次世代シーケンシングによるクローナリティ解析：多発性骨髄腫における微小残存病変モニタリングのための臨床的妥当性検証

サマリー

本研究では、多発性骨髄腫（MM）を含むリンパ腫性悪性腫瘍におけるMRD検出を目的として、新規のNGSベースのBCR/TCRクローナリティ解析法（OriMIRACLE LT）を評価した。細胞株および臨床塗抹標本を用いた検討により、本手法は >検出率は90%であり、フローサイトメトリーとの一致率は81.36%であった。本アッセイは高い感度を有し、再発の予測および治療方針の決定を支援する。

要約

微小残存病変（MRD）の検出は、リンパ系悪性腫瘍の管理において極めて重要です。本研究では、MRD検出のための新しい次世代シーケンシング（NGS）ベースのB細胞受容体（BCR）およびT細胞受容体（TCR）クローナリティアッセイであるOriMIRACLE LTMを紹介します。我々は、多発性骨髄腫（MM）患者からの残留塗抹標本を含む細胞株および臨床検体を用いて、このアッセイのバリデーションを行いました。BCR/TCRクローナリティアッセイは、リンパ系悪性腫瘍において90%以上の陽性検出率を示しました。MM患者におけるバリデーション研究では、腫瘍細胞検出における多色フローサイトメトリー（MFC）と臨床的奏効評価との間で81.36%（48/59）の一致率が示されました。注目すべきことに、NGSとMFCの両方でMRD陽性であったMM患者の61.11%（11/18）に、疾患の進行または再発が認められました。NGSのみでMRDが検出された患者では臨床的な完全奏効率が低く、また、当初は奏効していた一部のMM患者において治療中止後の再発が見られました。これらの知見は、このNGSベースのアッセイが、MM患者由来の残留塗抹標本においてさえ、リンパ系悪性腫瘍における極めて高感度かつ特異的なMRD検出を可能にすることを示しています。本手法はMFCに対する優位性を有しており、MRDの追跡に有用であることが証明されました。結論として、NGSはより深いリスク層別化を提供するため、特にMFC⁻/NGS⁺の患者において、MFCを補完するツールとして有効であると考えられます。ただし、最適な介入しきい値については、今後の前向き研究による検討が必要です。

概要

多発性骨髄腫（MM）は、骨髄における異常なクローン性プラズマ細胞の増殖を特徴とする血液がんである¹。中国では、2022年に約22,450例のMMの新規診断があり、関連死は17,360例にのぼった²。過去10年間でMMの治療法は著しく進歩し、患者の生存期間中央値は大幅に延長した。しかしながら、大多数の患者が最終的に再発を経験する^3,4。このような状況は、正確な寛解モニタリング、早期の再発予測、およびタイムリーな治療介入が極めて重要であることを強調している。

血液がんにおける微小残存病変（MRD）ステータスの予後的な重要性は、臨床的根拠によって強固に確立されています^5,6,7。その重要性を認め、国際骨髄腫ワーキンググループ（IMWG）は2016年にMRD評価を治療反応評価基準に組み込みました⁸。現在の骨髄MRD評価法には、アレル特異的オリゴヌクレオチドポリメラーゼ連鎖反応（ASO-PCR）、デジタルPCR（dPCR）、マルチパラメトリックフローサイトメトリー（MFC）、および次世代シーケンシング（NGS）アッセイが含まれます⁸。ASO-PCRは高感度な検出が可能である一方、患者個別のプライマーが必要なため、時間がかかり標準化が困難です^9,10。同様に、dPCRもアレル特異的な設計による制約があります^10,11。MFCは細胞レベルの情報を迅速に提供できるためMRD検出に有効ですが¹²、標準化と再現性に課題があります。

