方法論記事

小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムを用いた、合成K2Pチャネル記録のためのシングルチャネル電気生理学

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DOI:

10.3791/69903

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2026年10月9日

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1Department of Molecular Medicine, University of Pavia, 2Elements S.r.l.

この記事について

サマリー

本プロトコルでは、安定したシングルチャネル記録を行うために、増幅機能を統合した小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムの使用方法について説明します。本手法の実証として、精製された合成K2Pチャネルを再構成し、システムの性能を検証します。

要約

平面脂質二重層へのイオンチャネルの機能的再構成は、単一分子レベルでチャネル活性を調査するための戦略を提供します。しかし、従来のMontal–Mueller二重層システムは、通常、かさばる実験装置、手動でのチャンバー組み立て、および比較的大きな記録容量を必要とし、それが試薬消費量の増加を招くだけでなく、配線の延長や外部ヘッドステージによる電気的ノイズの追加要因となる可能性があります。本研究では、小型アンプを統合し、試薬消費量を抑え操作を簡略化した、安定した単一チャネル記録が可能な小型で即時利用可能な二重層プラットフォーム（BLMchipMM）を提示します。本プロトコルでは、単一チャネル電気生理学的測定を行うための本システムの利用方法について説明します。本システムを用いて、合成K2Pチャネル（ancTREK1）を再構成し、再構成および単一チャネル記録を検証するための原理実証テストタンパク質として使用しました。単一チャネル記録の結果、Mg2+フリーの対称K+溶液において電流-電圧関係が示され、そのコンダクタンス値はTREK1チャネルについて報告されている値と一致しました。このK2P様チャネルの再構成に成功したことは、人工膜における単一チャネル解析に対する本システムの有用性を実証しています。

概要

ブラックリピッドメンブレン（BLM）としても知られる、人工脂質二重層膜へのイオンチャネルの再構成は、単一分子レベルでイオンチャネルの電気生理学的特性を解析するための確立された手法の一つである1。BLMの利点はその構造に由来する。実際に、平面脂質二重層（PLB）は非極性表面の細孔内に形成され、2つの液体溶液を隔てている。これにより、生物学的膜を模倣することで、膜の脂質組成や電解質または化合物濃度などの高度に制御された条件下で、かつ両側からアクセス可能な状態でイオンチャネルの活性を記録することができる。このアクセスのしやすさにより、例えばミセル溶液から、あるいはリポソーム誘発融合による、イオンチャネルの直接的な挿入が可能となる2,3。

最初に記述された人工膜システムはペインティング法4を用いて作成されたもので、不揮発性有機溶媒に溶解した脂質の液滴を、絵筆で小さな開口部に塗布する方法である。その後、開口部の両側に水溶液を加えることで、脂質二重層が自発的に形成される。しかし、この方法の大きな欠点は、溶媒の痕跡が残留し、それが膜の特性に影響を及ぼす可能性があることである。脂質二重層内の残留有機溶媒量を減らすために、フォールディング法5が開発され、「溶媒フリー」のBLMの形成が可能となった。この手法では、揮発性溶媒中の脂質溶液を水面に広げて2つの単分子層を形成させ、開口部上の水相の液位を徐々に上げることで、これらの脂質単分子層が開口部に向かって折りたたまれ、二重層が形成される。しかし、得られたBLMは溶媒フリーと定義されているものの、二重層形成を成功させるには、開口部を不揮発性溶媒の薄い層で前処理する必要がある。これらの実験に必要な核心的な要素は、小さな開口部（直径 50–250 µm）を持つ親油性セプタムによって、2つの水相区画（通常、cis側およびtrans側と呼ばれる）に仕切られた記録室である（Figure 1）。各区画には銀/塩化銀（Ag/AgCl）電極が挿入される。これらの電極を電解質溶液に浸すと、脂質二重層と記録装置との間に電気化学的な接続が確立される。記録装置はボルテージクランプアンプで構成されており、これにより膜電位の精密な制御と、埋め込まれた孔形成タンパク質を通過するイオン電流の同時測定が可能となる。

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図1: 平面脂質二重層（PLB）電気生理学セットアップの概略図。 PLB実験に必要な主要構成要素の概略図。記録チャンバーは、脂質二重層が形成される開口部を持つ親油性セプタムによって隔てられた2つの水溶液区画（cis側およびtrans側）で構成される。各区画の電解質溶液には、銀/塩化銀（Ag/AgCl）電極が浸されている。一方の電極で電圧刺激（例：正弦波、矩形波、または三角波）を印加し、接地されたもう一方の電極を電流-電圧変換器に接続して、イオン電流を比例する電圧信号に変換する。この信号は増幅され、必要に応じてフィルタリングおよびデジタル化された後、リアルタイムのモニタリングと解析のために記録される。こちらのリンクから、この図の拡大版を表示できます。

BLMを形成するための他の手法も確立されています。これらの中でも一般的なアプローチは、パッチクランプピペットの先端に懸垂させた脂質二層膜を作成することです。例えば、チップディップ法6では、気液界面にある脂質単分子膜にピペット先端を繰り返し浸すことで、1回の通過ごとに単一のリーフレットを取り込み、直径~4 µmのガラスマイクロピペットの開口部に溶媒を含まない懸垂脂質二層膜を形成させます。また、脂質二層膜における単一チャネル測定には、パッチクランプ法も用いられています。例えば、パンチアウト法7では、直径10～80 µmのガラスピペットを用いて、記録チャンバーの開口部をあらかじめ覆っていた大きな膜にパッチを形成します。あるいは、リポソームパッチ法では、あらかじめ形成されたナノからマイクロサイズの小胞を溶媒を含まないBLMとして利用します8,9。特に、巨大単層小胞は、セルアタッチドおよびエキサイズドパッチモードを含むさまざまなパッチクランプ構成による単一チャネル記録に広く利用されています10,11。

また、複数の脂質二重層を並列かつ自動的に形成するためのプラットフォームもいくつか登場しています。その一つが液滴界面二重層（DIB）法12であり、これは脂質・溶媒混合液中に水滴を配置する手法です。この方法では、液滴の周囲に脂質単分子層が自発的に形成され、2つの液滴が接触したときに二重層が形成されます。一部の構成では、膜の安定性を向上させるためにハイドロゲル上でDIBを形成させることが可能です13。ガラスピペットの先端でのDIB形成に基づいた別の手法に、コンタクトバブル二重層（CBB）法14があり、これは2本のマイクロピペットを用いて油相に水泡を導入する方法です。DIB法と同様に、脂質でコーティングされた2つの気泡が接触すると、脂質二重層が自発的に形成されます。もう一つのプラットフォームとして、格子状に配置された明確なマイクロからナノスケールの細孔アレイで構成されるアレイ型BLMシステムが挙げられます。これらのシステムにおいて、懸垂脂質二重層は、ペインティング法やフォールディング法、あるいはリポソーム小胞の破裂を用いた手動的な方法15,16,17で形成されるほか、マイクロ流路構造と組み合わせることで、脂質溶液と緩衝液を順次注入し自動的に形成させることも可能です18,19。

