溶剤鋳造技術によるマイクロニードルアレイパッチの溶解およびマイクロニードルベースの生体医療機器の本質的特徴評価

Summary

本研究は、研究者が溶剤鋳造法(マイクロモールディング)を用いて自らのDMAPデバイスを準備し、基本的な特性評価を行うための実践的なガイドとなることを目的としています。

Abstract

マイクロニードル技術は皮膚および経皮送達の研究分野に革命をもたらし、現在では皮膚を通じて薬物を投与する最も直接的な方法と考えられています。マイクロニードルアレイパッチ(MAP)の成功は主に、外用薬剤の侵入を防ぐ皮膚バリア機能を無痛に角 質 層に貫通することで無効化できる能力にあります。溶解型MAP(DMAP)は、構成材料の生体適合性、患者による自己投与の可能性、使用後に発生する鋭い廃棄物の存在がない点から、他のMAPベースのデバイスタイプと異なります。DMAPは通常、皮膚に挿入すると再拡散し、その物質を放出するポリマー材料で作られています。実験台レベルでは、DMAPは一般的に溶剤鋳造法で製造されます。これは、目的のMAP形状と長さのネガマスターモールドを使用し、その上に薬物充填されたポリマー分散を鋳造します。その後、遠心力や正圧を加えることで型の空洞を埋めることを強制されます。乾燥後、DMAPは固体化し、マスターモールドから剥がされ、使用前に様々な特性評価が定期的に行われます。これらのアッセイは通常、DMAPの機械的特性の研究、残留水分含有量の決定、 皮膚 構造への外部浸透能力、薬物放出性能、および生体適合性の in vitro 評価を含みます。

Introduction

薬理活性物質を皮膚内および皮膚内への局所および経皮投与は経口薬物投与の有望な代替手段と考えられていますが、角質層が自然に働く皮膚バリア機能により大きな課題があります。この制限は特に分子量>500 Da¹の大型分子に強く影響します。さらに、親水性や脂溶性など特定の物理化学的特性を持つ他の分子の皮膚を通じた受動拡散も制限されます。この障壁を克服するために、イオントフォレシス、ソノフォレシス、電気穿孔法、化学増強剤の使用、熱法、ナノサイズシステムなど、さまざまな技術的戦略が提案されています。それでも、マイクロニードルアレイパッチ(MAP)は、角質層の機能を極めて効率的に無効化できること、費用対効果、患者にとって痛みのない体験、そして医療従事者を介さずに自己投与が可能であることなど、いくつかの利点から際立っています^。

DMAPは一般的に溶剤鋳造法またはマイクロ^{モールディング6}で製造されます。この製造技術は、望ましいMAPの形状と長さのネガマスタモールドを使用することに基づいています。薬剤やナノサイズのシステムを充填したポリマー分散体を鋳造した後、外部からの力が加えてマスターモールドのマイクロニードル形状の空洞を充填します。乾燥後、DMAPは剥がすか、化学薬剤でマスター型を溶かして慎重に脱型できます。これらのマスターモールドは異なる素材で作られており、ポリジメチルシロキサン(PDMS)が最も一般的で、その柔軟性と低い接着性によりDMAPの脱臼が容易です。マスターモールドの準備は通常リトグラフ法を用いて行われます。しかし、現在では様々な形状、長さ、密度のマイクロニードルの市販PDMS金型が利用可能です。

ここでは、溶媒鋳造技術を用いたDMAPの調製に関するガイドラインを示します。この場合、遠心力または正圧をかけてプロセスが行われます。これにより、MAPsベースの生体医療機器の高コスト製造方法に代わる効率的なコストのプロトコルが提供され、より多くの研究者が皮膚関連の研究にMAPを取り入れることが可能になります。さらに、in vivo 試験に先立つ学術的および基礎研究目的の重要な特徴付けには、針の長さと幾何学、圧縮に対する機械的抵抗性、 体外 挿入性能、薬物の負荷と放出、残留水分含有量、安定性、 体 外薬物吸収、 in vitro 安全性プロファイルが含まれます。