NGSは、患者個別のプライマーを必要としない、再現性と感度の高い手法を提供します。これにより、血液腫瘍における固有の免疫グロブリン再構成の確実な同定と定量が可能になります¹³。米国食品医薬品局（FDA）は、急性リンパ性白血病（ALL）、MM、および慢性リンパ性白血病（CLL）患者のMRD検査において、Adaptive Biotechnologies社のClonoSEQを承認しています^14,15,16。現在、多くの国際的な臨床ガイドラインにおいて、MRDモニタリングの推奨手法としてNGSが盛り込まれています。中国のMM診断・治療ガイドライン（2020年改訂版）においても、次世代フローサイトメトリー（NGF）やNGSなどの手法を用いたMM患者のMRD評価が推奨されています¹⁷。

我々の知る限り、NGS技術はコストと時間の制約があるため、臨床現場におけるリンパ系悪性腫瘍のMRD検出の優先的な手法とはなっていません。MFCの結果が陰性である場合、MRDを検出するために追加の骨髄穿刺が必要となることが多くあります。この追加処置は患者に多大な身体的および心理的負担を強いる可能性があり、広範な臨床応用の制限要因となる可能性があります。

本研究では、NGSを用いたB細胞またはT細胞受容体（BCR/TCR）クローナリティ解析（OriMIRACLE LTM）を開発し、その特性評価および性能検証を行いました。本研究の主な目的は、残存塗抹標本を用いた場合であっても、リンパ球系悪性腫瘍におけるMRD追跡に対する本解析の感度と特異度を検証することでした。本手法は、日常的な診断で残された骨髄塗抹標本を直接利用できるため、塗抹標本固有の制限を克服することが可能です。固定、染色、および長期保存によって塗抹標本中のDNAが断片化している場合や、極めて低量である場合、あるいは部分的に分解している場合であっても、最適化された核酸抽出およびマルチプレックスPCR増幅を通じて、信頼性の高い免疫レパトアプロファイルを得ることができます。これにより、10⁻⁵から10⁻⁶の感度での高感度なクローン追跡が可能となり、従来のフローサイトメトリーに基づくMRDの検出限界を下回る感度を実現しました。本研究は、NGSベースのBCR/TCRクローナリティ評価がMRD追跡を強化し、多発性骨髄腫（MM）患者の治療方針決定に寄与する可能性を強調するものであり、現在の臨床現場における制限を解決できる可能性があります。

プロトコル

本研究はヘルシンキ宣言の原則に従って実施され、贛南医科大学第一附属病院の倫理委員会によって承認されました（倫理承認番号：22SC-2023011201）。すべての参加者から、研究への参加に先立ち、書面によるインフォームド・コンセントを得ました。

サンプルの選定
ALL、MM、CLL、およびリンパ腫を含む、さまざまな血液悪性腫瘍と診断された40名の患者から臨床サンプルを採取した。さらに、慢性骨髄性白血病患者から、慢性期と急性期のペアサンプルを採取した。サンプルは、2016年12月から2022年8月の間に、中国江西省の贛南医科大学第一附属病院から収集した。これらの検体は、骨髄穿刺液（BMA）または末梢血に由来する。また、4つのリンパ系悪性腫瘍細胞株（B-ALL株のREHおよびNALM6、T-ALL株のJurkat、およびリンパ腫株のH9）を、すべてAmerican Type Culture Collection（ATCC; Manassas, VA）から入手して使用した。

分析バリデーション研究のために、新規診断または再発したMM患者30名から治療前後に採取された、ペアリングされた臨床的残余骨髄塗抹標本のサブセットを対象とした。対応する時点のBMAサンプルを用い、4色フローサイトメトリーによりMFCアッセイを実施した。

サンプルは、6種類の異なる4色抗体組み合わせ（希釈は製造元の指示に従う）を用いて染色した：CD38/CD56/CD45/CD19、CD38/CD138/CD45/CD34、CD38/CD117/CD45/CD33、CD38/CD22/CD45/CD20、CD38/CD9/CD45/HLA-DR、およびK/L/CD45/CD38。染色は4 °Cの暗所にて30分間行い、続いてPBSで2回洗浄した（遠心分離は4 °Cで500 × g、5分間）。免疫血液学検査室では、現在、骨髄におけるMFC-MRD陽性は10^-4（10,000個中1個の細胞）の閾値を用いて定義されている。フローサイトメトリーのデータ取得品質は、前方散乱光/側方散乱光を可視化し、1チューブあたり少なくとも10,000個のCD45⁺イベントを確認することで検証した。