溶媒を用いないBLMを形成するために多くの手法が開発されてきましたが、本研究では、人工脂質二重膜に組み込まれた膜タンパク質の単一チャネル挙動を調査するため、小型化・統合化されたプラットフォーム内で実装されたフォールディング法に焦点を当てます。実験は、Elements Nanopore Reader（eNPRアンプ）とBLMchipMM（図2Aおよび図2B）の2つのコンポーネントで構成されるElementsセットアップを用いて行われました。前者はコンパクトで低ノイズのボルテージクランプアンプであり、完全かつ独立したユニットを形成することでワークスペースを簡素化し、追加の外部デバイスの必要性を排除しています。BLMchipMMは、Montal–Mueller法向けに設計された事前組み立て済みの小型システムであり、実験インターフェースとして機能します。これは、プリント回路基板（PCB）と統合された透明なポリメタクリル酸メチル（PMMA）記録チャンバーで構成されており、PCBにはアンプに直接接続するための電極として機能するAg/AgClワイヤを収容するように設計された2つのソケットが含まれています。チャンバーのコア構造は、2つの透明なPMMAコンポーネントの間に密封されたポリイミドセプタムで構成されています。セプタムの厚さは50 µmですが、二重膜の形成を容易にするため、小さな中央領域（3.78 mm2）のみ厚さが25 µmに減少しています。この薄い領域の中心には、レーザー drillingによってテーパー状の開口部が形成されており、これにより脂質二重膜の機械的安定性が向上します20,21。4種類の開口径（50、75、100、および140 µm）が利用可能であり、膜容量の調整が可能です（表1）。各PMMAコンポーネントには容量110 µLのC字型キャビティがあり、ポリイミドセプタムの両側に電解質溶液を保持するための2つの流体コンパートメントを形成しています。各PMMAブロックの反対側には2つの傾斜した流体チャネルが掘られており、一方のチャネルはAg/AgCl電極の挿入に使用され、もう一方はピペッティングによるリザーバー内のバッファーレベルの手動調整に使用されます。

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図 2: Elements Nanopore Reader および BLMchipMM システム。 (A>) Elements Nanopore Reader (eNPR) アンプの専用スロットに挿入された BLMchipMM の写真。 (B>) BLMchipMM の構成要素の概略図。ポリメタクリル酸メチル (PMMA) 製の記録チャンバー、マイクロサイズの開口部を含むポリイミドセプタム、および Ag/AgCl 電極用ソケットとチャンバー整列用スロットを備えたプリント回路基板 (PCB) が示されている。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

孔径（µm)5075100140
孔厚（µm)25252525
典型的な膜容量 (pF)20–4040–6060–9090–140

表1：利用可能なBLMchipMMアパーチャ形式の特性。アパーチャ径50、75、100、および140 µmのBLMchipMMデバイスにおける、孔径、アパーチャ領域のセプタム厚、および代表的な膜容量値。膜容量値は、1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine脂質から形成された二重層について示されている。

一般的に、研究室で使用される記録室は、自作のユニットか市販のデバイスのいずれかです。前者の場合、システムの構築にはさまざまなコンポーネントの組み立てや、セプタムに開口部を作成するための信頼性の高い手法の開発が必要であり、多くの研究室にとって導入の障壁となることがあります。市販のデバイスを使用する場合でも、各実験の前に複数のコンポーネントを手動で統合しなければならないことが多々あります。対照的に、BLMchipMMは事前組み立て済みであり、日常的な洗浄手順のために実験間で分解する必要はありません。使用する溶媒がデバイスの材質と適合していれば、同一のユニットを洗浄して複数の実験に再利用でき、膜形成の品質を損なうことはありません。これにより、ユーザーによるばらつきが軽減され、手動のシーリング要素に関連する漏液のリスクが最小限に抑えられます。また、外部からの交換および再生が可能な銀線電極を使用することで、特に電極の消耗が加速する実験条件下において、システムの有効寿命をさらに延ばすことができます。

さらに、自作のデバイスはコンパートメントの容量が大きくなることが多く、実験に必要な生物学的および化学的成分の量が増加します。対照的に、BLMchipMMの小型化により、実験液量を最小限に抑えることが可能となり、試薬、タンパク質、およびその他の化合物の消費量を大幅に削減できます。これは、発現が困難な膜タンパク質や収量の低い膜タンパク質を扱う場合や、試験化合物の合成コストが高く、実験全体のコストが増大する場合に特に有利です。重要な点として、BLMchipMMは溶媒量を最小限に抑えたバイレイヤーの形成を可能にし、各リーフレットを異なる脂質種で構成できる非対称膜構成をサポートしているため5,22、制御された条件下での膜タンパク質機能の研究を容易にします。

従来、電流測定はパッチクランプ実験用に設計されたアンプを用いて行われてきましたが、多くの場合、データ収集のための別途のデジタイザーへの接続や、グラフィカルインターフェースによる制御が必要でした。これらのシステムはかさばり高価であるだけでなく、非専門のユーザーにとって設定手順が直感的でないことが頻繁にあります。さらに、記録チャンバーのサイズや、ヘッドステージ入力を静電干渉から保護する内蔵シールドを通常備えていない標準的なアンプの設計により、外部ファラデーケージの使用が必要となることが多くあります。このようなケージの品質や接地状態は、システムのノイズ性能に大きな影響を及ぼす可能性があります。BLMchipMMを小型の統合アンプと組み合わせて使用することで、外部コンポーネントの必要性が低減し、この構成を簡素化できます。信号のデジタル化はデバイス内で行われ、システムハウジングがシールドとして機能することで、周囲の電磁干渉に対する感受性が低減します。

本プラットフォームの適用可能性を実証するため、計算科学的に導出されたTREKサブファミリーの祖先メンバーであるK2P様チャネルancTREK1（付録図1）をテストタンパク質として用い、再構成および単一チャネル記録が成功することを確認した。K2Pチャネルは、静止膜電位と細胞の興奮性を調節する二量体カリウム漏出チャネルを形成し、その中でもTREKチャネルは十分に特性解析されたサブファミリーである。

