Ambystoma mexicanumモデルにおける頭蓋顔面組織再生研究のための下顎損傷モデルの設計と標準化

サマリー

本研究の目的は、頭蓋顔面組織再生の研究のために 、Ambystoma mexicanum における下顎の完全横断術を安全かつ再現性の高い外科的アプローチの標準化することでした。

要約

頭蓋顔面複合体は、人間において発達奇形、外傷、がんなどの病理によって影響を受け、影響を受けた組織の喪失を引き起こす解剖学的領域です。これにより、失われた組織を再生するための戦略を模索する必要性が生じます。これにより、再生種における損傷した頭蓋顔面構造の再生応答を組織する細胞および分子メカニズムの研究が促進されており、Ambystoma mexicanum(A. mexicanum)は特に注目されている種です。

上記に従い、アホロートルの顎において再現可能な外科的病変モデルが設計・標準化され、損傷組織の再生反応を研究し、人間で行われるような重大な欠損をシミュレートしました。したがって、身長12〜15cmの幼体・成体動物に0.1%トリカインで20〜30分間麻酔されました。その後、下顎の遠位3分の1、シンフィシールおよび副交尾部を含む4人手技術を用いた完全な横断術が行われ、歯骨やメッケル軟骨に対応する骨格構造、筋肉、結合組織、神経、皮膚などの軟組織を除去しました。その後、骨の残存物を規則化し、0.5%スルファメラジンを適用しました。組織反応はマクロ鏡的および透膜化の両方で評価されました。実施されたすべての処置はコロンビアのアンティオキア大学の動物実験委員会の承認を受けました。結果は、切断された動物が切断された頭蓋顔面構造を形態学的、構造的、機能的に再生できることを示しています。

非常に重要なのは、この研究が再生組織の収集が必要な切断および再切断動物の100%生存率を持つ再現可能な手術技術を提供している点です。したがって、この外科設計は、頭蓋顔面構造の再生が可能な他の脊椎動物との比較解析を行い、将来的にこの再生反応の細胞および分子メカニズムを研究するための基本的な入力となります。

概要

組織、臓器、複雑な構造の再生能力は動物界全体で広く記述^{されています。したがって}、これらの種が四肢や尾などの付属肢内の様々な構造の損傷や切断後に再生反応をどのように活性化し調節するかを理解することが^{、再生生物学}の研究において注目の的^{となっています。}

この研究に非常に関連するのは、頭蓋顔面組織再生の研究も世界的に重要な関心分野となっていることです。なぜなら、この解剖領域は顔面外傷、頭蓋顔面の発達障害、感染症、^{口腔がんを含む}腫瘍病理に強く影響を受けているからです。腫瘍が存在する場合、顎や他の顔面領域の構造物や広範囲の組織の切除が必要であり、その結果、影響^{を受けた部位の}再建と修復促進の必要性が生じ^ます。その結果、近年では、低再生能力を持つ種(例えばヒト)において、これらの組織の再生応答を高める細胞的・分子的メカニズムを探求・特定する必要性から、頭蓋顔面組織再生の研究が拡大^{しています。これにより}、顎などの頭蓋顔面構造を再生できる動物モデルを用いて、顎に小さな病変や重大な欠損が生じた後の再生反応に関与するメカニズムを探り、解明するようになりました¹⁵。

下顎切断に関する過去の研究では、異なる種がこの構造を再生する能力に挑戦する様々な外科的アプローチの設計が強調されています¹⁶。ゼブラフィッシュの場合、顎の遠位3分の1および顎への外側接近での横断により、切断された部分が形態学的および組織学的に回復する再生反応が明らかになりました(^17,18)。一方、Notophthalmus viridescensのような両生類の先駆的研究では、舌や切断面の咽頭器官などの構造を含む下顎の横断後、歯骨、筋肉組織、歯などの失われた組織が再生できることが示されています。しかし、舌構造および咽頭器官は再生できません^19,20。それでも、同じ種の切断面に舌と咽頭器官が含まれていない場合、すべての再生組織は切断組織の形状と構造を再現します^21,22。さらに、切断面に舌を含まないCynops pyrrhogaster種の横断切断は、切断された下顎構造の再生反応を示します²³。他の研究では、Ambystoma maculatum、Desmognathus fuscus、Plethodon cinereus、Eurycea bislineata、Ambystoma opacumなどの種では、下顎近位3分の1の完全切断や下顎側の外側後退が損傷組織における再生反応を促進することが示されています(^24,25)。これは両生類において、切断面に関わる組織の設計や範囲によって再生反応の成功率が異なることを示しています。

