラットを安楽死させます。
   注:本研究では、臨床現場での全拡張プロセスを再現するために、エンドポイントを総注射量155 mLと定義します。
4. 死後、拡大した皮膚と隣接する正常皮膚の両方にサンプリング部位をマークしてください。エキスパンダーから全体積の半分を吸引した後、注射口の上にある皮膚をハサミで水平に切開します。拡大器と膨張した皮膚の間の平面を蚊用鉗子を使って広範囲に切り離し、拡張器を完全に無傷で除去できるようにします。はさみで皮膚サンプルを切除し、組織を真っ二つに切断します。4%のパラホルムアルデヒド溶液で固定し、組織学的染色の処理を施します。
   注意:拡大剤除去前に採取対象領域を明確にし、皮膚後退による誤認を防ぎ、局所的な治療領域の正確な特定を確保してください(図3A)。
5. 収集した動物の死骸は黄色い医療廃棄物袋に別々に入れます。使用済みのエクスパンダー、注射器、ガーゼは黄色い医療廃棄物袋に入れて処分してください。刃物や針、その他の鋭利品は指定された鋭利器の容器に捨てます。
   注:本研究のすべての廃棄物処理は、上海第九人民病院実験動物センターの管理規則に準拠しています。

6. 皮膚組織学的着色

1. 皮膚サンプルをパラフィンに埋め込み、5μmの断片に切断して接着スライドに置きます。
2. ヘマトキシリンとエオシン染色(HE染色)を用いて皮膚の厚さを評価します(図3B,C)、コラーゲン沈着を評価するためにマッソン三色染色(図3D,E)。スライド全体スキャナーでセクションをスキャンし、ImageJバージョン1.54ソフトウェアで解析します。
3. CD31免疫蛍光染色を用いて血管形成を評価する。一次抗体を塗布し、4°Cで一晩インキュベートし、FITC結合二次抗体を用いて蛍光顕微鏡で検査します(図3F,G)。
4. GraphPad Prismバージョン10.0ソフトウェアを使って定量データを解析し、結果を平均±標準偏差(SD)として提示します。Studentのt検定を用いて統計的比較を行い、統計的有意性を *p < 0.05と定義します。

結果

本研究では、連続組織拡張モデルの標準プロトコルを確立しました。拡張装置の安全性が確認された後(図1A)、手術的にSDラットの背側領域に皮下移植されました。膨らむ面は皮膚の方に向かって配置されていました。拡張体の変位を防ぐため、カテーテルと注射ポートの接続点は筋膜に固定されました(図1B)。週2回の生理食塩水注射後、皮膚の進行性の拡大過程が記録されました(図2A)。拡大した皮膚は注射量の増加とともに徐々に成長し、点線ボックス内の面積が拡大し皮膚が薄くなることがその証拠です。すべてのSDラットにおける拡大面積の変化とマーク表面積の変化は、皮膚再生が二相性パターンを示し、初期の急速期とその後の減速を伴うことを確認しました(図2B,C)。155 mLの点滴量では、45 mL時よりも標識部分の皮膚重量が有意に高かった(図2D

ディスカッション

組織拡張は、質感や色の面で隣接する健康な肌に近い追加の皮膚を作るために広く使われる技術として登場しています¹⁹。瘢痕修復、乳房再建、体表腫瘍切除後の再建など、多様な臨床状況に適用^{されています。}しかし、長期的な組織拡張は依然として重大な課題であり、主に皮膚^{再生能力の}枯渇によるものです。適切な動物モデルの不在が、その基礎メカニズムの探求を妨げています。したがって、臨床の長期組織拡大を非常によく模倣し、高い安定性と再現性を示す連続組織拡張モデルを確立しました。

C57BL/6マウスとSDラットは組織拡張研究で一般的に用いられる動物モデルです。マウスとラットの皮膚特性が似^{ているため、ラ}ットはより豊富な皮膚組織を持つため好まれます。C57BL/6マウスと比較して、SDラットはよりおとなしい気質と長期的で反復的な実験的手法に対する耐性が高...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD31抗体	アブカム上海貿易株式会社	AB182981	IHC染色
電子ビーム照射装置	トンウェイシンダテクノロジー(江蘇)有限公司。有限会社	高エネルギー電子加速器(10 MeV、24 kW)	不妊手術
FITC結合二次抗体	プロテテック・グループ株式会社	SA0003-2	IHC染色
Graghpad Prismソフトウェア	GraphPadソフトウェア	バージョン10.0	統計解析
ヘマトキシリン・エオシン染色キット	ビヨタイム・バイオテック株式会社	C0105S	組織学的染色
高精度3Dスキャナー	シャイニング3D	EinScan Pro 2X V2	面積測定
Image J ソフトウェア	国立衛生研究所	バージョン1.54	統計解析
マッソンのトリクローム染色キット	ビヨタイム・バイオテック株式会社	C0189S	組織学的染色
組織拡張装置	上海ウィナー整形外科製品有限公司	該当なし	特別なカスタマイズ