プロトコル

本研究では、ヒト参加者、ヒト由来物質、または動物被験者は含まれていません。したがって、施設および国のガイドラインに従い、倫理的承認は不要でした。

1. 電気生理学セットアップの準備

  1. 装置の校正
    ​システムは工場出荷時に設定されているため、正式な校正は不要ですが、膜形成前にシステムの適切な機能を検証してください。
    1. 開回路条件下（すなわち、BLMchipMMを挿入していない状態）で入力抵抗を測定します。測定された抵抗値が1 TΩ以上であれば、アンプ入力の完全性が適切であることが確認されます。
    2. 1 GΩの抵抗器を含むモデルセルを用いて、システムの応答を検証します。測定された抵抗値が±30%以内の1 GΩであれば、組み込み抵抗の許容誤差と一致します。
    3. 一定電圧（0 mV）の開回路条件下でベースラインノイズを測定します。サンプリングレート10 kHz、帯域幅5 kHzにおいて、RMSノイズが300 fA以下であれば、低ノイズなシステム性能が確認されます。
  2. Ag/AgCl電極の準備
    1. 初回使用時は、銀線をエタノールと二回蒸留水で洗浄します。
    2. 既に使用した銀線については、極細目のサンドペーパーを用いて、表面が均一に明るい銀色で清潔な金属光沢を持ち、目に見える残留物がない状態になるまで、古いAg/AgCl層を表面から除去します。その後、エタノールと二回蒸留水で洗浄します。
    3. 銀線の先端部分を1%–5%次亜塩素酸ナトリウム（NaOCl）に浸し、淡い灰色になるまで（通常15–30分間）塩素化します（図 3A）。使用中の劣化については、色の変化やベースライン電流のドリフト、またはその両方として現れるため、塩素化された銀線を継続的に監視してください。
      注：塩素化には、一般的な家庭用漂白剤（1%–5% NaOCl）を使用できます。
      注意：銀線全体を塩素化しないでください。適切な電気的接続を確保するため、PCBソケットに挿入する先端部分は塩素化せずに残してください。
      ​注意：PCBのソケットは直径0.5 mmの銀線用に設計されています。他の直径の線は適切に適合しないか、接続が不安定になる可能性があります。
  3. BLMchipMMの組み立て
    1. 2本の銀線の塩素化されていない先端部分をPCBソケットに挿入します。必要に応じてピンセットを使用して正しく配置してください（図 3B）。
    2. 銀線の塩素化された端を、PMMAコンポーネントに穿孔された流路に配置します（図 3C）。
    3. BLMchipMMをゆっくりと回転させ、PMMA記録チャンバーの下部の突起を専用スロットに適合させてPCBに取り付けます（図 3D）。
    4. 銀線の位置を確認し、流路の末端まで達していることを確認します。必要に応じて、銀線の端がコンパートメントの底部に見えるまでゆっくりと押し込みます（図 3E）。
      ​注意：銀線をPMMAコンポーネントにできるだけ近づけて配置してください。過度な湾曲はアンプの蓋への接触を招き、短絡および信号の飽和を引き起こす可能性があります。
  4. 脂質および記録溶液の準備
    1. セプタム開口部の前処理用として、100% n-ヘキサンを用いた1% (v/v) ヘキサデカン溶液を100 µL準備します。この溶液は−20°Cで最大1週間保存してください。
    2. 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC) 脂質を100% n-ペンタンに再懸濁し、最終濃度を15 mg/mLにします。この溶液は−20°Cで最大24時間保存してください。
    3. 室温（RT; 20°C–25°C）で、1 M KClストック溶液3 mLと1 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acidストック溶液（pHメーターを用いてKOHでpH 7.4に調整済み）150 µLを混合して、電解質記録溶液を調製します。二回蒸留水を加えて最終容量を15 mLにします。この溶液は4°Cで最大1週間保存してください（表 2）。

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図3BLMchipMMデバイスの組み立て。 (A) 漂白剤への浸漬による銀線の塩素化。 (B) PCBソケットへの銀（Ag）線の挿入。(C) マイクロ流路内への銀（Ag）ワイヤの配置 (D) PCBへの記録チャンバーの設置。 (E) 流体チャネル内における電極の適切な配置の確認。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

試薬最終濃度容量
二回蒸留水—15 mLまで加える
塩化カリウム (KCl) (1 M)200 mM3 mL
HEPES pH 7.4 (KOH) (1 M)10 mM150 µL

表2：電解質記録液。PLB記録に使用した電解質溶液の組成、試薬濃度および調製量。最終容量は2回蒸留水を用いて15 mLに調整する。記録液は、使用前に0.2 µmのシリンジフィルターでろ過しなければならない。

注：記録溶液は使用前に0.2 µmのシリンジフィルターでろ過してください。DPhPC脂質は、乾燥粉末またはクロロホルムに溶解した状態で提供されます。酸化を防ぐため、どちらの形態も不活性ガス封入済みの密閉ガラスバイアルに入れ、−20°Cで保存してください。乾燥粉末を使用する場合は、開封前に室温（RT）に馴染ませてください。乾燥粉末からは新鮮な溶液を調製し、24 h以内に使用してください。クロロホルムストックを使用する場合は、残留したクロロホルムが膜を不安定にする可能性があるため、再懸濁前に窒素気流下で溶媒を完全に蒸発させてください。

2. Montal–Mueller法によるPLBの誘導

以下に、フォールディング法（Montal–Mueller法5とも呼ばれる）を用いた人工膜形成の手順を説明します（図4）。この手法では、セプタムの開口部を1% (v/v) n-ヘキサン中ヘキサデカンの薄層で前処理し、脂質溶液を滴下して気液界面にモノレイヤーを形成させ、チャンバー各室の電解質溶液の液位を順次上げながら、モノレイヤーを開口部に折り畳ませます。

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図 4: Montal–Mueller法を用いたPLBの形成。(A>) n-hexane中の1% hexadecaneによるアパーチャの前処理、およびアパーチャレベルまでのコンパートメントへの充填。(B>) 気液界面における脂質単分子層の形成。(C>およびD>) 各コンパートメントのバッファーレベルを順次上昇させることで、単分子層が折り畳まれ、アパーチャを横切る溶媒を含まない脂質二層膜が形成される。こちらのリンクから、この図の拡大版をご覧いただけます。

  1. 膜の形成
    1. ピペットチップを用いて、セプタムの開口部を1% (v/v) ヘキサデカンn-ヘキサン溶液で前処理する。片面あたり約2 µLを塗布する(図 4A)。
    2. 温度23°C–25°C、相対湿度45%–50%の条件下で、溶媒を5分間蒸発させる。
    3. 組み立てたBLMchipMMをアンプに挿入する。
    4. USBケーブルでアンプをコンピュータに接続し、データ収集ソフトウェアを開く。
    5. 電流範囲を2 nAに設定し、RC推定ツールを起動して膜容量と抵抗をモニタリングする。
      注：RC推定の設定はデフォルトで構成されているが、必要に応じて調整可能である。
    6. 各コンパートメントに、開口部の下端まで記録溶液を30 ± 2 µL充填する(図 4A)。
      注意：記録溶液が開口部周辺の領域を濡らさないようにすること。
    7. 各コンパートメントの水相表面に、脂質溶液2.5 ± 0.1 µLを滴下して広げる(図 4B)。
    8. 溶媒を2分間蒸発させる。
    9. 一方のコンパートメントの底部にピペットチップを約90°の角度で配置し、記録溶液80 ± 2 µLを加える。もう一方のコンパートメントでも同様に繰り返す(図 4C および 図 4D)。
      注：溶媒の蒸発時間は、温度23°C–25°C、静止空気、相対湿度45%–50%の条件に基づいている。
    10. ファラデーケージの蓋を閉め、電流信号をモニタリングする。膜抵抗値が200 GΩを超えていれば、バイレイヤーが正常に形成され、膜の完全性が良好であることを示す。
      注：膜の形成成功は、ゼロ付近で変動する矩形波電流信号によって示され、その振幅は膜容量に比例する(図 5A)。

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図5: 取得ソフトウェアインターフェースを用いた膜形成のモニタリング。(A) 膜形成に成功した際の代表的なトレース。三角波電圧（ピーク間 100 mV、10 Hz）を印加すると、膜容量（~45 pF）に比例した矩形波の容量性電流が生成される。(B) 電流信号の飽和によって特徴づけられる、膜が形成されなかったことを示す代表的なトレース。(C) アパーチャが露出している場合など、脂質二層膜が形成されていないときの浮遊容量に対応する容量性信号。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