NGSベースのクローナリティアッセイによるクローナリティ検出およびMRDトラッキング
BMA、末梢血、または残存塗抹標本全量（200 µLのPBSで再懸濁）200 µLから、メーカーの指示に従い適切なキットを用いてgDNAを抽出した。最小gDNA濃度20 ng/µLおよび総収量≥ 1 µgを必要条件とし、A260/A280比が1.8–2.0であることを確認した。本アッセイでは、プライマーを用いた遺伝子座特異的マルチプレックスPCRによりgDNAを増幅し、続いてサンプル識別のために増幅された受容体配列に反応特異的インデックスバーコードを付加する。その後、バーコード付加済みの増幅DNAをプールしてシーケンシングライブラリを調製し、Illuminaプラットフォームを用いてNGSを行う。最終的なライブラリサイズが350–450 bp、濃度が≥ 5 nMであることをBioanalyzerで確認した。シーケンシングデータは、カスタマイズされたバイオインフォマティクスパイプラインと厳格な品質管理措置を用いて処理される。リードは各サンプルの再構成されたBCRまたはTCRに割り当てられ、クローナルな受容体配列として集約される。これらの配列について、疾患関連のポテンシャルおよびその後のトラッキングへの適合性が評価される。適合と見なされるためには、配列が当該遺伝子座における全BCR配列の少なくとも10%を占め、かつ十分なユニーク性を有している必要がある。MRDトラッキングに向けて配列を評価する場合、そのユニーク性はImMunoGeneTics (IMGT) データベース (http://www.imgt.org) などの包括的なB細胞またはT細胞レパトアデータベースと比較して決定される。このデータベース内における配列の出現頻度を用いて、その特異性を評価する。適切な疾患関連配列が特定されると、それらを後続のサンプルと比較してMRDをモニタリングする。配列の一致が認められた場合はMRD陽性(+)、一致が検出されなかった場合はMRD陰性(-)と分類される。モニタリング対象となる各配列の濃度を定量し、サンプルレベルでのコンセンサス悪性細胞数および総有核細胞数を算出する。これらの数値の比率によりサンプル内の腫瘍細胞頻度が推定され、疾患の進行または寛解に関する貴重な知見が得られる。50以上のサポーティングリードが検出され、かつ診断時の全BCR/TCRレパトアの≥10%をその配列が占めている場合に、そのクローナル配列はトラッキングに有効であると見なされた。

ヒト由来のすべての検体は、個人用保護具（PPE）を着用し、クラスIIバイオセーフティキャビネット（BSC）内でバイオハザード物質として取り扱った。汚染された消耗品は廃棄前にオートクレーブ滅菌（121 °C, 20 min）し、液体廃棄物は10%漂白剤で処理した。

精度および感度の検討
検出限界（LOD）は、健康なドナー由来の末梢血gDNAをバックグラウンドとして、臨床検体および細胞株を用いて決定した。検出の線形性を確立するため、正常gDNAに細胞株gDNAをスパイクし、数桁にわたるクローン頻度の範囲を作成した。具体的には、悪性細胞を10個から開始し、その後10倍段階希釈（10個、100個、1,000個、および10,000個）してスパイクした。LODは、適合させたプロビット曲線が95%の検出確率に達した際の悪性入力細胞の予想数として算出した。実測頻度と予想頻度の間の一貫性を線形回帰を用いて分析した。これらのパラメータは、以降の評価研究におけるサンプルレベルのMRD推定のための強固な基盤となる。この洗練されたバージョンでは、明確さと簡潔さを向上させつつ、学術的なトーンを維持している。また、科学用語の適切な使用を確保し、ライフサイエンスおよび医学分野の学術論文の慣習に準拠している。

