このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

新生マウスからの血管条線の一次境界細胞の単離および培養

360 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/69916

⸱

2026年3月20日

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 2Research Institute of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3The First Clinical School of Wuhan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、マウスの血管線条から原発周辺細胞の分離、精製、培養および酸化ストレスおよび細胞老化の in vitro モデルを確立し、蝸牛側壁疾患を研究するためのプロトコルを提示します。

要約

血管線条は内耳の主要な構造で、耳内蝸流電位(EP)の生成と維持を担い、その機能障害はさまざまな難聴と密接に関連しています。血管条状筋は周辺細胞、中間細胞、基底細胞から構成されており、その中で縁細胞はEPの生成と維持に中心的な役割を果たします。したがって、縁辺細胞の in vitro 一次培養モデルの確立は、線条体血管筋の生物学的特徴と難聴関連疾患への関与を調査するために不可欠です。

本研究では、新生マウスの血管条状筋から一次周辺細胞を単離し、培養することに成功しました。線条組織は顕微解剖で得られ、タイプIIコラーゲンで消化され、差別プレートで精製されてほとんどの線維芽細胞が除去され、培養細胞は7日目までに80%以上の合流率に達しました。免疫蛍光染色により、サイトケラチン18(CK18)およびカリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーQファミリー1(KCNQ1)の安定した発現が示され、周辺細胞の成功した分離、高い純度、そして生理的機能の保存が確認されました。

このモデルに基づき、過酸化水素(H2O2)とD-ガラクトースを用いて、in vitro酸化ストレスモデルと細胞老化モデルがそれぞれ確立されました。処理された細胞は細胞内活性酸素種(ROS)レベルが有意に増加し、老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-gal)陽性を示し、一次周辺細胞が酸化ストレスや老化誘発刺激に対して高い感受性を示しました。本研究は、マウスの一次辺縁細胞の培養およびモデル化のための安定かつ再現性のあるシステムを確立し、線条菌の機能障害および関連メカニズムを検証するための信頼性の高いin vitroプラットフォームを提供します。

概要

聴覚系では、蝸牛内のさまざまな組織が協調して複雑な音波を電気信号に変換します。1.血管条状筋は内リンパのイオン組成を調整し、内耳電位(EP)を生成することで蝸牛恒常性を維持し、内毛細胞と外毛細胞の正常な機能を確保します。この細胞は、周辺細胞、中間細胞、基底細胞の3つの異なる細胞タイプで構成されています。縁際細胞は分極した上皮単一層を形成し、内リンパに直接面し、密接合部によって密閉されています。縁縁細胞の基底外側膜は、筋状筋におけるナトリウムおよびカリウムイオン輸送の調節に関与する2つの重要なカリウム輸送体、Na⁺/K⁺-ATPaseとNKCC1で豊かにされています。Na⁺/K⁺-ATPaseの機能はEP 2,3と直接関連していることが示されています。KCNQ1/KCNE1 K⁺チャネルは周辺細胞の頂膜に位置し、EP4の形成に寄与する追加のK⁺拡散ポテンシャルを生み出します。限界細胞は複数のカリウム関連タンパク質で豊富に含まれており、蝸牛内リンパにおけるカリウムのリサイクルを駆動するコア細胞単位として機能します。したがって、限界セルはEPの生成と維持を担う重要な細胞です。

血管線条(SV)は、感音神経性難聴(SNHL)に関連する複数の疾患の発症に重要な役割を果たすことが示されています。これには、加齢性難聴(ARHL)、騒音性難聴(NIHL)、遺伝性難聴(HHL)、薬物性難聴(DIHL)が含まれます。さらに、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己炎症性内耳疾患(AID)、メニエール病(MD)など、病因学的には異なるものの、最近の研究ではSVがその基礎的な病因性メカニズムに関与していることが最近の研究で示されています。したがって、難聴の病因を調査するための信頼できる細胞モデルの確立が不可欠です。研究により、周辺細胞密度の減少はマウスの寿命全体を通じてEPの強力な予測因子となり、血管線条の萎縮はARHL 7,8における初期の特徴的な病変を示しています。限界細胞のin vitro培養は、ARHLの病因を研究し、潜在的な治療標的を探るための信頼できるモデルを提供します。ARHLを超えて、最近の研究では、血管筋と他の聴覚障害との間に高い相関関係や潜在的な関係があることが明らかになり、in vitroの縁際細胞モデルがより広範な応用を持つ可能性が示唆されています5,9,10。

本研究は、新生マウス蝸牛から血管条紋を解剖・培養し、その後差別プレートを用いて周辺細胞を精製するプロトコルを示し、線条管筋関連病変の研究に信頼できる細胞モデルを提供します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