注：信号が電流範囲の制限間で切り替わる場合は、メンブレンの破損を示しています（図 5B）。

注：RMSノイズは膜容量、したがって開口部のサイズとともに増加します。一定電圧条件下（0 mV）、サンプリングレート 5 kHz、帯域幅 2.5 kHz で測定された典型的なノイズ範囲は、0.48–2.00 pA（50 µm）、0.74–2.62 pA（75 µm）、1.00–3.52 pA（100 µm）、および 1.59–5.27 pA（140 µm）です。

注：初期の試行で失敗した場合は、一方のコンパートメントの緩衝液レベルを下げたり上げたりすることで、膜形成が促進されることがあります。

注：必要に応じて、ピペットチップを用いて開口部に約 5 s 間気泡を適用し、バイレイヤー形成を促進させてください。

注意：バッファー液のレベルをアパーチャーより低くしたり、気泡が混入したりすると、浮遊容量に起因する信号が発生することがあります（図5C）。出力波形が図5Bのような場合は、前処理が不十分であった可能性があります。前処理溶液と脂質を再度塗布するか、デバイスを洗浄して手順を繰り返してください。

注意：電圧オフセット補正は、必ず膜がない状態で実行してください。膜が存在する場合は、補正を行う前にZAP機能を用いて膜を破裂させてください。

注：実験は標準的な研究室のベンチ上で行うことができますが、必要に応じて除振台を使用してください。

3. BLMchipMMの洗浄

  1. PCBから記録チャンバーを取り外します。
  2. 両方のコンパートメントおよび流路を100% isopropyl alcohol (IPA)で洗浄します。
    注意：IPAへの曝露時間は1分を超えないようにしてください。
    注意：アセトンや100% ethanolは、チャンバーのシール材を損傷させる可能性があるため、使用しないでください。
    注意：追加の溶剤を使用する場合は、使用前にPMMAとの適合性を確認してください。
  3. 二回蒸留水で十分にすすぎます。
  4. 圧縮空気の穏やかな気流を用いて、目に見える水滴がなくなるまで記録チャンバーを完全に乾燥させます。
    注意：照明付き拡大鏡でチャンバーを点検し、油膜などの残留物がないことを確認してください。必要に応じて、洗浄および乾燥手順を繰り返します。
    注意：新しい実験を開始する前に、チャンバーが完全に清潔で乾燥していることを確認してください。

4. 合成イオンチャネル (ancTREK1) の発現および精製

  1. 発現構築物の作製
    以下の手順では、クローニング戦略、Freestyle-293F細胞を用いた異種発現、およびancTREK1タンパク質の精製について説明する。
    ​PCR増幅、制限酵素消化、ライゲーション、および化学的コンピテントEscherichia coli細胞への形質転換を用いて発現ベクターを構築する23,24。C末端にGFPタグとHis₈タグを持つ哺乳類用ベクターを用いてancTREK1配列（Supplementary Figure 1）を発現させ、蛍光ベースの検出25,26および、ニッケル–ニトリロ三酢酸（Ni2⁺-NTA樹脂）27,28,29とそれに続く抗GFPナノボディ樹脂30,31,32を用いた2段階のアフィニティー精製を可能にする。
  2. PCRによるancTREK1 DNAの増幅
    1. 滅菌二回蒸留水を用いて、PCRプライマーとDNAテンプレートを最終濃度10 µMおよび~20 ng/µLに希釈する。
    2. すべての試薬を氷上で解凍する。
    3. 5×バッファー10 µL、各10 µMプライマー2.5 µL、DNAテンプレート2 µL、10 mM dNTPs 1 µL、高正確性DNAポリメラーゼ0.5 µLを含み、滅菌二回蒸留水でメスアップした50 µLのPCR反応液を調製する（Table 3）。穏やかに混ぜ、短時間遠心分離する。
    4. 以下の条件でPCRを行う：初期変性98°Cで3分；98°Cで30秒、68°Cで30秒、72°Cで30秒の30サイクル；最終伸長72°Cで3分（Table 4）。
    5. 1× TAEバッファー中の1% (w/v) アガロースゲルで、60 Vで90分間PCR産物を電気泳動し、目的のバンドを切り出す。
      ​注：ゲル抽出法を用いてPCR産物を精製し、260 nmでDNA濃度を測定し、必要に応じて精製したPCR産物を−20°Cで保存する。
  3. 制限酵素消化の実施
    1. 別々のチューブに、PCR産物2 µgおよびプラスミドDNA 2 µgを含む消化反応液を調製する。10×バッファー5 µL、EcoRI制限酵素0.5 µLおよびNotI制限酵素0.5 µLを加え、二回蒸留水で50 µLに調整する（Table 5）。
    2. 穏やかに混ぜ、37°Cで3時間インキュベートする。
    3. 65°Cで20分間加熱し、酵素を失活させる。
    4. ベクターの消化液にアルカリフォスファターゼ1 µLを加え、37°Cで1時間インキュベートする。
    5. 消化産物を1%アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドを抽出する。
      ​注：適切な精製法を用いてDNA断片を精製し、必要に応じて精製したDNAを−20°Cで保存する。
  4. ライゲーションおよび形質転換の実施
    1. ベクターとインサート（モル比3:1）、10×リガーゼバッファー2 µL、およびリガーゼ酵素1 µLを含む20 µLのライゲーション反応液を調製する（Table 6）。
    2. 室温で1時間インキュベートする。
    3. 化学的コンピテントE. coli細胞を氷上で解凍する。
    4. ライゲーション混合液5 µLを50 µLの細胞に加え、氷上で20分間インキュベートする。
    5. 42°Cで1分間ヒートショックを与え、その後氷上に2分間戻す。
    6. LB培地450 µLを加え、37°Cで振盪しながら1時間インキュベートする。
    7. 3,000 × gで1分間遠心分離し、ペレットを50 µLで再懸濁する。
    8. 選択アガープレートに塗布し、37°Cで一晩インキュベートする。
      ​注：シーケンシングによりクローニングの成功を確認する。
  5. HEK293F細胞へのトランスフェクション
    1. 無血清懸濁培地を用いて、293F細胞を0.5 × 106 cells/mLの密度で250 mLに播種し、37°C、6% CO₂でインキュベートする。
    2. 低血清培地最終容量3 mL中にDNA 250 µgを調製する。
    3. 水を用いて1 mg/mLのポリエチレンイミン（PEI）750 µgを調製し、NaOHでpHを6.9–7.1に調整し、溶液をステリライズフィルターでろ過した後、低血清培地で最終容量を3 mLにする。
    4. DNA溶液とPEI溶液を混合し、穏やかに混ぜて室温で10分間インキュベートする。
    5. 混合液を細胞に滴下して加える。
    6. 4時間後、酪酸ナトリウムを最終濃度10 mMとなるように添加する。
    7. 48時間後、500 × gで15分間遠心分離して細胞を回収する。
    8. 細胞ペレットを−80°Cで保存する。
  6. 膜タンパク質の可溶化
    1. 100 mLのHEK293培養液からの細胞ペレットを氷上で解凍する。
    2. 細胞ペレットを溶解バッファーで1:10 (w/v) の比率で再懸濁する（Table 7）。
      界面活性剤を最終濃度1% n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) および 0.1% cholesteryl hemisuccinate (CHS) となるように添加する。
    3. 4°Cで2時間、回転しながらインキュベートする。
    4. 4°Cで100,000 × gで1時間遠心分離する。
    5. 上清を回収する。
      注意：すべての手順は、あらかじめ冷却したバッファーを用いて4°Cで実施すること。
  7. IMAC精製の実施
    1. 500 µLのNi2⁺-NTA樹脂を重力カラムに充填する。
    2. 平衡化バッファー（Table 8）2カラムボリューム（CV）で樹脂を平衡化する。
    3. サンプルをロードし、10 rpmで穏やかに混合しながら4°Cで3時間インキュベートする。
    4. カラムを垂直に立て、重力フローによりフロスルーを回収する。
    5. 30 mMイミダゾールを含む洗浄バッファー10 CVで樹脂を洗浄する。
    6. 300 mMイミダゾールを含む溶出バッファー10 CVでタンパク質を溶出する。
      注：分画をSDS-PAGE（Figure 6）で分析する。分析用にフロスルーおよび洗浄分画を保存する。必要に応じてタンパク質を4°Cで一晩保存する。
  8. 抗GFP精製の実施
    1. 1 mLの抗GFP樹脂を重力カラムに充填する。
    2. Buffer 1（Table 9）2 CVで樹脂を平衡化する。IMAC溶出液をロードし、10 rpmで穏やかに混合しながら4°Cで3時間インキュベートする。
    3. カラムを垂直に立て、重力フローによりフロスルーを回収する。
    4. Buffer 1を10 CV、Buffer 2を10 CV、続いてBuffer 1を10 CVの順に樹脂を洗浄する。
    5. HRV-3CプロテアーゼをBuffer 1 2 mLに、プロテアーゼ：タンパク質比1:50で希釈する。
    6. HRV-3Cプロテアーゼを添加したBuffer 1を樹脂に加え、穏やかに混ぜ、垂直静止状態で4°Cで一晩インキュベートする。
    7. 溶出分画から切断されたタンパク質を回収する。
    8. 50 kDaカットオフの遠心濃縮器を用い、3,000 × g、4°Cで最終容量が約500 µLになるまでサンプルを濃縮する。
      注：分画をSDS-PAGE（Figure 7）で分析する。凝集を防ぐため、濃縮中に定期的にタンパク質を再懸濁する。精製したタンパク質は急速凍結後、−80°Cで保存する。100 mLの培養液から約60 µgのタンパク質が得られる。