統計解析
両側p < 0.05を統計的に有意とみなした。線形性はGraphPad Prismを用い、ピアソンの相関係数（r）を用いて評価および算出した。統計解析はR言語（バージョン 3.6.1）を用いて行った。無増悪生存期間（PFS）の算出は、患者が完全奏効（CR）、部分奏効（PR）、または非常に良好な部分奏効（VGPR）を達成した時点から開始し、病勢進行（PD）またはあらゆる原因による死亡が発生するまでとした。生存分析にはカプラン・マイヤー曲線を用い、サブグループ間の生存率の差の比較にはログランク検定を用いた。Cox解析は、単変量解析および多変量解析の両方を用いて実施した。

結果

クローナリティ検出の処理能、直線性、および精度
BCR/TCRクローナリティアッセイは、2ラウンドのマルチプレックスPCRとそれに続くNGSに基づいて行われた（図1）。BCRクローナリティアッセイでは、個別の反応または調整済みの単一混合反応を用いることで、IGH（VH-DH-JHまたはDH-JH）、IGK（Vκ-Jκ、Vκ-Kde、およびintronRSS-Kde）、IGL（Vλ-Jλ）の再構成、ならびにBCL1-IGHおよびBCL2-IGH転座を同定することができた。TCRクローナリティアッセイでは、TCRB（Vβ-Dβ-Jβ）およびTCRG（Vγ –Jγ）の再構成を検出できた。B細胞性リンパ性悪性腫瘍のBCRクローナリティの検出率は93.94%であり、T細胞性リンパ性悪性腫瘍のTCRクローナリティの検出率は90.91%であった（表1）。

細胞株を用いた試験の結果に基づき、数桁にわたる幅広いサンプル入力量（0.2 µg、2 µg、20 µg）において線形性が実証されました。線形性を確立するため、正常gDNAに悪性細胞を10倍段階希釈（10、100、1,000、10,000個）してスパイクしました。その結果、クローン頻度1から10^-6において、推定傾斜が0.93～1.06であり、線形性が観察されました（Figure 2A）。LODは、BCRおよびTCRクローナリティアッセイの両方において、1～2個の悪性細胞であると推定されました（Figure 2B）。さらに、BCR/TCRクローナリティアッセイを用いて、組織検体（BMA）および対応する末梢血におけるリンパ腫のクローナリティを検出することができました（Supplementary Table 1）。

MRD検出のバリデーションに使用した患者および検体
MRD検出のバリデーションには、合計29名のMM患者が含まれたが、うち1名は検体の損傷により除外された。研究対象集団は、男性が65.52% (19/29)、女性が34.48% (10/29)であり、年齢の中央値は65歳（範囲 33–82歳）であった（表 2）。コホートのうち、IMWG基準¹⁸に基づき、高リスク群が31.03% (9/29)、標準リスク群が24.14% (7/29)、低リスク群が37.93% (11/29)に分類された。改訂版多発性骨髄腫国際病期分類（R-ISS）のステージI、II、IIIは、それぞれ患者の10.34% (3/29)、48.28% (14/29)、20.69% (6/29)を占めた¹⁹。

NGS法とMFC法の比較
OriMIRACLE LTMおよびMFC法の定量的な正確性を評価するため、直接的なペア比較を実施した。その結果、テストした範囲全体、特にMRD頻度が10⁻⁴を超える場合に同様の定量的な正確性が示され、ピアソン相関係数Rは0.73であった（図3）。29名のMM患者から得た59サンプルにおいて、MFC法とNGS法の両方で腫瘍細胞が検出され、一致率は81.36%（48/59）に達した。この一致度は、手法間の真の一致ではなく、異なる時点において検出可能な腫瘍細胞が存在していたことを反映している。サンプルの中では、62.07%（18/29）がNGS法とMFC法の両方でMRD陽性（MRD+）であり、1名の患者は両法でMRD陰性（MRD−）であった。また、11名の患者はNGS法ではMRD+であったが、MFC法ではMRD−であった。検出結果が不一致であった患者のうち、3名は検出頻度が10^-4未満であり、8名は10^-2–10^-4 の範囲内であった（図3）。残留骨髄塗抹標本からのDNA抽出は、可能な限り多くのDNAを得るために行われた。治療前のクローナリティ検出では、平均91.95 ng（最大100.0 ng）のDNA入力量をテストした。その後のMRD検査では、平均1623.39 ng（範囲：50.1–17400.0 ng）のDNAが抽出された（付録表2）。これにより、残留サンプルが不十分な場合でもNGS法ではMRDを検出できる一方、MFC法では一部のケースでMRDの検出に失敗することが明らかになった。

