トランスクリプトームシーケンシングにより、動脈硬化性プラーク中のハブ病原性化学物質が同定されました

サマリー

本研究は、RNAシーケンシングを用いて動脈硬化性プラーク(AP)に関連する炎症因子の基礎メカニズムを解析することを目的としています。結果はAPにおける主要な炎症中心遺伝子であるCCL3、CCL4、CXCL1を特定しました。これらのケモカインは、M0マクロファージの蓄積を促進しつつ防御免疫細胞を抑制することで動脈硬化を促進する可能性があり、潜在的な治療標的を明らかにします。

要約

動脈硬化性プラーク(AP)は、動脈壁の内皮細胞や平滑筋細胞の損傷後に発生する炎症性線維組織増殖性疾患の一種であり、心血管および脳血管の血流障害の程度が異なることがある。しかし、炎症を標的とした効果的な治療法はこれまでほとんど見られず、さらなる知見がまだ必要であることを示唆しています。本研究では、RNAシーケンシング(RNA-seq)を用いて炎症因子に関連するAPのトランスクリプトム変化を解析することを目的としました。RNA-seqはAP患者(n=11)と対照群(n=3)のサンプルで実施されました。Metascapeを用いて差分発現遺伝子(DEG)を特定し、その後RソフトウェアのclusterProfilerパッケージを用いたKEGG経路増殖解析、CIBERSORTを用いた免疫浸透解析、STRINGデータベースを用いたタンパク質間相互作用(PPI)ネットワークが行われました。PPIネットワーク内のハブ遺伝子はCytoHubbaプラグインを用いて同定されました。AP群では合計3,713のDEGが同定され、そのうち2097個がアップレギュレート遺伝子、1616個がダウンレギュレーション遺伝子でした。結果は、DEGが主に免疫および炎症関連の経路で濃縮されていることを示しました。炎症関連因子のCCL3、CCL4、CXCL1はAPの病理過程における主要なハブ遺伝子と考えられていました。免疫浸潤解析では、AP内のCD8⁺ T細胞、活性化NK細胞、安静肥満細胞の減少とともに、M0マクロファージの有意な増加が特徴となる独特の微小環境が明らかになりました。結論として、これらの手技的所見はCCL3、CCL4、CXCL1の異なる発現と、APにおける免疫細胞組成の変化との関連を示し、これら3つのケモカインをさらなる機構的検討の候補として示しています。

概要

心血管疾患(CVD)は世界的に人間の健康に深刻な脅威をもたらし^{ています。}世界的な人口高齢化傾向が激化する中、心血管疾患の発症率も増加しています²。その中で、動脈硬化性プラーク(AP)はCVD³の主な原因の一つです。APは慢性炎症性疾患であり、動脈の内側に脂質が徐々に蓄積し、プラークが形成されることを特徴と^します。APは心血管および脳血管イベントの一般的な基礎であり、主に大動脈および中大動脈に関与し、虚血や損傷を引き起こします。また、心血管および脳血管疾患や死亡の主な原因の一つ^です5。初期段階で明らかな症状が見られないため、APは通常診断時には進行しており、致^死率は高い6。APの治療は、低運動量、座りがちな行動、喫煙、精神^{衛生問題、}肥満や高脂肪食による2型糖尿病などの修正可能な要因、さらに遺伝子、年齢、性別などの修正不可な要因にも注目^します。最近の研究では、代謝症候群、ホモシステイン血症、高尿酸血症、膵臓抵抗性が動脈硬化の発生および発症の重要なリスク因子であることが明らかになりました^9,10。