新生マウスの子(P0-3)はBiontが提供しました。すべての実験手順は、米国国立衛生研究所(NIH公示、2011年改訂)が発表し、武漢大学人民病院動物倫理委員会(WDRM202400019)によって承認された実験動物のケアおよび使用ガイドラインに準拠していました。

1. 滅菌および材料準備

  1. 解剖用ツールを用意してください。マイクロ解離鉗子2組、標準鉗子1組、外科用ハサミ1組、マイクロ解離ハサミ1組です。すべての道具はオートクレーブで滅菌し、60°Cのオーブンで4時間乾燥させます。
  2. 製造元の指示に従って、上皮細胞培地-動物(EpiCM-a培地)を100mL準備してください。胎児用牛血清(FBS)、上皮細胞成長サプリメント(EpiCGS-a)、およびペニシリン/ストレプトマイシン溶液を基底培地に加え、最終濃度2% FBS、1% EpiCGS-a、1%ペニシリン/ストレプトマイシンの濃度を得ます。
  3. 立体顕微鏡のステージと筐体を75%エタノールで消毒してください。その後、高出力分解用の解剖器具と消毒済み顕微鏡を生物安全キャビネットに入れます。解剖作業を開始する前に、すべての物品を30分間UV光に当てて完全な滅菌状態を確保してください。

2. 聴覚上皮採取のための解離および側頭骨分離

  1. 新生マウスの子(P0-3)は4%のイソフルラン麻酔後に安楽死させ、75%エタノールで消毒し、氷上で斬首を行います。必要に応じて他の倫理的に認められた方法を使いましょう。
  2. 頭部を固定し、顕微解剖ハサミで矢状縫合に沿って頭皮を開き、両側に頭皮を分離して切除します。
  3. 新生マウスの頭部をマイクロディセッシングハサミで中央線に沿って二分します。鉗子で脳組織を除去し側頭骨を露出させます(図1A)。
  4. 頭蓋基部の両側側頭骨を観察し、不要な骨を除去し、蝸牛を含む側頭骨組織を保持します(図1B)。
  5. 側頭骨1本を、氷の上の新鮮なハンクス・バランスソルト溶液(HBSS)を入れた35mmの滅菌皿に移します。
  6. もう一方の側頭骨を顕微鏡下で移し、側頭骨組織を1対の鉗子で固定し、もう1組で表面筋組織の鈍い剥離を行い、白い半円形の耳小骨リングが見えるまで行います(図1C)。蝸牛の位置を確認した後、鈍い解離を下方向に続け、透明な蝸牛組織が観察されるまで続けます(図1D)。
    注意:ステップ2.6から2.7は氷上で行うべきです。
  7. マイクロ解離鉗子を使い、蝸牛の頂端の回転部で骨壁の小さな部分を慎重に取り出し、鉗子の片側を優しく蝸牛内に挿入し、骨壁を膜迷路から分離します。骨壁を除去し、膜状迷路組織を新鮮なハンクのバランス塩溶液(HBSS)で拡張します(図1E)。
  8. 基底膜を1対の鉗子で固定し、別の鉗子で血管筋筋を慎重に分離します。氷の上に置いた1.5mLのマイクロ遠心分離管に1mLの1mg/mLコラーゲンナーゼII型溶液を1mL入れたものに移します(図1F)。
  9. 上記の手順を繰り返して反対側から筋管線を採取します。

3. 筋束の縁際細胞を得るための酵素的分離

  1. 採取した組織を含むマイクロ遠心分離チューブを、1mg/mLのコラーゲン酵素II型溶液に37°Cで30分間培養します。
    注:コラーゲナーゼタイプII溶液は、リン酸緩衝塩水(PBS;2.7 mM KCl, 2.0 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl、10 mM Na2HPO4)で希釈して調製されました。
  2. チューブを300 × g で8分間遠心分離します。
  3. 上澄液を慎重に取り除きます。消化を終えるために培地1mLを加え、細胞を再懸浮させるために優しく乾燥し、再び300×gで遠心分離して8分間行います。
  4. 上澄液を吸引し、新鮮な培地1mLを加えます。単細胞懸濁液を得るために三層処理し、懸濁液を15 mLの円錐形チューブに移し、さらに培地を加えて総容量を10 mLに調整します。
  5. 細胞懸濁液を繰り返しピペッティングして十分に混合し、6ウェルプレートの各ウェルに1mLの懸濁液を移します。細胞を2 mLのDMEMに2% FBS、1% EpiCGS-a、1% ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を補足し、37°Cの5%CO2 インキュベーターで培養します。
  6. 培地を毎日交換し、細胞の状態を監視してください。縁辺細胞のクラスター増殖は通常、プレート付けから2日後に観察されます。