リードインターバルにおけるNGSアッセイによるMRD検出の臨床的妥当性
すべてのMM患者において、ベースラインでクローン性配列が検出され、続いてMRDの評価が行われた（図4）。18名の患者がNGSおよびMFC検出によりMRD陽性と確認された。MFCとNGSの両方でMRD陽性であった患者のうち、61.11%（11/18）がその後にPDまたは再発を経験した。38.89%（7/18）の患者は、研究期間中に安定病勢（SD）またはPRを達成した。NGSではMRD陽性であったがMFCではMRD陰性であった患者のうち、36.36%（4/11）が直近の臨床評価において臨床的CRを達成できなかった（付録表2）。さらに、臨床的奏効がCRであったすべての患者のうち、37.50%（3/8）の患者が治療中止後に再発を経験した。また、PFSの結果に関連して、主要な臨床的特徴およびMFCの結果についても検討した（付録図1）。PFSの単変量および多変量解析の結果、それらに有意な関連は認められなかった。本研究において、MFCから得られたMRD結果のみを分析した場合、PFSに有意な差は見られなかった。

データの利用可能性
患者のプライバシー制限および施設の方針により、生データは公開されていません。収集したデータの要約は補足ファイル 1に記載されています。

図1: BCR/TCRクローナリティアッセイは、マルチプレックスPCRとそれに続くNGSで構成される。 第1ラウンドのPCRでは、遺伝子座特異的プライマーとサンプル特異的なインデックスを用いて、再構成された免疫受容体遺伝子のCDR3領域を増幅し、第2ラウンドのPCRでNGSアダプターを付加した。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 2: さまざまなクローン頻度で正常gDNAに細胞株gDNAをスパイクし、クローン性検出の直線性を評価した。 (A) BCRおよびTCRクローン性アッセイの直線性。 (B) 健康なドナーの末梢血gDNAにスパイクした臨床検体および細胞株を用いて推定した検出限界（LOD）。 ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図 3: MFCとNGS MRDアッセイ間におけるMRD頻度測定値のペアワイズ比較。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

図4: MM患者のMRDダイナミクスと患者の異なる臨床状態. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

サンプルタイプ		No.	疾患タイプ	優勢クローノタイプ
細胞株	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	リンパ腫	TCRB, TCRG
臨床B細胞リンパ系悪性腫瘍		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	検出されず
		9	CLL	IGH, IGK
		10	CLL	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	リンパ腫	IGH, IGK
		24	リンパ腫	IGH, IGK, IGL
		25	リンパ腫	IGH, IGK, IGL
		26	リンパ腫	IGH, IGK, IGL
		27	リンパ腫	IGH
		28	リンパ腫	IGH
		29	リンパ腫	IGH, IGK, IGL
		30	リンパ腫	IGH, IGK
		31	リンパ腫	IGH, IGK
		32	リンパ腫	IGH, IGK, IGL
		33	リンパ腫	IGK
		34	リンパ腫	IGH
		35	リンパ腫	検出されず
臨床T細胞リンパ系悪性腫瘍		36	リンパ腫	TCGR
		37	リンパ腫	TCRB, TCRG
		38	リンパ腫	TCRB, TCRG
		39	リンパ腫	TCRB, TCRG
		40	リンパ腫	TCRB, TCRG
		41	リンパ腫	TCRB, TCRG
		42	リンパ腫	TCRB, TCRG
		43	リンパ腫	TCRB, TCRG
		44	リンパ腫	検出されず