APの病因に関連する理論には、主に脂質浸潤、炎症、酸化ストレス応答、感染、遺^伝的要因と環境要因の相互作用に関する理論^{が含まれます。}その中で、炎症と酸化ストレスはAPの主要な病因と認識されており、^AP13の発生から発達、悪化まですべての過程に関与しています。AP不安定なプラークの突然の損傷、血小板の活性化、血栓症は心筋梗塞および出血性脳卒中の重要な病因です¹⁴。継続的な研究により、APには脂質だけでなく多くの炎症細胞も含まれていることが明らかになりました¹⁵。喫煙、高血圧、脂質異常、高インスリン血症、高血糖、高尿酸などの有害刺激は、白血球や内皮細胞に可溶性接着分子や様々なサイトカインを継続的に放出させ、単球が血管内皮細胞に付着するのを促します。蓄積されたケモカインはさらに単球を亜内皮空間へ移動させ、マクロファージへと分化します。マクロファージは組織内のコレステロール豊富な酸化低密度リポタンパク質(LDL)を食い込み、泡細胞に変化して脂質条紋の形成を開始します¹⁶。ASの初期の病理的損傷、すなわち脂質条痕は主にマクロファージとTリンパ球で構成されており、Tリンパ球は典型的な炎症病変です¹⁷。したがって、さまざまな炎症細胞およびその産物が^AP18の開始および進行に関与しています。しかし、APの炎症の状況は複雑で、既知の要因と未知の複数の要因が関わっています。従来の候補遺伝子アプローチでは、この炎症要因の全スペクトルを捉えきれない場合があります。

この制約に対処するため、RNAシーケンシング(RNA-seq)という無偏のハイスループットトランスクリプトミクス法を用いました。このアプローチは、主要な分子要因があらかじめ定義されていない仮説生成研究に特に適しています。候補遺伝子やマイクロアレイベースの手法とは異なり、RNA-seqはより広いダイナミックレンジ、高い感度、そして事前のプローブ設計なしで新規転写本を検出する能力を提供します^19,20。これらの特徴により、分子基盤が完全には解明されていないAPにおける炎症関連のシグネチャーの発見に特に適しています。

本研究では、APに関連する炎症因子の基礎メカニズムを解析するためにRNA-seqが実施されました。異なるアルゴリズムを用いたバイオインフォマティクスツールを用いて一連のDEGsのスクリーニングを行いました。その後、濃縮解析(WGCNA、KEGG経路、mcode、GSEA、ハブ遺伝子解析)、およびタンパク質間相互作用(PPI)ネットワーク解析が実施されました。本研究の結果は、炎症駆動型APの分子病理メカニズムの理解を深めるに寄与し、新しいバイオマーカーの探索において重要な役割を果たします。

プロトコル

この研究は遼城人民病院倫理委員会(承認番号:2023014)により承認され、ヘルシンキ宣言の原則に準拠しています。すべての参加者からインフォームド・コンセントが取得されました。すべての患者またはその家族がインフォームドコンセント(同意書)に署名しました。

患者とサンプル

本研究は、2023年1月から2023年12月にかけて中国山東省遼城人民病院血管神経外科で頸動脈内膜摘出術を受けた重度頸動脈狭窄症患者11名を遡及的に解析しました。これらの患者はAPグループとして登録されました。頸動脈狭窄症の診断は、CTAや脳血管造影などの画像データに基づいていました。AP群の対象基準は以下の通りです:(1) 年齢は50歳から80歳;(2) コンピュータ断層撮影血管造影/デジタル減算血管造影により頭蓋内内頸動脈狭窄が確認≥70%);(3) 発症前修正ランキンスケールスコア≤ 1;(4) 患者またはその法的代理人から得られたインフォームド・コンセント。除外基準は以下の通りです:(1) 炎症性または免疫疾患;(2) 精神疾患の存在;(3) 悪性腫瘍の存在;(4) 妊娠、授乳、または出産の可能性。年齢相応の重度外傷性脳損傷患者が、同じ期間に同じ病院で臓器提供を受けた患者を対照群に選定しました(NA;ノーマルコントロール、n = 3)。両グループの被験者は年齢、性別、体格指数でマッチングされ、交絡因子を排除しました。対照群の選考基準は以下の通りです:(1) 年齢は50歳から80歳の間;(2) 冠動脈疾患、頸動脈狭窄症、その他の全身性血管疾患の既往がないこと;(3) 患者の法的代理人から得られたインフォームド・コンセント。頸動脈内膜摘出術中にAP群から頸動脈内膜およびプラークサンプルを採取し、大動脈内膜サンプルは臓器提供後に対照群から採取しました。血管組織とプラーク組織は液体窒素タンクに保管され、その後の検査に備えました。AP患者の基底特性は 表1に示されています。