Protocol

本研究で使用される試薬および装置は 材料表に記載されています。

1. 遠心分離による溶解マイクロニードルアレイの製造

1. DMAPの構成物質を適切な量の水に溶かし激しくかき混ぜることで、水性コロイド分散を準備します。選択されるポリマーや濃度によって、分散時間は異なる場合があります。必要に応じて、ポリマーの拡散を促進するために水を適度(40〜45°C)温めてください。
   注:DMAPの製造に最も一般的に使われるポリマーは、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、カラヤガム、ヒアルロン酸(HA)、ポリ(メチルビニルエーテルアルトマレ酸)(PMVE-MA)、ポリ(ビニールアルコール)(PVA)、カルボキシメチルセルロース(CMC)、キトサンなどですが、最適な特性を持つ他の水溶性材料も使用できます。ほとんどの配合で、一般的な作動濃度は5%から30%のw/wの範囲です。低濃度では一般的に速溶性のDMAPが生成され、高濃度では低溶解のデバイスが生成されます。しかし、最適な濃度は、ポリマーの分子量、粘度、マイクロ針の望ましい機械的特性に依存するため、異なるDMAP試作機を準備して経験的に決定する必要があります。
2. ポリマーを一晩中最小限にかき混ぜて完全に分散させ、気泡を除去します。
3. 気泡が残る場合は(1000 x g; 5分; 25°C)遠心分離機で高分子の分散を制御します。
4. 貨物(薬物またはナノサイズ粒子)を所定の濃度で加え、新しい気泡を含まない均一になるまで適度にかき混ぜます。
5. PDMS金型は12ウェルプレートに処理します。そのためには、モデリング用の粘土やデンタルセメント、または類似の素材で型を井戸に収めてください。
6. 薬剤充填ポリマーブレンド50μLをPDMSの金型と遠心分離機(3000× g;5分、25°C)に鋳造します。その後、プレートを180°回転させ、遠心分離を繰り返して針状の空洞が完全に満たされるようにします。
7. 過剰な薬物含有ポリマー分散を慎重に除去してください。液体の場合はピペットでポリマー分散を移してください。粘度が高い場合はヘラを使いましょう。
8. 二重遠心分離(ステップ1.6)を繰り返し、前の工程で溢れ出した可能性のある薬物を含み重ねたポリマー分散を型に戻します。
9. 薬剤を含んだ高分子分散を真空(600 mBar; 30分; 25°C)で乾燥させます。
10. マスターモールドに薬剤充填されたポリマー分散液を正しく充填するために、ステップ1.6から1.9の手順を少なくとも2回繰り返してください。
    注意:遠心力は、各回の繰り返しで500 x g (25°C)ずつ段階的に減らすことができます。
11. DMAPデバイスのベースプレートを作るために、薬物を含まない高濃度ポリマー分散を準備します。これにより、モールドキャビティ内の分散充填中の薬物がベースプレートに戻らないようにします。
12. 50μLの自由薬物ポリマー分散液をPDMS金型に鋳造し、遠心分離で2回(中間板も含む)180°(500 x g; 5分; 25 °C; 2x)で広げます。遠心分離後、各型に分散液100μLを加え、12時間後にベースプレートにさらに50μLを加えます。
13. DMAPはPDMSの型に入れて、室温のドライシール乾燥器で3〜5日間乾燥させます。
14. PDMSからDMAPを慎重にピンセットで脱臼するか、スコッチセルローステープで剥がす(図1)。
15. 製造されたDMAPの特徴を付けます(ステップ3参照)。

2. 正圧を施して溶解マイクロニードルアレイの製造

1. 前節で説明した通り、ステップ1.5まで同様に進めてください。
2. 薬剤充填ポリマーブレンド150μLをPDMSの金型に鋳造し、圧力タンクに入れます。
3. 圧力タンクに空気を注ぎ、少なくとも15分間3〜4バールの圧力に達するまで続けます。
4. 過剰な薬物含有ポリマー分散を慎重に除去してください。そのため、ポリマー分散が液体の場合はピペットを使い、粘度がかなり高い場合はヘラで除去してください。
5. 前段階で溢れ出した可能性のある薬物を含むポリマー分散を型に戻すために、再度圧力をかけます(ステップ2.2-2.3)。
6. 薬剤を含んだポリマー分散を真空(600 mbar; 30 min; 25 °C)で型内で乾燥させます。
7. DMAPデバイスのベースプレートを作るために、薬物を含まない高濃度ポリマー分散を準備します。これにより、モールドキャビティ内の分散充填中の薬物がベースプレートに戻らないようにします。
8. 自由薬物高分子分散液を0.2gPDMS金型に鋳造し、ステップ2.3で説明した通り正圧をかけます。
9. ステップ1.13の前節で説明した通りに進めてください。

3. DMAPの特徴付け

注:この段階では、人間および/または動物の皮膚組織を使用する方法が、機関のガイドラインに従って実施されました。さらに、動物の皮膚サンプルを使用する方法は、動物実験における3Rs原則に従って実施されました。