figure-protocol-4
図6: 固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）によるancTREK1の精製。蛍光検出を用いたIMAC溶出分画のドデシル硫酸ナトリウム–ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析。レーンM：分子量マーカー。レーンa：緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きancTREK1（黄色い矢印）を示すIMAC溶出分画。自己切断によって生じた遊離GFPを*eGFPで示す。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

figure-protocol-5
図 7: 抗GFPナノボディアフィニティークロマトグラフィーによるancTREK1の精製。クーマシーブルーで染色した溶出分画のSDS-PAGE解析。レーン M: 分子量マーカー。レーン a: 3Cプロテアーゼの存在を示す抗GFP溶出分画。レーン b: 濃縮後の精製ancTREK1。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

試薬～の容量 50 µL 反応最終濃度
二回蒸留水に追加する 50 µL—
5× Phusion商標 GCバッファー10 µL1×
dNTPs（各10 mM）1 µL200 µM それぞれ
フォワードプライマー（10 µM)2.5 µL0.5 µM
リバースプライマー（10 µM)2.5 µL0.5 µM
テンプレートDNA（20 ng/µL)2 µL0.8 ng/µL
Phusion商標 高忠実度DNAポリメラーゼ0.5 µL0.02 U/µL

表 3：ancTREK1増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）反応セットアップ。 高正確性DNAポリメラーゼシステムを用いてancTREK1 DNA配列をPCR増幅するために使用した試薬組成、容量、および最終濃度。

ステップ温度時間サイクル
初期変性98°C3分1
変性98°C30秒30
アニーリング68°C30秒30
延長72°C30秒30
最終延長72°C3分1
保持12°C保持—

表4：ancTREK1増幅のためのPCRサイクル条件変性、アニーリング、伸長、および最終伸長ステップを含む、ancTREK1 DNA配列の増幅に使用したサーマルサイクリングパラメータ。

構成要素インサートの消化（50 µL)ベクターの消化および脱リン酸化（50 µL)
二回蒸留水₂O〜へ 50 µL～へ 50 µL
10× ANZAレッドバッファー5 µL5 µL
デオキシリボ核酸ancTREK1 PCR産物（2 µg)pEG BacMam C末端 3C eGFP His8 ベクターDNA（2 µg)
アンザ™ EcoRI0.5 µL0.5 µL
アンザ™ NotI0.5 µL0.5 µL
アンザ™ アルカリホスファターゼ—1 µL

表5：ancTREK1クローニングのためのインサートおよびベクターの制限酵素消化EcoRIおよびNotI酵素を用いたancTREK1 PCR産物および発現ベクターの制限消化反応条件。ベクターの消化には、セルフライゲーションを防ぐためにアルカリフォスファターゼを用いた脱リン酸化工程が追加されている。

構成要素量（20 µL 反応)
二回蒸留水₂O〜へ 20 µL
10× T4 DNAリガーゼバッファー2 µL
ancTREK1挿入DNA (843 bp)10 ng
pEG BacMam C-term 3C eGFP His8 ベクターDNA (7673 bp)30 ng
T4 DNAリガーゼ1 µL

表6：ancTREK1クローニングにおけるベクター・インサート結紮条件。T4 DNAリガーゼを用い、pEG BacMam発現ベクターにancTREK1インサートを1:3のモル比で結紮させるための反応混合物。

構成要素最終濃度量（5 mLまで）
二重蒸留水₂O—5 mLまで
KCl (1 M)200 mM1 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM100 µL
MgCl2₂ (100 mM)1 mM50 µL
PMSFプロテアーゼ阻害剤 (100 mM)1 mM50 µL
ロイペプチン・プロテアーゼ阻害剤 (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
アプロチニンプロテアーゼ阻害剤 (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
Pepstatin A プロテアーゼ阻害剤 (1 mg/mL)1 µg/mL5 µL
DNase I (50 mg/mL)25 µg/mL2.5 µL
n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM, 10%)1%500 µL
コレステリルヘミコハク酸 (CHS, 2%)0.10%250 µL

表 7: 膜タンパク質抽出用ライシスバッファーの組成膜タンパク質の可溶化に使用したライシスバッファーの処方。塩類、緩衝剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ、および界面活性剤を含む。注：バッファーは使用直前に調製すること。

平衡バッファー（全量 10 mL）
成分最終濃度分量
ddH₂O—10 mLまで
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
洗浄バッファー（全量 10 mL）
成分最終濃度分量
ddH₂O—10 mLまで
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
Imidazole pH 8 (5 M)30 mM60 µL
溶出バッファー（全量 10 mL）
成分最終濃度分量
ddH₂O—10 mLまで
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM, 10%)0.05%50 µL
Cholesteryl hemisuccinate (CHS, 2%)0.01%50 µL
Imidazole pH 8 (5 M)300 mM600 µL

