方法論記事

ラットにおけるチモキノンのKeap-1/Nrf-2シグナル伝達、酸化ストレスおよび行動への効果の評価

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DOI：

10.3791/69924

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2026年3月13日

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

この記事について

サマリー

本プロトコルは、亜慢性デルタメトリン曝露ラットモデルにおいて、チモキノンがKeap-1/Nrf-2経路、酸化ストレスバイオマーカー、行動結果に与える影響を評価する方法を示します。

要約

農薬曝露研究の最近の進展により、抗酸化物質を用いた保護戦略への関心が高まりました。チモキノン(TQ)は植物由来の生物活性化合物であり、さまざまな有害物質に対して保護効果を発揮すると報告されています。本研究は、低用量デルタメトリン(DTM)に曝露されたラットにおけるTQが酸化ストレスパラメータ、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達経路、行動転帰に与える影響を評価するプロトコルを説明しています。ここでは、24頭の成体オスのウィスター・アルビノラット(250±20g)が4つのグループ(n=6/グループ)にランダムに割り当てられました:対照群、TQ、DTM、DTM+TQ。DTM(1.28 mg/kg)およびTQ(10 mg/kg)は30日間胃内投与されました。研究期間中、体重は継続的にモニタリングされました。運動活動と不安様行動は31日目のオープンフィールドテストで評価され、うつ様行動は32日目の強制泳ぎテストで評価されました。実験期間終了時には、生化学的、組織病理学的、分子分析のために血漿と脳組織が収集されました。マロンジアルデヒド、総一酸化窒素、グルタチオン、硫酸化ドリル群レベルなどの酸化ストレスマーカーが、血漿および大脳皮質サンプルで測定されました。ケルチ様ECH関連タンパク質1(Keap-1)および核因子赤胞菌2関連因子2(Nrf-2)の発現レベルをウェスタンブロッティングおよび免疫組織化学を用いて解析しました。このプロトコルは、農薬誘発性の神経毒性および抗酸化化合物の調節効果を包括的かつ再現性のある方法で調査します。

概要

殺虫剤は農業や家庭環境で害虫駆除に広く使用されています。しかし、低用量への慢性的な曝露は環境汚染や人間・動物の健康悪影響を引き起こす可能性があります。特に汚染された食品や水を通じたこのような曝露は、神経障害やその他の全身毒性のリスク増加と関連しています。

ピレスロイドは、有機リン系殺虫剤の規制が厳格で哺乳類毒性が比較的低いため、主に有機リンに取って代わっています。DTMは、αシアノ基を含むタイプIIピレスロイドで、世界的に最も一般的に使われている殺虫剤の一つであり、昆虫に対して非常に効果的と考えられています2。それにもかかわらず、実験的研究により、DTM曝露が動物モデルにおいて酸化ストレスや神経毒性を引き起こすことが示されています3,4。

DTMは非常に脂溶性の化合物で、血液脳関門を容易に通過し、電圧依存性ナトリウムチャネルの開放を遅らせることで神経機能を妨げます。この効果は繰り返しの神経放火、細胞内ナトリウム流入の増加、活性酸素の生成増加を引き起こし、最終的には酸化損傷、炎症、行動の変化を引き起こし、特に海馬や大脳皮質1といった脆弱な脳領域に影響を及ぼします。農薬による神経毒性への懸念が高まる中、自然由来の抗酸化物質を用いた保護戦略への注目が高まっています。ナイジェラ・サティバのエッセンシャルオイルの主要なバイオアクティブ成分であるTQは、強力な抗酸化作用、抗炎症作用、神経保護特性を持つと報告されています5。いくつかの研究で、化学的に誘発される酸化ストレスや神経変性過程に対して有益な効果があることが示されています 5,6,7,8,9。