1. 適切な倍率のマイクロカメラでDMAPを可視化し、針状の突起を識別する^7.
   注意:もし色付きの薬物や染料が注入されている場合、先端とベースプレートの間に異なる色が見える必要があります。
2. DMAPを補助装置に取り付け、光学顕微鏡で微細針状突起の形態と長さを可視化します。鋭い先端の構造を観察する必要があります。マイクロニードル状の突起の長さは、光学顕微鏡に適したソフトウェアで記録してください。
   注:光学顕微鏡でマイクロニードル長を測定するには、MAPを対物レンズに対して垂直に表示する必要があります。長さの測定やマイクロニードル状突起の形状は走査型電子顕微鏡で確認されなければなりません。
3. 圧縮後のマイクロニードルの変形に対するDMAPの機械的特性を評価します。そのため、DMAPの装置を市販のDMAPアプリケーターに入れ、ステンレス製の平らな表面に30秒圧縮します。圧縮後、マイクロニードル状の投影の長さを記録し、次の式⁷に従って初期長さと比較して変形率を計算します。
   
   ここで、h_o と h_f はそれぞれ圧縮前後のマイクロニードル長を表します。
   注:利用可能な場合、テクスチャアナライザーの使用により圧縮力が標準化されます。この場合、32N/アレイの力は、DMAPデバイスを自己投与する際に患者が加える平均的な親指力に相当します。
4. オレフィン系材料で作られた熱可塑性シートに基づく代替人工皮膚法によるDMAPの予備挿入能力を決定します⁸。そのために、ステップ3.4で説明された条件に従い、DMAPsデバイスを8枚のバウンドシートに圧縮します。各層にできる穴の数は光学顕微鏡や顕微鏡カメラで観察され、異なる深さでの貫通率が計算されます。
   注:市販の熱可塑性シートは通常127μmの厚さを示します。
5. 以前に切除し慎重にトリミングされたヒト、豚、齧歯類の皮膚エクスプラントを用いて、DMAPの 体外 挿入能力を測定します。皮膚をたっぷりの水で1〜2分間水に浸して洗浄し、その後、アルミホイルで包んだフォームの上に置き、 角質 層の面を上に向けて置きます。
   1. ステップ3.4で説明された条件で挿入を進めてください。マイクロニードルの先端が溶けるまでDMAPを皮膚に挿入したままにしてください。DMAPに染料や着色剤が充填されている場合、皮膚の内外両側の着色が成功したDMAP挿入を示します。さらに、皮膚切片の組織学的解析によってマイクロチャネルが観察されます^。
      注:このステップは 生体外 のヒトまたは動物の皮膚を対象とし、バレンシア大学の人間・動物研究倫理委員会のガイドラインおよび承認に従って実施されました。該当する場合にはインフォームド・コンセントが得られ、すべての実験は生物医学研究におけるヒトおよび動物組織の使用に関する機関および欧州の倫理基準に従って行われました。
6. 残留水分量は熱重力分析で決定します。100〜110°Cまで観察された体重減少は残留水¹⁰によるものと考えられています。
   注:文献資料によりますが、DMAPの最適な乾燥を確保するために、最大残留水分量は総重量の5%〜10%と許容されています。
7. DMAPを5〜10 mLの水(または分析対象薬剤に適した水放出培地)に32〜37°Cで浸し、最適な分析方法で貨物量を定量化します。
   注:UV-Vis分光光度法は小分子の分析に一般的に用いられます。検出限界や定量限界が低い化合物では、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)とUV-Vis、蛍光、または電気化学的検出を組み合わせることが強く推奨されます。HPLCと質量分析法の組み合わせは、卓越した感度と特異性が求められる場合に用いられます。タンパク質および抗体の解析的決定は通常、ビシンコニン酸(BCA)アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)やウェスタンブロッティングなどの免疫アッセイを用いて行われます。薬物放出プロファイルは、放出^水性培地からあらかじめ決められた時間点で0.2-1mLをサンプリングすることで取得されます。各サンプリングポイントの後、減量された体積は同じ体積の強化放出媒体に置き換えられ、サンプルの自動濃縮に関する誤差を回避します。
8. 上記の特性評価アッセイを繰り返し行って、DMAPの特徴が設計された保存条件下で一定に保たれるようにします。
   注意:貨物が熱安定性がある場合、DMAPは通常室温(25°C)で保管されます。熱に敏感な有効成分の場合、DMAPは4°Cで保存されます。 相対湿度は30%以下に保つべきです。DMAPの安定性は6か月間にわたり定期的に監視されます。
9. フランツ拡散セル(FDC)装置を用いて、 生体外 薬物の皮膚沈着および吸収を決定します。そのために、説明通り皮膚を準備し、DMAPを3.6の手順で30秒間皮膚構造に挿入します。
   1. その後、FDCのドナーチャンバーを適切な量のシアノアクリレートで皮膚に接着します。乾燥後、適切なクランプ¹²を使って皮膚ドナーチャンバー複合体を受容体チャンバーに結合させます。最後に、3.5小節に記載されたサンプリングプロトコルを進めます。
      注:この生 体外 のヒトまたは動物の皮膚を用いたステップは、バレンシア大学の人間・動物研究倫理委員会のガイドラインおよび承認に従って実施されました。該当する場合にはインフォームド・コンセントが得られ、すべての実験は生物医学研究におけるヒトおよび動物組織の使用に関する機関および欧州の倫理基準に従って行われました。DMAPがゆっくり溶ける場合は、皮膚構造からの自動排出を防ぐために外科用接着バンドで皮膚に固定してください。
10. 製造元の指示に従い、テトラゾリウム系およびレサズリン系アッセイ、または5-ブロモキシウリジンブロモデオキシウリジン(BrdU)アッセイを含む増殖試験を用いて、 in vitro の生体適合性を評価します。
    注:好まれる細胞株はケラチノサイト、線維芽細胞、またはメラノサイトです。DMAPに曝露されていない細胞は通常、陰性対照として用いられ、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で処理された細胞は陽性対照として用いられます。生体適合性の評価はDMAPの溶解プロファイルに依存します。24時間以内に溶解する速溶DMAPでは、抽出ベース法が用いられ、細胞曝露前にデバイスを溶解します。スロー溶解型DMAPでは直接接触法を適用し、装置を直接シード井戸に追加します。国際規格ISO 10993規則によれば、細胞の生存率の結果>70%は無毒とみなされます。

