中和抗体価測定のための肝炎Eウイルス蛍光減少中和検査

Summary

非細胞病理性陽性鎖RNAウイルスであるHepatitis Eウイルス(HEV)に対する標準的なウイルス中和アッセイは利用可能ではありません。ここでは、蛍光標識ウイルスカプシドタンパク質の定量に基づく蛍光還元中和試験(FRNT)を記述し、抗HEV抗体の有効性を評価する方法を紹介します。

Abstract

ウイルス中和アッセイは、対応するウイルスに対する抗体または抗体混合物の中和ポテンシャルを測定します。これはウイルスに対して開発されたワクチン候補や中和抗体の有効性を評価するための貴重な技術です。プラーク減少中和検査(PRNT)は、ウイルス特異的中和抗体の抗体価を評価するための一般的な方法です。しかし、非細胞病理性ウイルスの場合、PRNTは実現可能ではありません。肝炎Eウイルス(HEV)は、 ヘペウイルス科に属する陽性の単鎖RNAウイルスです。これは世界中の急性ウイルス性肝炎の主な原因です。哺乳類の細胞培養では細胞病理的な効果は示されません。中国ではHEVに対するワクチンが利用可能です。しかし、HEVに対するワクチンや治療用抗体は世界のほとんどの地域で利用できません。複数の研究所がHEVに対するワクチン候補の開発に取り組んでいます。HEVワクチンの有効性を測定するための中和アッセイは、研究者にとって非常に有用なツールとなるでしょう。ここでは、抗HEV抗体の50%中和定価(NT₅₀)を推定するための蛍光還元中和試験(FRNT)について説明します。抗HEV ORF2中和、またはウサギIgG中和HEVがHuh7細胞への感染に用いられ、その後ウイルスのORF2タンパク質に免疫蛍光染色が施されました。ImageJアプリケーションで蛍光陽性細胞が定量化され、NT₅₀ は2.1 x 10³と推定されました。この方法は、免疫マウス血清、HEV回収された個別血清、実験室で製造された抗HEV抗体に含まれる抗HEV抗体の_NT50 を推定するために応用できます。

Introduction

肝炎Eウイルス(HEV)は、ヘペウイルス科^1,2に属する陽性の単鎖RNAウイルスです。通常は自己制限型急性肝炎を引き起こしますが、免疫抑制状態の人には慢性肝炎を引き起こすこともあります^3,4。妊婦は激しい肝不全を発症する高リスクがあり、死亡率は最大30%に上昇します^5。世界保健機関(WHO)は、2021年に世界で約1,947万人の急性E型肝炎(AHE)症例と3,450人の死亡を報告^{しました。}HEVは主に衛生状態の悪さから汚染された食品や水を通じて発展途上国で伝播し、先進国では生肉や加熱不足の肉の摂取に関連して散発的な職業感染が^{発生します。}HEVは8つの遺伝子型に分類されます。遺伝子型(g)1-およびg2-HEVは人間にのみ感染します。g3-およびg4-HEVは、人間、ウサギ、豚、イノシシ、シカなど幅広い宿主を持っています。g5-およびg6-HEVはイノシシに感染し、g7-およびg8-HEVはラクダに感染します。中東ではラクダ肉と牛乳の摂取によるg7-HEVの人体感染例が1件報告^{されています。}HEV感染は主に低〜中所得国で一般的です。南アジアおよび東南アジア、アフリカ、メキシコの風土病地域では、主にg1感染によって引き起こされ、g2-HEV感染による頻度は低く、水系感染が報告されています。ヨーロッパや東アジアの先進国における職業性散発感染症例は主にg3-HEV ^6,7によって引き起こされます。

HEVゲノムは7.2 kbプラス鎖RNAで、5′端に7-メチルグアニンキャップ、3つのオープンリーディングフレーム(ORF)、続いてポリアデニル化3'端を含みます。ORF1は非構造的多タンパク質をコードしており、7つの異なるドメインから成ります:メチルトランスフェラーゼ(Met)、Yドメイン、パパン様システインプロテアーゼ(PCP)、Vドメイン、マクロドメイン(Xドメイン)、ヘリカーゼ(Hel)、およびRNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRp)。ORF2はウイルスのカプシド組み立てを担うカプシドタンパク質をコードします。ORF3は、ウイルスの排出を助けるビロポリンとして作用するリンタンパク質をコード^{しています。}g1-HEVには追加のオープンリーディングフレームであるORF4があり、これはキャップに依存しない機構 で 翻訳されます。これはORF1内に位置する内部リボソームエントリー部位類似要素を用いて翻訳されます。ORF4の発現は小胞体ストレス誘発化合物によって強化されます。ORF4はg1-HEV複製複合体アセンブリ¹⁰を促進することが提案されています。