表 1：4つの細胞株および40個の臨床検体におけるBCR/TCRクローナリティアッセイを用いたクローナリティ検出。B-ALL：B細胞性急性リンパ性白血病；T-ALL：T細胞性急性リンパ性白血病；CP-CML：慢性期慢性骨髄性白血病；BP-CML：急性転化期慢性骨髄性白血病；CLL：慢性リンパ性白血病；MM：多発性骨髄腫。

特性	合計 (N = 29)
年齢中央値、歳 (範囲)	65 (33-82)
性別、n (%)
男性	19 (65.52)
女性	10 (34.48)
重鎖タイプ、n (%)
IgG	14 (48.28)
IgA	7 (24.14)
IgE	1 (3.45)
軽鎖タイプ、n (%)
k	19 (65.52)
λ	8 (27.59)
細胞遺伝学的異常、n (%)
del17p	2 (6.90)
del13q14	9 (31.03)
1q21 gain/amp	12 (41.38)
t (4;14)	2 (6.90)
異常なし	9 (31.03)
ISS ステージ、n (%)
I	4 (13.79)
II	13 (44.83)
III	12 (41.38)
R-ISS ステージ、n (%)
I	3 (10.34)
II	14 (48.28)
III	6 (20.69)
欠損	6 (20.69)
IMWG、n (%)
高リスク	9 (31.03)
標準リスク	7 (24.14)
低リスク	11 (37.93)
欠損	2 (6.90)

表 2：本研究に登録された 29 名の MM 患者のベースライン特性。 k: kappa; λ: Lambda; DS: Durie-Salmon; ISS: 国際病期分類システム; R-ISS: 改訂国際病期分類システム; IMWG: 国際骨髄腫ワーキンググループ

補足図1：臨床的特徴およびMFC結果に基づく生存分析。（A）PFSの単変量および多変量解析。（B）MFC結果によるカプランマイヤー曲線。（C）NGS結果によるカプランマイヤー曲線。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足表1：組織サンプルおよび対応する末梢血におけるBCR/TCRクローナリティアッセイを用いたリンパ腫のクローナリティ検出NHL：非ホジキンリンパ腫；HGBL：高悪性度B細胞リンパ腫；FL：濾胞性リンパ腫；DLBCL：びまん性大B細胞リンパ腫；ITLPD-GI：胃腸管の低悪性度Tリンパ増殖性疾患 こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。

補足表2：MFCおよびNGSアッセイに基づくMRD検出の結果。ND：検出せず；部分奏効：PR；完全奏効：CR；安定病変：SD；非常に良好な部分奏効：VGPR。 こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

補足ファイル 1：本研究で収集された生データのまとめ こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

近年、リンパ系悪性腫瘍の臨床転帰は大幅に改善しており、生存エンドポイントをより早期に予測し、新規治療法の評価を迅速化できる代替マーカーの探索が促進されています²⁰。8,098人の患者を対象とした包括的なメタ解析により、MM患者における長期生存率の向上において、MRD陰性が強固な予後価値を持つことが再確認されました²¹。さらに、BCRおよびTCRのクローナル再構成が、リンパ系悪性腫瘍における治療決定の指針となる重要な診断およびMRD追跡マーカーとして台頭しています²²。

十分な量のDNA検体が利用可能な場合、MFCおよびPCRベースの解析よりもNGSベースのBCR/TCRクローナリティ評価の方が優れていることを支持する根拠が増えています。NGSはより高い感度と簡便な標準化を実現し^{10,23,24,25,26}、維持療法の開始時におけるPFSおよび全生存期間の両方にとって強力な予後因子であることが確認されています²⁷。
本研究では、リンパ系悪性腫瘍におけるBCRおよびTCRクローナリティの両方で90%を超える陽性検出率を示すNGSベースの解析法を開発しました。本解析法のLODは、BCRおよびTCRクローナリティ解析ともに悪性細胞1〜2個の間と推定され、LOD 1.903個というclonoSEQ Assayの高い感度に匹敵します¹⁶。クローン頻度1〜10^-6において、推定傾斜が0.93から1.06の範囲で直線性が観察され、観察されたクローン頻度と期待されるクローン頻度の間に強い比例関係があることが示されました。標準化された検出方法の確立およびラボバリデーションの完了後、臨床的なMRDモニタリングへの適合性を確認するために臨床バリデーションを実施しました。