Results

製造されたDMAPは均質な外観を示し、 図2Aに示されるようにマイクロニードル状の突起が成功裏に形成されている必要があります。着色貨物をマイクロニードル構造にだけ装填する場合、チップからの薬物オーバーフローや、鋳造前の洗浄不完全により少量の薬物がDMAPのベースプレートを汚染することがあります。しかし、両構造の間には明確な違いが観察されます。光学顕微鏡で観察した場合、マイクロニードル状の突起は鋭い先端を持ち、変形が見られません(図2B)。これらの観察結果は走査型電子顕微鏡(SEM)イメージングで確認することが強く推奨されますが、長さの測定差は通常無視できる程度です。

DMAPの圧縮により、 図2Cに示される針状の構造が得られます。変形の程度はポリマーの種類や濃度によって異なり、材料濃度が高いほど機械的抵抗が高くなり、したがって圧縮性も低く...

Discussion

ここで説明するプロトコルはDMAPの準備を可能にします。しかし、DMAPの製造に使用できる多用途性と多様なポリマー材料により、異なる特徴を持つ溶解デバイスの製造が可能です。提示された結果は、低濃度で水に分散性の高いポリマーPVPを用いて生成されたことから、速溶性DMAPに対応しています。DMAPの溶解時間は、構成ポリマーを置換するか濃度を変えるだけで簡単に調整できます。したがって、材料の選択は製造過程における重要なステップであり、ユーザーは開発された装置の理論と目的に従って賢明に選ぶ必要があります。

さらに、ここで示すDMAPはマイクロニードル状の突起内にのみ貨物が積み込まれているため、システムによる薬物供給量が制限されています。特に有効成分の濃度は最大5%に達します。しかし、分子量、構造、性質によっては、ポリマー材料との相互作用が異なり、乾燥時に機械的特性が変化することがあります。したがって、このタイプのDMAPは主に局所皮膚疾患の治療を目的としており、全身薬剤レベルを達成するのは非常に困難です。特に、ワクチン接...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
細胞培養12ウェルプレート	該当なし	該当なし	仕様はない。市販の12ウェル培養プレートはどれでも適しています
遠心分離機	エッペンドルフ	遠心分離機 5810 G	細胞培養プレートに適応した他の遠心分離機に置き換えることができます
メチレンブルー	シグマ・オルドリッチ	66720	CAS 122965-43-9。他の染料やブランドで交換可能です
粘土の造形	該当なし	該当なし	仕様はない。市販のモデリング用粘土はどれでも適しています
オレフィン型熱可塑性シート	アムコア	PM996	パラフィルムM
ポリ(ビニールアルコール)(PVA)MW:9-10 kDa	シグマ・オルドリッチ	363146	CAS 9002-89-5。他のブランドで交換可能です
ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)MW:40 kDa	シグマ・オルドリッチ	PVP40	CAS 9003-39-8。他のブランドで交換可能です
ポリジメチルシロキサン(PDMS)型	マイクロポイント・テクノロジーズ	ST-06	アレイ針の分布は15 x 15;ハイト600&マイクロ;m;ベース200とマイクロ;m;ニードルピッチ500 & micro;m。他のPDMS型で、他のキャビティ形状や長さの金型に交換可能です
圧力タンク	プロトリマ	AT-10HT	4バール圧力をサポートする他の圧力タンクと交換可能です