4. 縁際細胞の精製

  1. 培養3日目には、縁辺細胞の石畳のようなクラスターの周囲に多数の紡錘状線維芽細胞が現れるのを観察します(図2B)。
  2. 接着率の違いを利用して、ピペットでスピンドル状の線維芽細胞を部分的に除去します。1 mLピペットを使い、D-Hanksのバランス塩溶液を4つの象限それぞれの広い範囲に優しく洗浄します。顕微鏡で細胞の精製を監視し、ピペッティングの力と方向を調整してください。一般的に、大面積のフラッシュは2回行われます。各ラウンド終了後、線維芽細胞の密度を顕微鏡で観察します。これらの観察に基づき、密度の高い線維芽細胞領域に局所的に優しくピペッティングを行い、培養皿全体にまばらで均一な分布を実現します。
    注:線維芽細胞の密度は適切なものに保たれました。完全な除去や過剰な精製は一次細胞の成長を制限する可能性があるためです。周辺細胞と線維芽細胞の比率はおおよそ2:1に保つことを推奨します。
  3. 顕微鏡検査で線維芽細胞が周辺細胞群にまばらに分布している場合は精製を停止します。上清液を取り除き、新鮮な培地2mLを加えて培養を続けます。

5. 免疫蛍光染色

  1. 精製後2日目には、顕微鏡で細胞の形態を観察します。適切な細胞クラスター形成と適切な密度が確認されたら、培養培地を吸引し、リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で細胞を3回洗浄します。
  2. 4%のパラホルムアルデヒドを室温で15分間固定します。固定液を除去した後、PBSで細胞を3回洗い(1回5分)洗います。
  3. 0.5%のトリトンX-100で細胞を15分間透過させます。溶液を取り出し、PBSでセルを3回洗い(1回5分)洗います。
  4. 室温で30分間、10%ヤギ血清を含むPBSで細胞をブロックします。
  5. ウサギ用抗マウスCK18モノクローナル抗体(3%ヤギ血清を含むPBSに1:300希釈)またはKCNQ1抗体(G-8)(3%ヤギ血清を含むPBSに1:100希釈)を4°Cで一晩培養します。
  6. PBSでセルを3回洗います(1回10分)。対応する二次抗体(3%ヤギ血清を含むPBSに1:300希釈)を室温で1時間インキュベートします。
  7. 二次抗体を除去し、PBSで細胞を3回洗浄します(1回10分)。
  8. DAPIを含むアンチフェードマウンティングメディウムを1〜2滴スライドに塗布し、カバースリップを取り付け、共焦点レーザースキャンシステムで標本を検査します。
    注:洗浄工程を除き、抗体を含むすべての培養液は細胞を完全に覆うほどの量で添加されました。

6. H2O2 処理とROS染色

  1. 7日間の培養後、周辺細胞が合流単分子層を形成した際に、1 mM H2O2で酸化ストレスを誘導します。30%のH2O2 のストック溶液を上皮細胞培地に1:10000で希釈して1 mMの作動溶液を準備します。この作業液で実験群をインキュベートし、対照群は上皮細胞培地のみで処理します。
  2. 16時間の処理後、培地を慎重に取り出し、細胞をPBSで洗浄します。製造元のプロトコルに従い、活性酸素種アッセイキットを用いて限界細胞の細胞内ROSレベルを評価します。
  3. 培養培地を取り出し、希釈したミトトラッカーレッドCMXRos(ミトコンドリア選択性染料)とDCFH-DAを細胞に加え、細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間培養します。
  4. 細胞をPBSで3回(各5分)洗浄し、カバースリップを取り付け、共焦点レーザー走査顕微鏡でサンプルを観察します。

7. D-ガラクトース処理およびSA-β-ガル染色

  1. 7日間の培養後、周辺細胞がコンフルな単分子層を形成すると、D-ガラクトース粉末をEpiCM-a培地に溶解し、40 mg/mLのD-ガル作動溶液を製製しました。この溶液(6ウェルプレートのウェル1ウェルあたり2mL、37°Cで48時間)を実験群に培養し、細胞老化を誘導し、対照群は同じ量のエピ培地のみで処理します。
  2. 処理48時間後、培地を慎重に取り出し、PBSで細胞を洗浄します。製造元の指示に従い、SA-βガル染色キットを用いて周辺細胞の細胞老化を評価してください。
  3. 細胞を固定液で室温で15分間固定します。固定剤を除去した後、PBSで細胞を3回洗い(1回5分)洗います。
  4. 細胞を、CO2なしの加湿インキュベーターで、5% X-Gal(6ウェルプレートのウェルごとに1mL)を含むSA-βガロン染色作動液を37°Cで加湿インキュベーターで一晩培養します。
  5. 顕微鏡を用いて明視野照明下でのSA-βガル染色の画像を撮影します。