本研究により、NGSベースのアッセイとMFCの間で81.36%（48/59）の一致率があることが明らかになった。両手法とも、初診または再発例における腫瘍細胞の同定において100%の感度を示した。治療後のモニタリングに関しては、MFCで評価したMRDステータスとPFSとの間に有意な相関は見られなかったが、これはサンプルサイズが限定的であったためと考えられる。その結果、全症例の包括的な解析を実施した。

両方の手法でMRD陽性と判定された18人の患者において、MRDの結果は臨床的奏効評価と一致していました。これらの患者のうち、9人はPDまたは再発を経験し、4人はSD、4人はPRに達し、1人が死亡しました。このことは、両方の手法でMRD陽性と判定された患者では、ほぼ例外なくPDまたは再発が観察されることを示唆しています。これらのデータは、NGSおよびMFCアッセイの両方でMRD陽性であることは、主にこれらの患者における限定的な有効性または不良な予後を反映していることを示唆しています。NGSでMRD陽性でありMFCでMRD陰性であった11人の患者のうち、36.36%がCRに至りませんでした。これらの知見は、一部の症例でMFCがMRDを検出できなかった一方で、NGSが少量の残余検体であっても10^-2から10^-6の頻度でMRDを検出できる能力を持つことを強調しています。これは、MRD検出におけるMFCと比較したNGSの高い感度と特異性をさらに裏付けるものです。

これまでの研究により、MFCで評価されたMRDステータスがMM患者におけるPFSおよび全生存率の強力な予測因子であることが示されており、自己幹細胞移植後の治療方針の決定および予後評価におけるMRDモニタリングの重要性が強調されています²⁸。本研究の結果は、MFCではMRD陰性であったがNGSではMRD陽性であった2例（患者11および14）に代表されるように、NGSアッセイの重要性をさらに浮き彫りにしています。このような症例において治療を中止することは再発のリスクにつながる可能性があるため、MRDの結果に不一致が見られた場合には、治療反応を慎重に評価することが極めて重要です。

本研究は、既存のNGSおよびMFC法における新鮮な骨髄吸引液や凍結細胞への依存を解消し、日常診断後に残された染色の済んだ骨髄塗抹標本が、高感度なMRD検出のための信頼できる出発材料となり得ることを初めて体系的に検証したものである。これにより、以下の臨床的および手法的な課題が直接的に解決される。(1) MRDモニタリングのために大量の骨髄液を採取する必要がなくなり、特に高齢患者やサンプリングが困難な患者において有用である。(2) 保存された塗抹標本の遡及的解析が可能となり、既存の病理学的リソースを活用して過去のコホートにおけるMRDに基づく予後根拠を確立できる。(3) 10^-5-10^-6という検出感度は、従来のMFC（通常10^-4-10^-5）よりも遥かに優れており、MFCにおけるサンプル品質の問題に起因する偽陰性を回避し、臨床実務にDNAベースの追跡可能なMRD評価ツールを提供する。

アッセイの成功と信頼性を確保するために、いくつかの重要なステップが特定されました。十分なgDNA収量を得るためには、残留塗抹標本を優しくスクレイピングし、直ちにバッファーを適用することが不可欠でした。アレルドロップアウトや増幅バイアスを避けるため、正確な入力DNA量（1反応あたり100 ng、±10%以内）が必要とされました。バーコード化された産物を等モルでプーリングすること（2 nM）が、均一なシーケンシング深度に寄与し、バイオインフォマティクスの閾値を一貫して適用すること（診断時のクローン頻度≥10%および追跡時のミスマッチ≤5%）が、偽陽性のMRD判定の防止に役立ちました。さらに、一般的な実験上の問題に対処するため、標準プロトコルにいくつかの変更が導入されました。最終ライブラリー濃度が5 nMを下回った場合は、過剰増幅によるバイアスを避けるため、慎重に2～4サイクルの追加PCRを2回目に行いました。過剰なミスマッチ（>5%）によりクローン追跡が失敗したサンプルについては、参照用IMGTデータベースを更新し、探索的解析のためにミスマッチ許容値を一時的に8%に緩和しましたが、臨床報告の標準カットオフ値は5%のままとしました。シーケンシング深度がサンプルあたり50,000リードを下回った場合は、PCRステップを繰り返さずに再プーリングおよび再シーケンシングを実施しました。