HEVはvitroで効率的に複製しませんが、肝炎E患者から分離された一部のウイルス株は肝細胞、肺細胞株、大腸上皮細胞株¹¹で成功裏に増殖しました。しかし、培養細胞内でウイルスを強健に増幅させるのは困難です。感染性cDNAクローンのg1-HEV(Sar55株)はin vitro研究に用いられていますが、培養細胞内での効率的な生成と増殖はまだ達成されていません。一部のg3株およびg4-HEV株は培養細胞でより良く成長します¹²。しかしながら、in vitroで転写されキャップ付きp6 HEVゲノムRNAを導入した細胞から得られる精製ウイルスは、複数アッセイに十分ではありません。さらに、細胞培養で生成されるすべてのHEV粒子は準包覆されており、感染力に影響を与えます。対照的に、汚染された食品や水に含まれるHEVは包膜がなく、非常に感染力があります。患者の便中に存在するHEVは包膜を持たず、自然感染の一般的な原因です。したがって、患者の糞便から精製されたHEVを使用することで、哺乳類細胞培養系における効率的な感染が保証されます。私たちの以前の研究では、患者の糞便で精製されたg1-HEVがヒト肝腫瘍細胞内のウイルス複製を定量化する信頼性を示しました(Huh7)。-80°Cで保存された精製ウイルスは数年間感染力を保持し、ウイルスの複製推定のために複数の独立した研究で用い^{られています。}本研究では、患者から得られた精製されたg1-HEVを用いたHEV中和アッセイを設計しました。ウイルスは精製、タイターリング、特性評価を受け、-80°Cのアリコートに保存され、将来の中和アッセイ用に備えました。HEVは非細胞病理性であるため、従来のPRNT法は抗HEV抗体のウイルス中和ポテンシャルの推定には有用ではありません。HEVに対する中和アッセイの開発はいくつか試みられており、フローサイトメトリーを用いた中和アッセイ、抗原ELISAキットを用いた中和アッセイ(細胞上清液に分泌されるpORF2を検出)、in vitro ELISAベースの結合アッセイ、RT-PCRベースのアッセイ、そして蛍光を用いた中和アッセイ16,17,18,19,20などが含まれます.ELISAベースのアッセイは、ウイルスの機能的中和を評価するために抗体結合を間接的に検出しますが、実際の感染は測定できません。フローサイトメトリーに基づく手法は通常、偽ウイルスを用いて感染細胞の割合を測定します。RT-PCRベースの中和法はFRNTよりも複雑です。したがって、ハンドリングエラーの可能性は高くなります。一方で、ここで説明するFRNT法は高抗体価の感染ウイルスや画像診断能力の利用可能性によって制限されています。それでも、抗HEV抗体のNT₅₀を測定する効率的な方法です。

Protocol

機関倫理委員会(IEC)は、ニューデリーのAIIMS消化器科に入院したHEV感染患者の便サンプル採取の許可を得ました。研究に参加した患者からインフォームド・コンセントが得られました。試薬および使用機器の詳細は 材料表に記載されています。

1. ウイルスの分離と定量化

1. 同意のもと、HEV感染患者の糞便サンプルを採取し、ウイルスの精製を行います。
2. 糞便サンプルを最終濃度10%(w/v)でドゥルベッコのリン酸緩衝塩水(DPBS)に再懸浮させ、遠心分離機で7800 x g で4°Cで1時間かけます。
   注意:HEV糞便サンプルの取り扱い時は手袋を着用し、作業後は作業エリアを70%エタノールで清掃してください(すべての手順はバイオセーフティキャビネット内で行う)。
3. 上清液を採取し、0.45μmフィルターに通します。
4. ウイルス上清液に0.4 MのNaClで調製した8%PEG6000を加え、0°Cで16時間培養します。
5. サンプルを18,000 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
6. 上清液を取り除き、ペレットを40mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に再懸浮させます。
7. 30 kDaの膜カートリッジを用いてタンジェンシャルフローろ過(TFF)により懸濁液を5 mLの容量に濃縮します。バイオセーフティキャビネット内の0.2μmフィルターでろ過し、アリコートを作って-80°Cで保存します。 1つのアリコートを使って全RNAを単離し、RT-qPCRを行います。
8. pSK-HEV2プラスミド[g1-HEVの感染性クローンのcDNAを含むpBluscriptベクター(Genbank ID: AF444002.1])(10倍連続希釈で1 ngから0.000001 ng DNA/反応)を複数希釈して、ウイルスRNA定量の標準をプロットします。
9. x軸にpSK-HEV2 DNAの量、Y軸に対応するCt値をグラフにプロットします。標準プロットからウイルスRNAの濃度を推定します。
10. 標準プロットからHEVゲノムRNAレベルを定量化し、次の式でウイルスのゲノムコピー数を計算します:コピー数 = ng*(数/モル)/塩基 *(ng/g)*(g/モル数の塩基)。