8. 統計分析

  1. H₂O₂処理群と対照群間のROS染色の平均免疫蛍光強度、およびD-ガラクトース処理群と対照群間のSA-βガル陽性細胞の割合の比較については、正常性およびログ正常性の評価後にt検定を適用します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

培養細胞の成長および形態的特徴
このプロトコルを用いて、マウス蝸牛から分離した周辺細胞の一次培養を成功裏に確立しました。培養2日目に、光学顕微鏡検査により細胞が基質に付着し、クラスタリングコロニーを形成し始めていることが明らかになりました(図2Aa)。3日目に細胞を精製しました(図2B)。その後の数日間の観察により、一次限界細胞は指数関数的に拡大し、特徴的な石畳のような形態を示し、7日目には約80%の合流率に達したことが明らかになりました(図2Ab-d)。

細胞精製後2日目に免疫蛍光(IF)染色によりCK18発現が確認され(図2C)、85%以上の細胞でCK18の免疫蛍光染色が陽性となり、十分な純度を持つ一次...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

数十年にわたり、聴力低下に関する研究は主に感覚有毛細胞の役割と螺旋神経節ニューロンとのシナプス接続に焦点を当ててきました11。多数の研究が有毛細胞のin vitro培養モデルの確立と最適化に捧げられており、これらは有毛細胞の損傷、再生、耳毒性薬の影響の調査に不可欠な役割を果たしています(12,13)。しかし、増え続ける研究やレビューでは、聴覚系における血管筋筋の重要な役割が長らく見過ごされてきたことが強調されています6。血管筋は内リンパのイオン組成を調整し、有毛細胞が正常な機能を維持するために依存するEPを生成する役割を担っています14。病理学的研究により、血管条紋の老化と変性がARHL15の初期の特徴病変であることが確認されています。有毛細胞だけ...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、この研究に商業的または財務的な利益相反はないと宣言しています。

謝辞

武漢大学人民病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科および武漢大学人民病院耳鼻咽喉科・頭頸部外科研究所(武漢、中国)の寛大な支援と励ましに心より感謝申し上げます。この研究は、中国国民保健サービスセンター建設・孵育基金(ZX0000000037年)、中国国家自然科学基金(81700916年、82301294年)、湖北省自然科学基金(2017CFB242)、湖北省衛生委員会科学研究プロジェクト(WJ2017Q005年)の支援を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL遠心分離機チューブサービスバイオEP-1501-J文化のための利用
35mm細胞培養皿ネスト706001解剖に使う
4% パラホルマルデヒドサービスバイオG1101免疫蛍光染色
6井戸プレートサービスバイオCCP-6H文化のための利用
Alexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギ抗体プロテインテックSA00013-2免疫蛍光染色
DAPIを用いたアンチフェードマウントメディウムアブシンABS9235免疫蛍光染色
細胞計数キット-8ビヨタイムC0037セルカウントに使用
コラーゲン酵素タイプIIバイオシャープBS164文化のための利用
共焦点レーザー走査システムオリンパス FV1200免疫蛍光染色
DCFH-DAインビトロジェンC2938ROS染色
D-ガルソーラービオD8310セルモデリングに使用
EpiCM-a メディアサイエンスル4131文化のための利用
細かい鉗子後輪駆動F11020-11解剖に使う
ヤギ血清ビヨタイムC0265免疫蛍光染色
H2O2ムクビオMM0707セルモデリングに使用
ハンクのバランスソルトソリューション(HBSS)バイオシャープBL561A文化のための利用
イソフルラン後輪駆動R510-22-10解剖に使う
KCNQ1抗体(G-8)サンタクルスSC-365186免疫蛍光染色
顕微鏡オリンパス SZX7-1063解剖に使う
顕微鏡オリンパス IX71免疫蛍光染色の結果の観察に使用されます
ミトトラッカー レッド CMXRosインビトロジェンM7512ROS染色
新生マウスの子(P0-P3)BIONT提供
PBSサービスバイオG4202免疫蛍光染色
ウサギ抗マウスCK18モノクローナル抗体プロテインテック10830-1-AP免疫蛍光染色
セネセンス&β;-ガラクトシダーゼ染色キットビヨタイムC0602老化染色
トライトン X-100シグマ・オルドリッチX100免疫蛍光染色