一方、再生反応のメカニズム研究の参考文献として用いられる両生類のモデル種の一つが、ウロデレ両生類A. mexicanum^26,27です。以前の報告では、このモデルが口底の軟組織、歯骨、メッケル軟骨、筋肉および歯の構造(^28,29,30,31)などの頭蓋顔面構造を再生できることが示されています。これらの発見は、口底へのパンチ損傷、歯および一部の歯の切除、そして下顎骨28,29,30,31の側面切断を特徴とするより広範なアプローチなど、さまざまな外科的アプローチによるものです。しかし、これまでのところ、左右の半端骨の遠位領域、さらに歯骨、メッケル軟骨、完全な下顎結合、両側の歯および筋肉組織を含む重大な欠損を同時に生じさせる完全な横断手術法は報告されていません。

したがって、本論文では、切断組織の再生反応を手術対象動物で100%の生存率でモニタリングできる、A . mexicanumの顎の完全な横切断を行う段階的なプロセスを説明しています。さらに、この種の切断方法の詳細が不足しているため、本外科ガイドは、この種および他の種の形態学的、組織的、細胞的、分子レベルで比較解析を行う研究者に対し、この種の手術アプローチの再現性を確保することを目指しています。また、下顎の側面切断を含む他のアプローチも含まれます。最終的に、本研究はこれらの構造の再生応答を促進する将来の分子を特定する基盤を提供し、頭蓋顔面組織再生医学への応用が期待されています。

プロトコル

このプロジェクトで使用されたモデル生物は、メキシコのソチミルコ固有種であるサンショウウオ(A. mexicanum)です。この動物コロニーは、2014年にケンタッキー大学のアンビストマ遺伝資源センターから親サンショウウオを輸入して法的に設立され、現在32頭の親と200頭以上の幼獣がいます。すべての処置は、2023年3月27日のアンティオキア大学動物実験倫理委員会(UdeA)により承認されており、1989年の法律84章や1993年のコロンビア保健省決議8430のタイトルVなど、動物実験に関する国内外の倫理基準を考慮し^{ています。}

1. 動物の取り扱い

注:このプロトコルの標準化には、全長約12〜15cmで野生の表現型を持つ動物が使用されました。ただし、小型動物や他の表現型を持つ動物は除外されません。

1. アホロートルは鼻から尾まで約12〜15cmの長さを選びます。
2. アホロートルを個別に、動きやすい大きさの容器に入れ、理想的には透明で長方形の容器に入れます。
3. 手術前に動物を20%ホルトフレター溶液で19°Cから21°Cの温度に保ち、明暗サイクルを経ます(12:12)。
   注意:可能な限り、処置の24時間前には過剰給餌を避けてください。これは嘔吐の発作を防ぐためです。