試料の調製

製造元の指示に従い、TRIzol試薬を用いて全RNA抽出を行いました。RNA濃度と純度は、Nanodrop ND-2000分光光度計を用いて260nmおよび280nmで評価されました(A260/A280比は1.8から2.0の間で)。RNAの完全性は100Vの2%アガロースゲル電気泳動を用いて30分間評価されました。RNA完全性値(RIN)はAgilent 2100バイオアナライザーを用いて取得しました(下流解析にはRIN≥7.0のサンプルを使用しました)。特に指定がない限り、すべてのサンプル取り扱いおよびRNA抽出手順は室温で行われました。廃棄物トリゾル試薬は、機関の有害化学廃棄物ガイドラインに従って処分されました。

RNAシーケンス

DNase I処理後、mRNAはオリゴD(T)磁気ビーズを用いて濃縮され、94°Cで5分間短片化されました。得られたmRNA断片はテンプレートとして機能し、ランダムなオリゴヌクレオチドがプライマーとして使われました。第一鎖cDNAはM-MuLV逆転写酵素系を用いて42°Cで50分間合成され、その後RNase H介在によるRNA鎖の分解が行われました。第二鎖合成はDNAポリメラーゼI系内のdNTPを用いて行われました。二本鎖のcDNAは精製され、末端が修復され、アダプターの接続を促進するために「A」型オーバーハングが尾部に付けられました。AMPureのXPビーズを用いて250〜300 bpのcDNA断片を選別し、それをPCRで増幅しました。その後、増幅生成物を精製して最終ライブラリを生成しました。ライブラリシーケンスは、ペアエンド150 bpリード長のIllumina HiSeqプラットフォーム上で行われました。データ品質管理(QC)のため、アダプタ配列や低品質ベースを含む生データは社内のスクリプトでフィルタリングされました。装置から生じるシーケンスエラーの可能性があるため、データ品質はシーケンスエラー率の分布を分析して評価されました(エラー率<1%が許容範囲とされました)。さらに、GCの内容分布も決定されました。すべてのシーケンス手順は特に記載がない限り、常温で行われました。有害化学物質(例:DNase Iバッファー)を含む試薬は、機関のバイオセーフティガイドラインに従って処分されました。

QCの閾値とトラブルシューティング

RIN ≥ 7.0および断片サイズ250–300 bpのライブラリーのみが使用されました。サンプルあたり最低1,400万件の生リード、Q30≥98%が必要でした。ライブラリの収率が低い場合はPCRサイクルを18に増やすことで解決されましたが、重複率を15%未満に抑えるために15サイクルが推奨されました。

DEGのスクリーニング

異なるサンプル間での遺伝子発現レベルの分布を評価しました。遺伝子発現レベルのサンプル間相関を用いて、実験的信頼性およびサンプル選択の適切性を検証しました。主成分解析(PCA)を用いて、グループ間の違いおよびグループ内再現性を評価しました。DEGはMetascapeオンラインデータベース(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)を用いて同定されました。DEGは|log₂(フォールド変化) |>1および p.値は0.05<、統計的に有意とされました。すべてのバイオインフォマティクス解析は、特に指定がない限り、デフォルトパラメータで実施されました。中間再現性チェックポイントとして、サンプルがバッチ単位ではなくグループごとにクラスタ化されていることを確認するためにPCAプロットが作成されました。

京都遺伝子・ゲノム百科事典(KEGG)の濃縮分析

KEGG(http://www.genome.jp/)解析は、生物学的調節経路の発見のために遺伝子機能を評価するための体系的なアプローチです。本論文は、org.Hs.eg(バージョン3.12.0)から差分遺伝子の公式シンボル変換遺伝子IDを初めて入手しました。KEGGのパス解析は、Rソフトウェア(バージョン4.2.0)のclusterProfilerパッケージを使用して実施されました。p . < 0.05は統計的に有意とされました。中間アウトカムとして、対応する遺伝子数と調整されたp値を含む富麗化経路のランク付けリストが作成されました。