参考文献

  1. Raphael, Y., Altschuler, R. A. Structure and innervation of the cochlea. Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).
  2. Bovee, S., et al. The stria vascularis: Renewed attention on a key player in age-related hearing loss. Int J Mol Sci. 25 (10), 5391(2024).
  3. Schulte, B. A., Schmiedt, R. A. Lateral wall Na,K-ATPase and endocochlear potentials decline with age in quiet-reared gerbils. Hear Res. 61 (1-2), 35-46 (1992).
  4. Hibino, H., et al. How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus. Pflugers Arch. 459 (4), 521-533 (2010).
  5. Johns, J. D., et al. The role of the stria vascularis in neglected otologic disease. Hear Res. 428, 108682(2023).
  6. Yu, W., et al. Role of the stria vascularis in the pathogenesis of sensorineural hearing loss: A narrative review. Front Neurosci. 15, 774585(2021).
  7. Ohlemiller, K. K., et al. Cellular correlates of age-related endocochlear potential reduction in a mouse model. Hear Res. 220 (1-2), 10-26 (2006).
  8. Mahendrasingam, S., et al. Relative time course of degeneration of different cochlear structures in the CD/1 mouse model of accelerated aging. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (4), 437-453 (2011).
  9. Lee, J. E., et al. Mechanisms of apoptosis induced by cisplatin in marginal cells in mouse stria vascularis. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 66 (3), 111-118 (2004).
  10. Ohlemiller, K. K., et al. The endocochlear potential as an indicator of reticular lamina integrity after noise exposure in mice. Hear Res. 361, 138-151 (2018).
  11. Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Cochlear synaptopathy in acquired sensorineural hearing loss: Manifestations and mechanisms. Hear Res. 349, 138-147 (2017).
  12. Levano, S., et al. Whole neonatal cochlear explants as an in vitro model. J Vis Exp. (197), e65160(2023).
  13. Wu, K. Y., et al. Isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice. J Vis Exp. (199), e65687(2023).
  14. Schmiedt, R. A., et al. Effects of furosemide applied chronically to the round window: A model of metabolic presbyacusis. J Neurosci. 22 (21), 9643-9650 (2002).
  15. Kurata, N., et al. Histopathologic evaluation of vascular findings in the cochlea in patients with presbycusis. JAMA Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (2), 173-178 (2016).
  16. Wangemann, P., et al. Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model. BMC Med. 2, 30(2004).
  17. Ding, L., Wang, J. miR-106a facilitates the sensorineural hearing loss induced by oxidative stress by targeting connexin-43. Bioengineered. 13 (6), 14080-14093 (2022).
  18. Wan, H., et al. PARP1 inhibition prevents oxidative stress in age-related hearing loss via PAR-Ca(2+)-AIF axis in cochlear strial marginal cells. Free Radic Biol Med. 220, 222-235 (2024).
  19. Zhang, Y., et al. Decreased poly(ADP-ribose) polymerase 1 expression attenuates glucose oxidase-induced damage in rat cochlear marginal strial cells. Mol Neurobiol. 53 (9), 5971-5984 (2016).
  20. Fetoni, A. R., et al. Pathogenesis of presbycusis in animal models: A review. Exp Gerontol. 46 (6), 413-425 (2011).
  21. Marie, A., et al. Senescence-accelerated mouse prone 8 (SAMP8) as a model of age-related hearing loss. Neurosci Lett. 656, 138-143 (2017).
  22. Li, W., et al. Rodent models in sensorineural hearing loss research: A comprehensive review. Life Sci. 358, 123156(2024).
  23. Bommakanti, K., et al. Cochlear histopathology in human genetic hearing loss: State of the science and future prospects. Hear Res. 382, 107785(2019).
  24. Nicolson, T. Navigating hereditary hearing loss: Pathology of the inner ear. Front Cell Neurosci. 15, 660812(2021).
  25. Liu, W., et al. Applications and challenges of CRISPR-Cas gene-editing to disease treatment in clinics. Precis Clin Med. 4 (3), 179-191 (2021).
  26. Guo, D., et al. Establishment methods and research progress of livestock and poultry immortalized cell lines: A review. Front Vet Sci. 9, 956357(2022).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

辺縁細胞の単離初代細胞培養新生マウス内耳マイクロダイセクション法コラゲナーゼ消化分画播種法免疫蛍光染色酸化ストレスモデル細胞老化
新生マウスからの血管条線の一次境界細胞の単離および培養
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。