2. 下顎遠位3分の1の完全横断

1. 動物の麻酔準備および術前準備
   1. 0.1%トリカインメタンスルホン酸麻酔液を準備します:トリカインメタンスルホン酸1g、100 μLの1 Mエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)、pH 7.5、50 μL 0.5%フェノール赤、最大1 Lの40%ホルトフレター溶液を混ぜます。pHをNaOHで7.5に調整します。
   2. すべての滅菌顕微外科器具(はさみ、鉗子、ピンセット、7Aヘラ、1.5 mLチューブ、ディニメーター、パスツールピペット、ペトリ皿、プラスチックトレイ)を準備し、後で手術予定の動物を置く準備をしてください。
   3. 作業エリアを70%の消毒アルコールで清掃し、直射光を手術部位に適切に配置してください。
2. アネステジア
   1. アホロートルを約500mLの0.1%トリカインメタンスルホン酸麻酔液を入れた容器に20〜30分間入れ、深部麻酔を確保します。
      注意:動物が麻酔液に完全に浸かっていることを確認してください。
   2. 全身麻酔の兆候を調べるために、エラの動きや触覚刺激への反応が全くないか確認してください。
      注意:顎の再生を監視するために、動物に麻酔をかけた後は、セクション4の手順に従い、立体顕微鏡で術前写真を撮影してください。
3. 顎の完全横断
   注意:切断は4人の手による技術、すなわち2人の外科医によるものを用いて、できるだけ慎重かつ迅速に行うべきです。
   1. 動物を慎重に仰向け(うつ伏せ)にプラスチックトレイに置きます。
   2. 切断対象の部位を、顎の外縁からこの構造の近位端、顎・結合領域の約2.5mmまで、キャリパー(歯内用歯科メーター)で測定します(図1A)。
      注:キャリパーによる測定は動物の皮膚(口外)に測定されます。
   3. 赤い蝋鉛筆で切断面の軌道と手術的欠損の範囲を印で示します。
   4. アホロートルを慎重に持ち上げ、片手でしっかりと握って、操作者の手から滑り落ちないようにしてください。
      注意:この操作は1人のオペレーター(オペレーター1)が担当し、もう1人のオペレーター(オペレーター2)が手術器具の取り扱いと切開の担当を担当します。
   5. アホロートルの頭部、特に手術対象の解剖学的領域に直射光を当てます。
   6. もう一方の手では、7Aスパチュラの丸みを帯びた幅広の側面を使って、舌を口底から切り離し、手術する顎の領域を切り離します。(図1B)
      注意:舌が上顎に少し重なっていることを確認してください。
   7. まず(オペレーター2)手術用鉗子で顎の外縁から皮膚や硬組織(歯骨、メッケル軟骨)を切開します(図1C)。
      注意:組織を切断・操作する際、よりコントロールしやすいように器具が十分に研がれていることを確認しましょう。
   8. 細かい外科用ハサミで横方向に切断を続け、切開部が最初の切開部位から反対側まで顎の全幅を横切り、計画された切断面(完全な横断)に従って顎の遠位組織を完全に切除します(図1D)。
      注意:より頑丈な顎を持つ大型のアホロートルの場合、骨格構造の切断をより清潔で外傷の少ないものにするために鉗子で切断面を仕上げることが推奨されます(図1E)。
   9. 残った軟部組織がすぐに後退する様子を観察してください(図1F)。
   10. 切断された組織を解離鉗子で採取し、必要な溶液とともに1.5mLのチューブに浸します。手順に従います。固定およびその後の組織技術または免疫蛍光のために4%パラホルムアルデヒド(PFA)、または後でトリゾールやRNAでRNAやRNAを用いてRNA、DNA、タンパク質抽出などを行います(図1F)。
       注:この組織は、組織学的観点から再生組織との比較、基礎遺伝子発現、または最終組織分化マーカーの検出のための非再生対照として使用できます。
   11. アホロートルを培養皿に入れ、立体顕微鏡で観察し、露出した骨や軟骨組織の縁を鉗子で再整形します。
   12. アホロートルを慎重にプラスチックトレイに戻し、0.5%スルファメラジン抗生物質の入浴を12時間かけます。

3. A. mexicanumの術後回復

1. 手術後、アホロートルを40%ホルトフレター溶液を塗った透明なプラスチック容器に入れ、全身麻酔による回復の兆候(えらの動き、正り反射、触覚刺激への反応など)を観察します。完全な回復には約30〜60分かかります。
   注意:40%ホルトフレター溶液は約4°Cから8°Cの温度で冷蔵保存してください。
2. 冷たい40%ホルトフレター溶液は少なくとも8日間、24時間ごとに交換してください。
   注意:最初の48時間は動物の回復において最も重要な時期なので、毎日観察する必要があります。
3. 処置から24〜48時間後に、捕まえやすく、動物にとって負担の少ない柔らかい食感の餌を与えてください。
   注意:手術後最初の24時間はアホロートルに餌を与えないでください。