PPIネットワーク解析

PPIネットワークおよびスクリーンキー遺伝子を構築するために、STRINGデータベース(バージョン11.0、https://string-db.org/)が用いられました。複合スコアが0.9を超える相互作用のみが統計的に有意と認められました。ネットワークは、分子相互作用ネットワークの探査を目的としたオープンソースのバイオインフォマティクスツールであるCytoscape(バージョン3.10.1)を用いて可視化・解析されました。PPIネットワーク内のハブ遺伝子はCytoHubbbaプラグイン(バージョン0.1)を用いて同定されました。

ハブ遺伝子

トップ20の主要遺伝子はCytoHubba Pluginによって選ばれました。赤は遺伝子のレベルが高いことを示します。Metascape Online Database(バージョン3.5、http://metascape.org/gp/index)によるハブ遺伝子のバイオインフォマティクス解析は、20のハブ遺伝子を解析しました。遺伝子豊か化は以下のオントロジークラスで同定されました:WGCNA、PCA、mcode、GSEA。ゲノム内のすべての遺伝子がエンリッチバックグラウンドとして機能します。 p. < 0.05、最小カウント3、濃縮係数>1.5の項目をスクリーニングしました。

統計解析法

データ解析にはSPSS 25.0の統計ソフトウェアが使用されました。カウントデータは頻度またはパーセンテージで表され、グループ間の比較はカイ二乗検定で検証されました。測定データは正規分布の平均±標準偏差と一致しており、グループ間の比較にはT検定が用いられました。 p. < 0.05が有意差と考えられました。

結果

動脈硬化性プラークにおける差異遺伝子のRNA-seqデータ解析

ライブラリの調製にはRIN ≥ 7.0のサンプルのみが使用されました。14サンプルすべて(AP11、対照3)がこの閾値を超えました。すべてのサンプルは一括でシーケンスされ、したがって、バッチ効果の調整は不要でした。サンプルあたり平均1,680万件の生リードが生成されました。品質フィルタリング後、1,650万件のクリーンリード(98%)が保持され、そのうち91%がヒト参照ゲノム(HG38)に一意にマッピングされました。DEGの解析では、動脈硬化のプラーク患者と健康な対照群で2097のアップレギュレーション遺伝子と1616のダウンレギュレーション遺伝子(|log2FC| >1, P <0.05)が存在することが示されました(図1A)。上位20の上位およびダウンレギュレーションされた差異発現遺伝子のヒートマップは 図1Bに示されています。トランスクリプトームRNAseqシーケンスにより、サンプルの相関が明らかになりました(図1C)。共発現遺伝子モジュールと表現型の相関はWGCNAによって解析されました(図1D)。PCA解析では、NA群とAP群の間に有意な差があることが示されました(P .< 0.05)(図1E)。

差異遺伝子のKEGG濃縮解析

RソフトウェアのclusterProfilerパッケージ(バージョン4.2.0)を用いたKEGG経路濃縮解析は、疾患群におけるアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションされた差異発現遺伝子に対して別々に実施されました(図2A,B)。結果は、これらの遺伝子が造血細胞系統、リウマチ性関節炎、局所癒着、インテグリンシグナル伝達、ケモカインシグナル伝達経路など、免疫や炎症に関連する経路で有意に豊かであることを示しました。

GSEA分析

GSEA解析では、実験群のコア遺伝子は主に上部で濃縮されており、上位調節傾向を示しました(図3A)。対照群のコア遺伝子は主に下部で富集されており、下降傾向を示しました(図3B)。まとめると、炎症遺伝子は実験群(ASA)で上方に上方、対照群(NA)では下方的に下位に抑えられました。

PPIネットワーク分析

STRINGデータベース(バージョン11.0)で解析されたPPIネットワークでは、同じクラスタIDを共有するノード同士が近接して配置される傾向があります。 図4Aに示されているように、このクラスタリングにより、対応する遺伝子は主に細胞活性化、炎症反応、細胞活性化の調節に関与していることが明らかになりました。 図4B は同じネットワークをp値で色分けしたもので、遺伝子が多いクラスターほどp値がより有意な p値を示します。