表8：ancTREK1精製のためのIMAC緩衝液組成ancTREK1の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー精製に使用した平衡化、洗浄、および溶出緩衝液の処方。注：溶液は4°Cで最大6ヶ月間保存可能。

バッファー1（全量10 mL）
構成要素最終濃度量
超純水₂O—10 mLまで
KCl (1 M)200 mM2 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM, 10%)0.05%50 µL
コレステリルヘミコハク酸 (CHS, 2%)0.01%50 µL
バッファー2（全量10 mL）
構成要素最終濃度量
二重蒸留水₂O—10 mLまで
KCl (1 M)500 mM5 mL
Tris-HCl pH 8 (1 M)20 mM200 µL
n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM, 10%)0.05%50 µL
コレステリルヘミコハク酸 (CHS, 2%)0.01%50 µL

表9：抗GFPナノボディアフィニティークロマトグラフィー用バッファー組成。抗GFPナノボディアフィニティークロマトグラフィーを用いてancTREK1を精製するために使用したバッファーの処方。注：溶液は4°Cで最大6ヶ月間保存可能である。

5. イオンチャネル活性の記録

  1. 膜の品質評価
    1. ファラデーケージの蓋を閉じる。
    2. 三角波電圧（100 mV, 10 Hz）を印加し、膜容量を評価する。
    3. 電圧ステップ（±20 mV刻みで最大±200 mVまで）を印加し、膜抵抗を評価する。
    4. 電流値とノイズ値をモニターする。
      ​注：特に指定がない限り、サンプリングレートは 5 kHz、ローパスフィルタは 2.5 kHz を使用すること。
  2. ancTREK1活性の記録
    1. ancTREK1タンパク質を記録溶液で約 2 µg/mL に希釈する。
      注：希釈の際、記録溶液への最終希釈前に、界面活性剤濃度を臨界ミセル濃度（CMC）以上に維持するため、必要に応じて Buffer 1 で中間希釈を行うこと。
    2. 希釈したタンパク質溶液 1 µL を、セプタム開口部の近くの cis 側チャンバーに添加する。
      注：膜電位は Vcis − Vtrans として定義される。本研究ではチャネルの配向を直接的に決定していないため、記録は割り当てられた膜の側性ではなく、印加電圧の極性に基づいて記述されている。
    3. 電圧ステップを ±20 mV 刻みで最大 ±120 mV まで印加する。
    4. チャネルの挿入イベントをモニターする。
      注：チャネルの挿入は、閉状態と開状態の間の不連続な電流遷移によって示される。挿入が起こらない場合は、タンパク質を追加するか、膜を再形成すること。複数のチャネルが挿入された場合は、膜を破裂させ、タンパク質濃度を下げて再試行すること。

結果

PLB膜の電流–電圧（I–V）特性

脂質二重層膜が本来持つ疎水性の性質により、電荷を持つ種は膜を透過できません。しかし、外部電場を印加するとナノメートルサイズの過渡的なポアが形成され、それによって膜の透過性とコンダクタンスに影響が及びます33。1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine脂質から形成された人工二重層の品質を評価するため、タンパク質を挿入しない状態で、膜容量、抵抗、およびI–V特性を評価しました。±20 mVから±200 mVまで（±20 mV刻み）の一連の電圧ステップを印加し、得られた膜貫通電流を記録しました。データは5 kHzでサンプリングし、2.5 kHzでローパスフィルタ処理を行いました。

膜容量（Cm）および膜抵抗（Rm）は、脂質二重層の品質を評価するための重要なパラメータです。PLBは等価抵抗・容量（RC）回路として記述でき、そこでは膜は抵抗と並列に接続されたコンデンサとして機能します34。容量成分は膜の電荷蓄積能を反映し、抵抗成分はイオン透過性を反映します。三角波電圧を印加すると、膜容量に比例した正方形の容量電流応答が生成され、これは以下の式で表されます。

figure-results-1    (1)

ここで、Cmは膜容量、Vは印加電圧、tは時間を表します。膜形成後、脂質二重層が漸次的に薄くなるため、容量値が経時的に増加することがあります35。膜を平行平板コンデンサとして考えると、容量は膜の面積および厚さと次のように関連しています：

figure-results-2    (2)

ここで、εlipidsは脂質コアの誘電率（~2）、ε0は真空の誘電率、Aは膜面積、dは膜厚である36,37。

膜抵抗は、オームの法則33を用いて決定しました：

figure-results-3    (3)

ここで、Vは印加電圧、Rmは膜抵抗である。イオンチャネルが存在しない場合、膜電流は0 pA付近に留まり、これはギガオーム（GΩ）オーダーの抵抗値に対応する33。

75 µmおよび100 µmの開口部を持つBLMchipMMデバイスにおいて、I–V関係は0から±200 mVの間で線形（オーミック）挙動を示しました。データの線形フィッティングにより、膜抵抗値は75 µm開口部で847 ± 16 GΩ (n = 6) (Figure 8A、円形)、100 µm開口部で980 ± 32 GΩ (n = 7) (Figure 8A、正方形)となりました。電流トレースの3 sセグメントで測定したRMSノイズ値は、100 µm開口部で3.1 ± 2 pA (n = 7)、75 µm開口部で2.6 ± 0.1 pA (n = 6)でした。膜の安定性は、計1時間にわたり約2分間隔で抵抗を測定することで評価しました (Figure 8B)。適切に形成された膜は一貫して1時間以上にわたって安定しており、これはほとんどの電気生理学的実験にとって十分な時間です。膜は通常、±200 mVまでの印加電圧に耐え、不安定な兆候は見られませんでしたが、個々のバイレイヤーによって±220から±300 mVの間で破壊が起こりました。静電容量値が75 µm開口部で40から60 pF、100 µm開口部で60から90 pFの範囲にあり、かつ100 mVでの電流値が≤0.5 pAである場合、その膜はタンパク質挿入に適していると判断されました。

figure-results-4
図 8: PLBの電気的特性評価。 (A) 75 µm および 100 µm のアパーチャ上に形成されたバイレイヤーの電流-電圧 (I-V) 関係。±200 mV の間で線形（オーム）挙動を示している。線形回帰により、膜抵抗値はそれぞれ 847 ± 16 GΩ (n = 6) および 980 ± 32 GΩ (n = 7) と算出された。 (B) 1 時間にわたり 2 分間隔で抵抗をモニタリングし、膜の安定性を評価した。膜は ±200 mV まで安定し、±220 から ±300 mV の電圧で破断した。データは平均値 ± 標準誤差 (SEM) で示している。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ancTREK1の単一チャネル挙動の初期特性評価