2. Huh7細胞のg1-HEV感染

1. Huh7細胞を含むT75フラスコを用意してください。顕微鏡で細胞が一体化して健康かどうかを確認しましょう。
2. 吸気器でメディアを除去します(バイオセーフティキャビネット内のすべての手順を実行します)。10mLのDPBSを加え、渦巻きながら取り出します。
3. 0.05%トリプシン溶液を1mL加え、表面に均等に広げます。
4. _CO2インキュベーター内で30〜60秒培養し、細胞が90%剥離するまで待機します。
5. 完全な培地5mLを加え、T75表面全体に均等に広げ、複数回ピペットで均一な単細胞集団を作り、凝集体の少ない状態にします。
6. 細胞懸濁液を50mLの円錐形チューブに移し、室温で200 x g の遠心分離機で5分間浸します。
7. バイオセーフティキャビネット内の円錐形チューブから培養培地を吸引します。
8. チューブに5mLの完全な培地を加え、優しくピペッティングして細胞を均一な懸濁状態に懸浮させます。
9. 10μLのセル懸濁液を取り、セルカウンタースライドに置きます。細胞を4つの象限に分けて数え、平均/mLを計算します。
10. 2 mL DMEM(10% FBSを補給)に、6ウェルプレートの^6セル/ ウェル0.5×10個のシード。
11. 翌日、培地を取り出し、1 mLのDPBSで洗浄し、50 μL g1-HEVウイルス(精製されたg1-HEVの4.5 ×⁴ゲノムコピーに相当)を1 mLの血清フリー培地(SFM)に加えます。
12. 細胞を5%_CO2 インキュベーターで37°Cで1時間培養します。
13. 細胞を500μL DPBSで洗浄し、その後2mLの完全培地(DMEMに2%のFBSを添加)を加えます。
14. 細胞を5%_CO2 インキュベーター、37°Cで72時間培養します。
15. 下流のアッセイに進みます。

3. RT-qPCRアッセイ

1. 6ウェルプレート(ステップ2.15のもの)から培地を取り出し、細胞を1 mL DPBSで洗浄します。
2. 6ウェルプレートに直接1mLのTRI試薬を加えて細胞を溶解します。溶解液をピペットで上下に数回動かし、その後1.5mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。
   注意:TRI試薬は吸入、飲み込み、または皮膚に触れると有毒です。試薬使用時は保護用の手袋を着用し、蒸気の吸入を避けてください。できれば化学フードの内側で使うのが良いでしょう。すべてのプラスチック製品はRNAseフリーグレードであるべきです。
3. 試料を室温で5分間培養します。クロロホルム0.2mLを加え、チューブをしっかりとキャップし、その後10〜15秒ほどボルテックスします(クロロホルムは有害かつ有毒なので、適切なPPEで取り扱ってください)。2〜3分間孵化させます。
4. サンプルを12,000 × g 、4°Cで15分間遠心分離します。 水相を新しい1.5 mLのマイクロ遠心分離機チューブに移します。水相にイソプロパノールを0.5mL加え、チューブを数回逆さにしてよく混ぜます。
5. 室温で10分間孵育します。
6. 遠心分離機で12,000 × g 、4°Cで10分間。 上清液は捨てる。
7. ペレットを1 mLの75%エタノールに再懸濁させます。遠心分離機で7500 g 、4°Cで5分間× 上清液は捨てる。
8. RNAペレットを5〜10分間自然乾燥させます。
9. ペレットを50μLのヌクレアーゼフリー水(NFW)に再懸濁し、55°Cで10分間培養し、手でタッピングして混合し、分光光度法でRNA濃度を測定します。
10. 以下のプライマーを用いてTaqManプローブベースのワンステップRT-qPCRを実行します。
    g1-HEV FP:5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP:5フィートTATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEVプローブ:5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGGGGAATCACC [BHQ1]3′;リボヌクレアーゼ P(RP) FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP:5フィートGAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RPプローブ:5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGGCG[BHQ1]3′。
11. 2^−ΔΔCT 法を用いてg1-HEV RNAの相対定量を計算します。

4. 免疫蛍光アッセイ(IFA)