4. 再生反応の画像取得およびモニタリング

注意:最近手術された動物の長時間の扱いを避けるため、すべての画像はできるだけ早く撮影してください。

1. 動物が完全に麻酔されたら、慎重に抱き上げて立体顕微鏡とペトリ皿のデジタルカメラに持って行き、切断前後の画像を取得します。
   注意:事前に70%アルコールで立体顕微鏡を清掃し消毒してください。
2. アホロートルの頭部を照らす入射ライトを使って顎の部分をよりよく観察してください。
3. アホロートルの体を片手でしっかりと支え、画像取得フィールドから滑り落ちないようにしてください。
   注意:実際のサイズの歪みを防ぐために水性培地での写真撮影は避けてください。液体なしのペトリ皿を使用してください。アホロートルを時折40%ホルトフレター液で軽く湿らせます。
4. 顎の部分を正しく識別し、適切に焦点を合わせてください。
   注意:処置後(フォローアップ)の数日間は、初期段階の組織再生は非常に微妙で、場合によってはほとんど気づかれないことがあるため、適切な焦点を合わせる必要があることを念頭に置いてください。
5. プログラムツール(コントラスト、明るさ、露出、ゲイン、ホワイトバランスなど)を調整して画像取得のパラメータを最適化します。
6. 立体顕微鏡(0.7倍)で画像を取得し、構造の再生を測定・監視します。
7. 再生期間が終わると、再生組織は先に報告されたプロトコル³⁴に従いアルシアンブルーとアリザリンレッドで染色されました。

結果

A. mexicanum²⁹のような種における頭蓋顔面構造の切断後の再生反応の研究の重要性と関連性を考慮すると、組織の再生反応を評価するだけでなく、手術を受ける動物の死亡率を低く、あるいはゼロに抑える安全かつ再現可能な外科技術が必要です。したがって、本研究は、A. mexicanumにおける2つの半端部(両側のシンフィシールおよびパラシンフィシール領域を含む)の最遠端部分を除去し、完全な横切断を伴う成功した外科的アプローチの標準化を提示します。

下顎横切断の標準化には、サイズと体重が類似した特徴を持つ野生型動物37頭が使用されました(図2A)。切断を行い、方法および推奨事項に記載されたガイドラインに従い、初めて手術を受けた動物の生存率は100%に達しました(図2B,C)。重要なのは...

ディスカッション

本論文では、 A. mexicanum 動物モデルにおける下顎の完全切断手術の成功例と、これらの構造の再生応答を監視し、再生過程を調節する要因の特定のためにこの外科モデルを再現するために必要ないくつかの提言を紹介します。

本研究では、A. mexicanumの下顎遠位3分の1に全身横断術が行われ、皮膚、真皮、歯、メッケル軟骨、筋肉(後顎間筋、前顎間筋、下骨舌骨筋を含む)を対象とした。同様に、いくつかの根本的な違いはあるものの、この種に対して他の外科的アプローチも行われている。Kramerらが外側下顎切断の外科的デザインを行った研究例が挙げ^られる。本研究では、切断は下顎結合の内側領域から始まり、メッケル軟骨、周囲の骨(歯骨)、表皮、緩い結合組織、^片側の筋肉組織のみが関与しました。切断組織の設計や範囲には外科的アプローチとの違いがありますが、両設計とも切除組織の再生反応が...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Axolotl (Ambystoma mexicanum)	Ambystoma Genetic Stock Center	N/A	15-18 cmと16 g - 22 g wildetype
Calcium Chloride dihydrate	Duksan	1098	CaCl2 2H2O
Digital camera MotiCAM 5	MotiCAM	https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf
EDTA - Sodium salt, dihydrate	Biobasic	EB0185	C10H14N2O8Na2 . H2O
Glass petri dish	any maker	N/A	ホウケイ酸ガラス
Magnesium Sulfate 7-hydrate	ITW Reagents	131404.1211	MgSO4 7H2O
Microsurgical instruments	N/A	N/A	鉗子、クランプ、7Aスパチュラ、デシメーター、はさみ
Pasteur pipette	any maker	N/A	低密度ポリエチレン
Potassium Chloride	Duksan	372	KCl
Red wax pencil	any maker	N/A
Sodium Chloride	Merk	K48297604 717	NaCl
Software Motic Images Plus-Versión 2.0	Motic	https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html
Stereo microscope	Olympus SZX16	N/A
Sulfamerazine sodium salt	Sigma- Aldrich	S0800	4-アミノ-N-(4-メチル-2-ピリミジニル)ベンゼンスルホンアミド
Tricaine methanesulfonate	Sigma- Aldrich	E10521	エチル3-アミノベンゾエートメタンスルホン酸塩
Tubes 1.5 mL	Axygen	MCT150C	純ポリプロピレン