ハブ遺伝子同定と免疫細胞浸透解析

DEGはmcode解析のために選定され、主にアセチルコリン受容体に関連する解析結果が示されました(図5 および 表2)。CytoscapeのCytoHubbaプラグインを用いたハブ遺伝子解析により、免疫と炎症に関連する上位20のハブ遺伝子が特定されました(図6A、左パネル)。トップ10のハブ遺伝子はCXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2、CCR5で構成されていました(図6A、右パネル)。ハブ遺伝子とオリンク炎症パネル92遺伝子の交差により、CXCL1、CCL20、TNF、CCL3、CCL4の5つの共通遺伝子が明らかになりました(図6B)。CIBERSORT解析では、疾患群と健康対照群の間で免疫細胞浸潤に有意な違いが明らかになりました。対照群と比較して、疾患群はM0マクロファージの割合が有意に高かった(p < 0.05)(図6C)。逆に、CD8 T細胞、活性化NK細胞、ほとんどの安静細胞の割合は疾患群で有意に低く(p. < 0.05)(図6C)。

ハブ遺伝子の機能解析

さらにMetascapeデータベースを用いてHub遺伝子の生物学的機能を解析し、これらの遺伝子は主にサイトカイン媒介のシグナル伝達経路およびカルシウム介在のシグナル伝達に関連していることが明らかになりました(図7Aおよび表3)。その後、細胞型シグネチャーを用いてハブ遺伝子の転写調節因子を豊富にし、ハブ遺伝子は主にgao大腸24W C11パネス様細胞、cui発達中の心臓C8マクロファージ、およびManno中脳神経型hmglに関連していることを示しました(図7B)。DisGeNETデータベースによる疾患豊富解析により、ハブ遺伝子は皮膚病変、エプスタイン・バーウイルス感染、ダニ脳炎と関連していることが示されました(図7C)。PaGenBaseデータベースの組織特性豊か解析では、ハブ遺伝子は主に脾臓、血液、肺で豊かにされていることが示されました(図7D)。さらにTRRUSTデータベース解析により、RELAおよびNFKB1がハブ遺伝子を調節する主要な転写因子であることが明らかになりました(図7E)。

データの利用可能性:

処理されたカウント行列は補助ファイル(補足ファイル1および補足ファイル2)として提供されます。その他のすべてのデータは記事に完全に掲載されています。生のシーケンスデータは、合理的な要望があれば対応著者から入手可能です。

図1:DEGs解析。 (A) 健康なプラークおよび動脈硬化性プラーク、差異遺伝子火山マップ、上行調節2097、ダウンレギュレーション1616 (|log2FC| > 1, P.< 0.05)(B)上位20の差異発現遺伝子のヒートマップ。(C) 標本相関分析。(D)共発現遺伝子モジュールと表現型の相関はWGCNAによって解析されました。(E) PCA解析(NA群はAP群と有意に異なっていた)。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:KEGG解析。 KEGG経路濃縮解析は、疾患群におけるアップレギュレーション(A)遺伝子とダウンレギュレーション(B)遺伝子の差異発現遺伝子に対して別々に実施されました。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:GSEA分析。 (A) GSEA解析では、実験群のコア遺伝子は主に上部で濃縮されており、上位調節傾向を示しました。(B) 対照群では、コア遺伝子は主に下部で富集され、減少傾向を示しました。結論として、炎症遺伝子は実験群(AP)で上位調節され、対照群(NA)ではダウンレギュレーションされました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:PPIネットワーク図。 (A) クラスターIDで色分けされ、同じクラスタIDを共有するノードは通常互いに近接しています。 (B) P値で色付けする方法。つまり、より多くの遺伝子を含む項目ほどより重要なP値を持つ場合。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:DEGsのmcode解析。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図6:ハブ遺伝子解析。 (A) CytoscapeのCytoHubbaプラグインによる度数計算法で取得されたトップ20ハブ遺伝子(左パネル)およびトップ10ハブ遺伝子(右パネル)で、これらは主に免疫と炎症に関連しています。(B) ハブ遺伝子とオリンク炎症パネルの交差点 92遺伝子から5つの交差遺伝子が特定されました。(C) CIBERSORTアルゴリズムを用いて、AP群とNA群間の22の免疫細胞サブセットの浸潤存在比を比較しました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図7:ハブ遺伝子のバイオインフォマティクス解析。 (A) Metascapeデータベースを用いたハブ遺伝子の機能注釈。(B)ハブ遺伝子に関連する転写調節因子の細胞型シグネチャーに基づく濃縮解析。 (C) DisGeNETデータベースを用いたハブ遺伝子の疾患増強解析。(D) PaGenBaseデータベースを通じて同定されたハブ遺伝子の組織特異的発現パターン。(E) TRRUSTデータベースを用いて解析されたハブ遺伝子の転写調節ネットワーク。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