合成ancTREK1を精製してPLBに再構成し、−120から120 mVまで20 mV刻みの電圧ステッププロトコルを用いて単一チャネル活性をモニターした。単一チャネル記録（Figure 9AおよびFigure 9B）により、K2Pチャネルに特徴的なフリッカリング挙動が明らかになった38。80 mVにおける平均電流振幅は13.02 ± 0.78 pA（n = 5）であったのに対し、−80 mVでは電流振幅は−18.72 ± 0.25 pA（n = 5）に増加した（Figure 9C）。得られたI–V関係は、Mg2+フリーの対称200 mMカリウム条件下において、正および負の両電位で測定可能な単一チャネル電流を示した（Figure 9D）。電流振幅は、5 kHzで取得し2.5 kHzでローパスフィルタリングした記録の全点ヒストグラムから推定したため、このI–V関係は網羅的な生物物理学的特性評価ではなく、記述的な原理証明として提示している。

figure-results-5
図 9: 合成ancTREK1の単一チャネル活性。(A および B) それぞれ 80 mV および −80 mV で記録した代表的な単一チャネル電流トレース。点線はチャネル閉鎖レベルを示す。(C) 正電位（左）および負電位（右）における全点振幅ヒストグラム。(D) 2価陽イオンを含まない対称的な 200 mM カリウム (K+) 条件下でのancTREK1の I–V 関係。曲線は4次多項式を用いてフィッティングされており、コンダクタンス値は ±80 mV における傾きから導出されている。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ancTREK1は、哺乳類のTREK1チャネルと比較してN末端およびC末端の伸長領域を欠いているが、再構成後も機能的に活性を維持していた。高コンダクタンスモードと低コンダクタンスモード（正電位においてそれぞれ 132 ± 5 pS および 41 ± 5 pS）を示す哺乳類のTREK139とは対照的に、ancTREK1は大きなコンダクタンスモードのみを示した。正電位における単一チャネルコンダクタンスは 112.8 ± 10.8 pS (80 mV, n = 5) であり、これはTREKチャネルの報告値（対称カリウム条件下で 85–130 pS）38,39,40,41と一致していた。負電位では、コンダクタンスは 205.6 ± 2.05 pS (−80 mV, n = 5) まで増加し、以前に報告されたTREK1の挙動39と一致した。特筆すべき点として、ancTREK1は、切り出しパッチ法を用いて得られたTREK1の測定値42と比較して、高い正規化開口確率 (NPo) を示した。NPo-電圧関係では、正電位でチャネル活性の上昇が見られ、80 mV で 0.78 ± 0.02 (n = 5) に達した。対照的に、NPoは負電位で減少し、−80 mV で 0.53 ± 0.04、−120 mV で 0.28 ± 0.03 となった（図10）。

figure-results-6
図 10: ancTREK1 単一チャネル活性の電圧依存性解析。 膜電位の関数としての正規化オープン確率（NPo）（左）、および 80 mV と −80 mV における NPo の比較（右）であり、正の電位でチャネル開口が増加していることを示している。 こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

補足図1. 合成された祖先型2ポアドメインカリウム（K2P）チャネル（ancTREK1）のアミノ酸配列。 電気生理学的記録に使用したancTREK1の全長アミノ酸配列。この配列は、UniProtおよびNCBIデータベースから収集したオルソログ配列を含む、精選されたTREK/TRAAKファミリーメンバーのデータセットからの祖先配列推論によって再構築された。保存されたポアモチーフによるフィルタリング、アライメント、および最大尤度系統解析を用いて分析が行われた。こちらをクリックしてファイルをダウンロードしてください。

ディスカッション

本研究では、PLB法を用いて合成K2Pチャネルの電気生理学的特性を単一分子レベルで評価しました。科学文献に記載されている様々な平面脂質モデルの中で、我々はBLMの形成に着目しました。BLMは、2つの水相区画を隔てる垂直な非極性表面に開けられた直径50から140 µmの開口部の上に形成されます。この構成により、脂質膜の調製や電解質組成（例：イオン強度やpH）などの実験パラメータを制御しつつ、細胞膜環境をシミュレートすることが可能です3。我々はMontal–Mueller（フォールディング）法5を用いてBLMを再現しました。この手法では、2つの水溶液の気液界面に事前に展開された2つの脂質単分子層が、水位を上げることで開口部で結合し、膜が自発的に構築されます。

ここで提示する膜形成のプロトコルは非常に直感的ですが、実験の成功に強く影響するいくつかの重要なステップがあります。BLMchipMMとアンプの間の適切な電気的接続を確保するためには、PCBソケットに挿入されるAg/AgCl電極線の端部が塩素化されるのを避けることが不可欠です。BLMchipMMの組み立て時に電線の配置が不適切であると、アンプのケースに接触し、短絡や信号の飽和を招く可能性があります。アパーチャの前処理手順ももう一つの重要な要因です。前処理溶液の塗布時に過度な力を加えると、ポリイミドセプタムを損傷させる可能性があり、また電解質溶液の取り扱いが不適切で、特にアパーチャ領域を浸しすぎると、膜形成が妨げられることがあります。さらに、再現性を確保するためには、BLMchipMM記録チャンバーを丁寧に洗浄することが不可欠です。100% isopropyl alcoholを使用し、その後に十分にすすいで完全に乾燥させることで、残留物が以降の実験に干渉しないようにします。

本プロトコルには、いくつかの変更が可能です。漂白剤への浸漬による塩素化は実用的で広く用いられている手法ですが、電気メッキなどの代替法も採用できます43。同様に、前処理および脂質調製法においても変更が可能です。標準的な前処理溶液は、通常、揮発性炭化水素溶媒に溶解した長鎖アルカンで構成されます36。一般的にn-hexane中の1%ヘキサデカン溶液が使用されますが、他の溶媒が適している場合もあります。また、実験上の要求に応じて、脂質組成を調整することも可能です。DPhPC脂質は最適な膜安定性を提供しますが、天然または合成組成を含む代替脂質混合物を使用することもできます36。フォールディング法によって形成される垂直脂質二重層の主な利点は、各リーフレットが異なる脂質種で構成される非対称膜を生成できることであり5,22、この特徴は膜タンパク質の機能に影響を与えることが知られています。

膜形成のトラブルシューティングでは、一般的に水相の液量調整を行います。最初に膜が形成されない場合は、一方のコンパートメントのバッファー液量を繰り返し下げて上げることで、二層膜の構築を促進できます。それでも成功しない場合は、アパーチャーの上に気泡を導入することで、脂質の再分布と膜形成を促進させることができます。それでも解決しない場合は、通常、前処理や汚染に関連する問題が考えられるため、記録室を洗浄し、実験を最初からやり直すことを推奨します。

このセットアップの主要構成要素は、eNPR 100 kHzコンパクトアンプとBLMchipMMで構成されています。このアンプは小型で低ノイズのボルテージクランプシステムであり、アンプの筐体自体が効果的な電磁シールドを提供するため、外部のファラデーケージを含む追加の外部装置を必要としません。BLMchipMMは、アンプに直接接続するためのPCBが統合された、組み立て済みの小型記録チャンバーです。これは、テーパー状にレーザー穿孔された開口部を持つポリイミドセプタムによって隔てられた2つのC字型コンパートメントで構成されており、この開口部で人工膜が形成されます。コンパートメント容積が約110 µLというシステムの小型化により、試薬の消費量が大幅に抑えられ、固有容量が減少するため、信号品質が向上します。さらに、適切な洗浄手順に従えば、分解することなくデバイスを何度も再利用できるため、ばらつきが抑えられ、実験の再現性が高まります。