1. 前の手順で説明したようにHuh7セルを分割します。
2. 顕微鏡用ガラスカバースリップを12ウェルプレートに置き、1mLの完全培地(DMEMに10% FBSを補足)に0.2 ×⁶ セル/ウェルをシードします。
3. 精製されたg1-HEVのゲノムコピー1.8×10 4コピーを500 μL SFMで細胞に感染させます。細胞を5%_CO2インキュベーターで37°Cで1時間培養します。
4. 細胞を500μLのDPBSで3回洗浄します。
5. 完全な培地2mL(DMEMに2%FBSを補足)を加えます。
6. 細胞を5%_CO2 インキュベーター、37°Cで72時間培養します。
7. 細胞を500μL DPBSで3回洗浄し、それぞれの洗浄の間に室温で5分間培養します。
8. 細胞に500μL、4%のPFA(パラホルムアルデヒド)を加え、室温で20分間培養します。
   注意:4%のPFAは吸入すると有害で、皮膚や目の刺激を引き起こし、アレルギー性の皮膚反応を引き起こす可能性があります。安全のために、試薬使用時は保護手袋と目の保護具を着用し、蒸気の吸入は避けてください。
9. 細胞を500μL DPBSで洗浄し、3回各5分間洗浄し、DPBSで30分間インキュベートします。
10. 細胞に250μLのブロッキング溶液(5%ノイマルゴート血清、0.5%BSA、0.3%トリトンX-100(DPBS)を加え、室温(RT)で1時間培養します。
11. ブロッキング溶液を取り出し、500μL DPBSで1回洗浄し、細胞を250μL一次抗体(DPBS、0.3% Triton X-100、5% BSA、0.5% Normal Goat Serrum、抗ORF2抗体またはウサギIgGの1:500希釈)で4°Cで一晩培養します。
12. 細胞を500μLのDPBSで3回、各5分間洗浄します。
13. 細胞をRTで1時間、RTで二次抗体(DPBS、0.3% Triton X-100、5% BSA、0.5%ノーマルヤギ血清、1:1000希釈したヤギ抗ウサギAlexa fluor 594抗体)で1時間インキュベートします。
14. 細胞をDPBSで3回、それぞれ5分間洗います。ガラススライドにDAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニリンドール)溶液を含むProlong金アンチフェード試薬10 μLを加えます。カバースリップを含むセルを、ガラススライド上でDAPI溶液に向かって装着し、気泡を避けます。
15. カバースリップをネイルペイントで封印してください。
16. 60倍対物レンズを持つ共焦点顕微鏡で蛍光画像を取得します。
17. 蛍光信号の可視化と取得のために顕微鏡をセットします。
18. まず、未感染のモック細胞に対応するスライド内の核を60倍の倍率で集束します。閾値電圧とレーザーを調整し、背景蛍光信号が見えないようにします。対照抗体(ウサギIgG染色スライド)を確認し、背景蛍光信号が見えないことを確認してください。
19. 上記のパラメータを変えずにHEV感染細胞のスライドを可視化します。1028×1028ピクセルの画像を取得します。

5. 蛍光還元 中和試験(FRNT)

1. Huh7細胞のウイルス中和と感染
   1. 前の手順で説明したようにHuh7セルを分割します。カバースリップを12ウェルプレートに置き、1mLの完全培地(DMEM + 10% FBS)に0.2 ×^10個6 セル/ウェルをシードします。
   2. 翌日、抗体(抗ORF2およびウサギIgG)をSFMで10倍の連続希釈液で、抗体の初期濃度を1:10から1:10 5の希釈まで、25 μg/mLで準備します。希釈液の最終体積は100μLであるべきです。
   3. 各抗体希釈に、精製されたg1-HEVに相当するゲノムコピー1.8×10を4コピーに加えます。
   4. 抗体とウイルスの混合物を5%_CO2 インキュベーター、37°Cで1時間培養します。
   5. 前日にシードされたHuh7細胞を含む12ウェルプレートを取り出し、500μL DPBSで細胞を洗浄します。
   6. 抗体ウイルス混合物を細胞に加え、プレートを5%_CO2 インキュベーターで37°Cで1時間放置します。
   7. 細胞を500μL DPBSで洗浄します。
   8. DMEM+2%FBS培地を細胞に加え、プレートを5%_CO2 インキュベーターで37°Cで72時間培養します。
   9. 第4節(ステップ4.7以降)で述べられているIFAを実行します。
   10. 10倍対物レンズを用いて1028×1028ピクセルの5つのランダムフィールドの蛍光画像を取得します。
   11. 画像はJPEG/TIFF形式で保存してください。以下に説明するImageJ解析を用いて蛍光スポットを定量化します。
   12. ImageJの画像を解析するには、RGB画像を8ビット画像に変換します。 画像をクリックして>8ビット>入力してください。
   13. 画像の閾値を調整します。 画像をクリックして>しきい値を調整>。下限閾値を40、上限閾値を255に選びます。
   14. カウントする場合は「 分析>粒子解析」を選択してください。表示結果、結果のクリア、要約、エッジの除外、複合ROIを選択します。マネージャーに追加をオフにし、穴を含めてオーバーレイしてください。OKを押すと蛍光スポットカウントが表示されます。
2. NT₅₀の推定値
   1. 各希釈の中和率を以下の式で計算します。
      中和率=100-(希釈中のORF2陽性細胞)⁄(ウイルス制御中のORF2陽性細胞))×100]
   2. NT₅₀ は以下の式で計算します。
      log₁₀(NT₅₀) = log₁₀D1+(50-N1 ⁄ N2-N1) X (log₁₀D2-log₁₀D1)
      ここで、D1 = 希釈で中和率が50未満になる場合
      D2 = 希釈率で中和率が50を超える場合
      N1=50未満の中和率
      N2=50を超える中和率
   3. Log₁₀ NT₅₀ のアンティログを式で計算します:
      NT₅₀=10^{対数₁₀(NT₅₀)}
   4. すべてのフィールドの(平均±SD)のグラフをプロットします。