MCODE	行け	概要	ログ10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	高カルシウム透過性ニコチン性アセチルコリン受容体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高カルシウム透過性のシナプス後ニコチン系アセチルコリン受容体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	タンデム孔域カリウムチャネル	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	膜電位の安定化	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	フェーズ4 - 静止膜電位	-9.7

表1:AP患者の基線特性

MCODE	行け	概要	ログ10(P)
MCODE_1	GO:0030322	高カルシウム透過性ニコチン性アセチルコリン受容体	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	高カルシウム透過性のシナプス後ニコチン系アセチルコリン受容体	-16.7

表2:DEGのMCODE濃縮分析。

MCODE	行け	概要	ログ10(P)
MCODE_1	R-HSA-629597	高カルシウム透過性ニコチン性アセチルコリン受容体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	シナプス前ニコチン性アセチルコリン受容体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高カルシウム透過性のシナプス後ニコチン系アセチルコリン受容体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	タンデム孔域カリウムチャネル	-10.3
MCODE_2	GO:0030322	膜電位の安定化	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	フェーズ4 - 静止膜電位	-9.7

表3:ハブ遺伝子のMCODE濃縮解析。

補足ファイル1:対照(n=3)遺伝子発現。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足ファイル2:患者(n=10)コアテーブル遺伝子。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

AP研究の継続的な深化に伴い、AP内で新たなサイトカインが絶えず検出され、炎症はAS^21,22の生成と発達において重要な要因となっています。アルブミンの活性化は、内皮細胞と血管内膜マトリックスの結合を断ち切り、血管内膜から剥がれ出す細胞を促進する可能性があります。誘発性血管内膜損傷^23,24。炎症はLDL-Cの酸化修飾を誘発し、その修飾LDL-Cは動脈の内膜内で炎症反応を引き起こし、AP形成を加速^{させます。}不安定なプラークは最終的に破裂し、^{内外原因を}用いる場合にACSを引き起こすことがあります。プラーク破裂の際、マクロファージ、血管平滑筋細胞(VSMC)、リンパ球は白血球インターロイキン-1(IL-1)、IL-6、血管間癒着因子-1、細胞間癒着因子-1などの炎症因子を分泌します。同時に、単球および顆粒球の受容体である白血球インテグリン(CD11b/CD18)の発現が^27,28増加しています。しかし、APの形成に至る炎症の分子メカニズムはまださらに解明されていません。

炎症によって引き起こされるAPの発生と発症は、多因子作用、多遺伝子変化、多段階疾患の複雑な経過であり、特に多くの遺伝子の異常発現と密接に関連しています。本研究では、RNA-Seqおよびバイオインフォマティクス解析により、健康な対照組織とAPの間で、DEGsのボルケーノプロットから2097の上位調節遺伝子と1616のダウンレギュレーション遺伝子が示されました。DEGのさらなるKEGG濃縮解析により、DEGsは主に免疫および炎症関連経路に濃縮していることが示されました。ハブ遺伝子解析により、CXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2、CCR5のトップ10ハブ遺伝子が特定されました。ハブ遺伝子とオリンク炎症パネル92遺伝子の交差により、CXCL1、CCL20、TNF、CCL3、CCL4の5つの共通遺伝子が明らかになりました。これらの結果は、炎症関連因子であるCCL3、CCL4、CXCL1がAPの病理過程において重要な役割を果たす可能性を示唆しています。免疫浸潤解析では、プラーク内のCD8⁺ T細胞、活性化されたNK細胞、休止中の肥満細胞の減少とともに、M0マクロファージの有意な増加が特徴的な独特の微小環境が明らかになりました。