これらの利点がある一方で、いくつかの制限事項を考慮する必要があります。現在のセットアップには、温度、圧力、または灌流制御のための統合モジュールが含まれていません。固有の膜張力は、TREK144,45,46などのメカノセンシティブチャネルに影響を与えることが報告されていますが、本セットアップには膜張力の制御的な操作は含まれておらず、本研究でメカニズム的な結論は導き出していません。全体として、このプラットフォームは、人工膜におけるイオンチャネル活性を記録するための堅牢でアクセスしやすいシステムを提供します。本研究では、TREKサブファミリーの計算科学的に導出された祖先チャネルである合成K2PチャネルancTREK1を調査しました。記録されたデータは、PLBに再構成された精製ancTREK1が、報告されているTREK1様コンダクタンス特性と一致する単一チャネル挙動を示すことを実証しています。Mg2+フリーの対称200 mMカリウム条件下において、本チャネルは測定可能なI–V関係を示し、振幅値は80 mVで約13 pA、−80 mVで−19 pAとなりました。さらに、ancTREK1はTREK1チャネルで観察される特徴的な大コンダクタンスモードを示し、正電位（~112.8 pS）と比較して負電位（~205.6 pS）で高いコンダクタンスを示しました。特筆すべき点として、ancTREK1は正電位でNPoが増加し（80 mVで0.78）、負電位でNPoが減少（−80 mVで0.53、−120 mVで0.28）しており、これは切り出しパッチ構成での観察結果42とは異なります。これらの知見は、再構成膜タンパク質の原理実証的な単一チャネル記録における本システムの有用性を支持するものです。

開示事項

F.T.はElements S.r.l.のCEOであり、A.P.はその従業員です。その他の著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

細胞トランスフェクション手順にご協力いただいたSofia Diletta Guzzeloni氏に感謝いたします。また、Elements社のDr. Leon Juarez氏とDr. Michelangelo Paci氏に深く感謝申し上げます。本研究は、イタリアのパヴィア大学分子医学科のDipartimenti di Eccellenza (2023–2027) イニシアチブ、Cariplo財団（#2019-1809）、およびM.L.へのPNRR研究プログラムCN00000013「National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing」による支援を受けて行われました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPhPC)Avanti Polar Lipids850356P人工脂質二重層の形成
2-プロパノール（≥99.5%)Honeywell24137-5LBLMchipMMデバイスの洗浄
アガロースFisher BioReagentsBP160-500アガロースゲルの調製
アガロースゲル水平電気泳動装置BTLabSystemsBT102DNA断片の分離
アンピシリンFisher BioReagentsBP1760-25形質転換菌の選択
抗GFPナノボディSepharoseレジン（自家製）——GFPタグ付きタンパク質のアフィニティー精製
Anza アルカリホスファターゼInvitrogenIVGN2208ベクターの脱リン酸化
Anza EcoRIInvitrogenIVGN0116制限酵素消化
Anza NotIInvitrogenIVGN0014制限酵素消化
Anzaレッドバッファー (10×)InvitrogenIVGN2008制限酵素消化バッファー
アプロチニンプロテアーゼ阻害剤Fisher Scientific15996008タンパク質分解の防止
卓上遠心機EppendorfEP5420000164細胞のペレット化およびサンプル調製
BLMchipMMElements s.r.l.—平面脂質二重層の形成
コレステリルヘミコハク酸 (CHS)AnatraceCH210膜タンパク質の安定化
クマシーブリリアントブルーSigma-Aldrich1125530025タンパク質染色
一般的な家庭用漂白剤——Agワイヤの塩素化
DNase ISigma-Aldrich11284932001ライセート粘性の低減
二回蒸留水——緩衝液および溶液の調製
エタノール（純度99.9%）Girelli Alcool s.r.l.—Ag/AgCl電極線の洗浄
エチジウムブロマイドSigma-Aldrich1116080030DNA染色
極細目サンドペーパー——電線からのAg/AgClコーティングの除去
eNPR 100 kHz アンプElements s.r.l.—電気生理学的記録
アガロースからのDNA抽出用Gel-OutキットA&バイオテクノロジー023-250DNA精製
GeneRuler 1 kb DNAラダーThermo Fisher ScientificSM0311DNAサイズリファレンス
フリースタイル™ 293-FThermo Fisher ScientificR79007ancTREK1タンパク質の発現
HEPES (≥99.5%)Sigma-AldrichH3375-500G緩衝剤
ヘキサデカン (≥99%)Sigma-AldrichH6703-100ML開口部の前処理
ヘキサン (≥99%)Sigma-Aldrich139386-100ML脂質溶媒
自家製 5× DNAローディングダイ——DNAサンプル調製
自家製 6× Laemmli SDSバッファー（還元剤含有）——タンパク質試料の調製
自家製脱染色液——SDS-PAGEゲルの脱染色
自家製HRV-3Cプロテアーゼ——融合タンパク質の切断
自家製SDS-PAGEランニングバッファー（10×)——SDS-PAGE電気泳動バッファー
イミダゾールAlfa AesarA10221Hisタグ付きタンパク質の溶出
バッチ内精製カラム——タンパク質精製ワークフロー
Innova44振盪インキュベーターNew Brunswick InnovaM1282細胞培養増殖
KClHoneywell31248-1KG電解質および緩衝液の調製
LBブロス（レノックス）Condalab1231細菌培養
ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤Thermo Scientific78435タンパク質分解の防止
塩化マグネシウム六水和物Acros Organics447700010緩衝液成分
NanoDrop分光光度計DeNovixDS-11DNAおよびタンパク質の定量
n-ドデシル-βn-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM)NeoBiotechNB-19-0056-25G膜タンパク質の可溶化
Ni Sepharose High Performance レジンCytiva17526801IMAC精製
ノートパソコン——装置制御およびデータ収集
Optima LE-80K 超遠心機Beckman365668膜画分の単離
ペンタン（≥99%)Sigma-Aldrich236705-100ML脂質溶媒
ペプスタチンAプロテアーゼ阻害剤Thermo Scientific78436タンパク質分解の防止
Phusion GCバッファー (5x)×)Thermo Fisher ScientificF519PCRバッファー
Phusion 高正確性 DNA ポリメラーゼThermo Fisher ScientificF530SPCR増幅
PMSFプロテアーゼ阻害剤Thermo Scientific36978ライシス中のタンパク質保護
ポリエチレンイミン (PEI)臨床科学24765-100トランスフェクション試薬
ProteinEle プレキャスト Tris-Glycine ゲル (4%–20%)TransGen BiotechDG101-01-V2タンパク質分離
SDS-PAGEゲル電気泳動システムBio-Rad1658002FCタンパク質電気泳動
酪酸ナトリウムFisher ScientificA11079タンパク質発現増強剤
T4 DNAリガーゼThermo Fisher ScientificEL0011DNAライゲーション
T4 DNAリガーゼバッファー (10×)Thermo Fisher ScientificB69ライゲーションバッファー
サーマルサイクラー (Mastercycler Nexus)Eppendorf6331000025PCR増幅
トリス塩基Sigma-AldrichT1503-1KG緩衝液の調製
レシチンおよびポリソルベート80添加トリプトーゼ大豆カゼイン酵母酵母抽出物寒天培地HiMediaM449-5KG細菌の平板塗抹
2本の銀線Elements s.r.l.—電気生理学用電極
超遠心濃縮器（分画分子量 50 kDa）Merck AmiconUFC8050タンパク質濃度
pEG BacMam発現ベクターAddgene160687タンパク質発現
USBケーブル——アンプとコンピュータの接続

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