全体として、この実臨床での検証により、骨髄塗抹標本の残余検体を用いることで、さまざまな治療状況において一貫した信頼性の高い検査結果が得られることが実証されました。骨髄生検やMFCがNGSに代わって日常的に行われている経済的に不利な地域において、初期結果が陰性であった場合に、さらなる分子生物学的評価のためにNGSを検討できることが本知見により示唆されました。このような状況において残余検体を利用することは、骨髄穿刺を繰り返す必要がなくなり、患者さんの負担を軽減できるため適切であると考えられます。

現在進行中のリアルワールド研究では、さらなる解析に向けてサンプルサイズを拡大することを目指していますが、いくつかの限界があることを認めています。特に、患者10の2回目のMRD検出で観察されたように、抽出されたDNA量が不十分な場合には偽陰性が生じる可能性があります。加えて、NGSによって検出されるクローンの割合は細胞の定量化に影響されるため、MRD細胞の割合を過大評価する可能性があります。本バリデーションは主に骨髄サンプルに焦点を当てています。しかし、NGS-MRDの長期的な意義は治療後の複数回のフォローアップにあり、そこでは末梢血の方が適している可能性があります。末梢血サンプルのバリデーションはまだ実施されていません。臨床バリデーションサンプルの数が限られていること、患者がランダムに登録されていること、および本リアルワールド研究における治療アプローチが多様であることから、連続的なMRDサンプルの収集は困難であることが判明しました。その結果、後続の病勢進行に関連する早期MRD応答の意義の評価に焦点を当てることとなり、持続的なMRD状態が長期的な転帰に与える影響を実証することはできませんでした。さらに、比較解析にNGFは含まれていません。NGSと従来のMFCは体系的に比較されましたが、IMWGが推奨する2つのMRD法（もう一方はNGS）の一つであるNGFを検討していれば、アッセイ性能についてさらなる知見が得られたと考えられます。さらに、サンプルサイズが比較的小さく（n = 40）、コホートは多様な血液悪性腫瘍を含む不均一なものです。私たちの結論を確認し拡張するためには、NGFを組み込み、多発性骨髄腫などの単一の悪性腫瘍に焦点を当てた、将来的な多施設共同の大規模研究が必要です。

NGSベースのBCR/TCRクローナリティアッセイの性能を詳細に特性評価し検証した結果、本手法が多発性骨髄腫（MM）患者の残存骨髄塗抹標本におけるMRDの定量およびモニタリングのための、高感度で正確かつ実用的な手法となる可能性を示しました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Anti-CD19	Abcam	AB134114	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD20	Abcam	AB64088	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD22	Abcam	AB32123	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD33	Abcam	AB134115	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD34	Abcam	AB81289	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD38	Abcam	AB183326	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD45	Abcam	AB40763	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD56	Abcam	AB75813	メーカーの指示に従い希釈
Anti-CD9	Abcam	AB2215	メーカーの指示に従い希釈
Anti-HLA-DR	Abcam	AB20181	メーカーの指示に従い希釈
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
ImMunoGeneTics (IMGT) データベース	ImMunoGeneTics (IMGT) データベース	http://www.imgt.org/
リンパ系悪性腫瘍細胞株	ATCC	https://www.atcc.org/	B-ALL株 REHおよびNALM6、T-ALL株 Jurkat、およびリンパ腫株 H9 (DSMZ)
マルチパラメーターフローサイトメトリー	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
OriMIRACLE LTM アッセイ	Origimed Co., Ltd., Shanghai, China
R言語	R Foundation for Statistical Computing	version 3.6.1