M0マクロファージは未コミットのプールであり、酸化LDLを容易に内部化し、発泡細胞に分化することができる。これは初期動脈形成の特徴である²⁹。疾患群で観察されたM0マクロファージの割合が高いことは、これらの前駆体細胞がプラーク微小環境内に蓄積していることを示しています。CCL4は主に活性化されたマクロファージとT細胞によって産生され、NFκBシグナル伝達経路を通じてマクロファージの活性化を維持し、接着分子の発現を促進し、マトリックスメタロプロテイナーゼ-2および-9を誘導することで、M0マクロファージをプロアテローゲン状態へ移行させ、プラークの安定性を直接損なう持続刺激として機能します³⁰.CD8⁺ T細胞の割合の減少は、CCL3媒介によるアテローム保護T細胞サブセットの抑制を反映している可能性があります。Komissarovらは、T細胞がヒトの動脈硬化性プラークへの移動が主にCCR5-CCL3軸³¹を通じて行われることを示しました。さらに、DöringらはCCL17がCCR8を通じてCCL3発現を誘導し、それが調節T細胞の分化を抑制する非標準的な経^{路を発見しました} 。CD4⁺ T細胞におけるCCL3の遺伝子除去はFoxP3⁺ Treg数を増加させ、動脈硬化を制限しましたが、CCL3投与は疾患を悪化させ、Tregの分化を抑制しました。この変化は動脈保護CD8⁺調節T細胞を減少させ、病原性エフェクターT細胞を促進し、本分析で観察されたCD8⁺ T細胞の割合の純減少をもたらしていると考えられます。活性化されたNK細胞と安静中の肥満細胞の減少は、これらの集団の絶対的な喪失ではなく、活性化状態の変化を反映している可能性が高いです。Bonaccorsiら³³ は、症状のある頸動脈プラークがNK細胞浸潤およびIFN-γ産生の増加を示し、NK細胞の活性化と臨床的なプラーク不安定性を直接結びつけていることを報告しました。肥満細胞に関しては、Wezelら³⁴ が活性化した肥満細胞から放出されるケモカイン、特にCXCL1がCXCL1/CXCR2軸を介して好中球の募集を誘導し、進行中の炎症反応を悪化させ、プラークの進行と不安定化を促進することを示しました。したがって、活性化されたNK細胞と安静中の肥満細胞の割合の減少は、真の数値的減少というよりも、炎症性プラーク環境内での活性化、脱顆粒化、または枯渇を反映している可能性が高いです。

この研究にはいくつかの限界があります。まず、この研究はトランスクリプトームシーケンスのみに基づいており、サンプルサイズが小さいため制限されています。サンプル数の制限を超えて、RNA-seqプロトコルにはいくつかの技術的制約があることにも注意が必要です。バルクRNA-seqは細胞の異質性を隠します。CCL3、CCL4、CXCL1の細胞型特異的発現を解明するには単一細胞アプローチが必要です。計算免疫脱畳み込み(CIBERSORT)は推定値のみを提供し、直接的な測定は提供しません。RNAの存在量は必ずしもタンパク質レベルと相関しているわけではありません。直交検証が必要です。今後の研究では、単細胞トランスクリプトミクス、より大規模かつ独立したコホート、直交タンパク質の検証を用いてこれらの制限に対処すべきです。

結論として、本研究結果は炎症因子がAPの病態生理過程に果たす重要な役割を強調しました。さらに、CCL3、CCL4、CXCL1というハブ遺伝子を特定し、これらはM0マクロファージの蓄積を促進し、保護T細胞のサブセットを抑制し、NK細胞および肥満細胞の活性化状態を変化させることで動脈硬化を促進する協調したケモカインネットワークを形成する可能性があります。総じて、これらの発見は3つのケモカインがプラーク免疫微小環境の重要な調節因子であり、治療対象となる可能性を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリゾル	インビトロジェン	15596026CN	RNA抽出
ナノドロップND-2000分光光度計	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	ND2000	RNA濃度検出
Agilent 2100バイオアナライザー	アジレント	G2939BA	RNA品質管理
イルミナ HiSeq TM 2000	イルミナ	HiSeq 2000	トランスクリプトームシーケンス
オリゴD(T)磁気ビーズ	ニューイングランド・バイオラボ	S1550S	RNA濃縮