Results

Huh7細胞のg1-HEV感染とウイルスの特徴解析

g1-HEVは糞便サンプルから一連のステップを経て分離されました(図1A参照)。精製されたg1-HEVのゲノムコピー数はRT-qPCRで推定され、その後-80°Cで保存されました。 ウイルス感染と複製を確認するために、Huh7細胞に精製されたg1-HEVストックの1.8×10⁴ ゲノムコピー相当物を72時間感染させ、その後RT-qPCRおよびIFAを投与しました。感染細胞では、模感染細胞と比較してg1-HEV RNAの有意なレベルが検出されました(図2A)。同様に、抗ORF2抗体を用いたIFAは感染したHuh7細胞でORF2発現を確認しました(図2B)。

蛍光還...

Discussion

FRNTは、抗体の中和能力を推定するための免疫染色に基づく手法です。デング熱ウイルス(DENV)、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)、日本脳炎ウイルス(JEV)など複数のウイルスに対する抗体のNT₅₀値を推定するために用いられています23,24,25。この方法では、ウイルスをテスト抗体(またはセラ)で培養し、その後培養細胞に混合液を感染させます。感染した細胞は、ウイルスの複製を検出できるように、かなりの時間培養されます。最後に、細胞はウイルス特異的抗体で免疫染色されます。感染細胞の割合を定量化し、並行処理された抗体ウイルス感染サンプルと比較します。検査抗体がウイルスを中和すると、感染細胞の割合が減少し、検査抗体の中和能力を反映します。全体として、ウイルスと抗体濃度、感染後の潜伏期間の調整によってアッセイの最適化が必要です。さらに、この方法...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mLマイクロフュージチューブ	アクシゲン	MCT-150-C
12ウェル細胞培養皿	コーニング	3512
37度インキュベーターシェーカー	サーモ・サイエンティフィック	50163013
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルリンドール	アブカム	AB104139	ダピ
50mL遠心分離機チューブ	ファルコン	352070
6ウェル細胞培養皿	コーニング	3516
Alexaフラワー594二次IgG抗体	サーモ・サイエンティフィック	A-11012
抗ORF2抗体	生成本	NA	Genscriptによるカスタム合成で、当研究所で解析14
抗ウサギIgG抗体	生成本	NA
牛血清アルブミン	ヒメディア	MB083	BSA
共焦点顕微鏡	オリンポス	FV3000
DMEM、高血糖	ヒメディア	AL007A
胎児用牛血清	GIBCO	16000-044	FBS
イメージJ 1.54g	ImageJ.org(ウェイン・ラスバンドおよび寄稿者、NIH、アメリカ)
普通のヤギ血清	ヒメディア	RM-10701
パラホルムアルデヒド	ヒメディア	GRN3660	PFA(顔色発射法)
リン酸バッファー生理食塩水pH 7.4	ヒメディア	TL1006	PBS
ポリエチレングリコール 6000	シグマ	81255	PEG6000
SOLIScript 1ステッププローブキット	ソリス・バイオダイン	08-57-00250
TRI試薬	分子研究センター	TR118
トリトンX100	シグマ	X100
トリプシン-EDTA	GIBCO	25300-54