TQの保護効果の主なメカニズムの一つは、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達経路の調節です。この経路は抗酸化酵素の発現や解毒酵素の発現を調節することで、細胞内の酸化還元恒常性を維持する上で中心的な役割を果たします。酸化ストレス条件下では、Keap-1媒介によるNrf-2の抑制が緩和され、Nrf-2が核に移動して抗酸化反応要素依存性遺伝子発現を活性化します。

DTM曝露は分子、生化学的、組織学的、行動的レベルでの変化を引き起こすため、単一の分析アプローチではその神経毒性の影響の全容を捉えきれません。したがって、本プロトコルは行動評価、酸化ストレスバイオマーカー解析、組織病理学的評価、Keap-1/Nrf-2経路の分子調査を統合し、農薬誘発性神経毒性およびTQなどの抗酸化化合物の調節効果を包括的かつ再現性の高い枠組みとして研究しています。

上記のエビデンスを総合すると、DTM誘発性神経毒性のメカニズムを明らかにし、潜在的な保護的介入を評価するための統合的実験的アプローチの必要性が浮き彫りになります。行動評価とKeap-1/Nrf-2経路の生化学的、組織病理学的、分子解析を組み合わせることで、本プロトコルは酸化ストレス関連神経損傷の多次元評価を可能にします。この機構的枠組みのもとでの実験結果の解釈は、TQがレドックスシグナル伝達を調節し、組織損傷を軽減し、亜慢性DTM曝露の文脈で行動結果を改善することを強調しています。

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プロトコル

施設動物実験地域倫理委員会は、登録番号68429034/35の実験プロトコルを承認しました。研究の総期間は32日間でした。実験前に、動物たちは標準的な実験室環境に慣れていました。すべての実験手順は、機関および国際的な動物倫理ガイドラインに厳密に従って実施されました。このプロトコルで使用される実験材料は 材料表に記載されています。

注:化学廃棄物および生物廃棄物は、機関の実験室安全および廃棄物管理ガイドラインに従って処分されました。酸、塩基、有機溶媒は別々のラベル付き容器に集められ、機関の有害廃棄物ユニットに届けられました。生物材料および汚染された消耗品はバイオハザード容器に収集され、滅菌され、最終処分のため適切な施設へ移送されました。

1. 実験設計

  1. 動物実験室から250 ± 20gの成体オスのウィスター・アルビノラットを入手してください。各ラットは24度±2°Cのケージに個別に飼い、12時間の明暗サイクルで、標準的なラットの食事と水道水を自由 に利用できます 。
  2. 動物をランダムに4つのグループに分けます(各グループに n = 6 個):グループ1:コントロール(C)、グループ2:TQ、グループ3:DTM、グループ4:DTM + TQ。
  3. DTM(純度98%)をトウモロコシ油に溶かし、胃内ガベージで1.28 mg/kgの用量を30日間投与します。
  4. TQを10 mg/kgの用量でコーンオイルに溶かし、胃内ガベージで30日間投与します。すべての薬剤溶液は毎日新鮮に準備し、合計1 mL/kgで投与してください。
  5. 複合治療群では、DTM直後にTQを投与します。対照群にはトウモロコシ油のみを投与し、ガベッジ関連ストレスを考慮します。
    注:DTM用量は、既存の文献に基づき、罹患率を生ませずに酸化ストレスを誘発するために選択されており、LD501の約1/1に相当します。

2. 体重の測定

  1. 研究の1日目、10日目、20日目、30日目に体重を測定します(図1)。

3. 行動パラメータ

  1. すべての行動テストは標準化された条件下で実施し、一貫性を確保しましょう。強制泳ぎテスト(FST)とオープンフィールドテスト(OFT)の両方を、オーバーヘッドカメラで試験装置の全体像を撮影します。照明は約100〜150ルクスに保ちます。動けなさとは、姿勢や呼吸を維持するために必要な最小限の動きを除き、能動的な動きがないことと定義します。嗅覚影響を防ぐため、動物間で70%エタノールを投与してすべての試験場を清掃してください。
  2. FST
    1. うつ病様行動を評価するために32日目にFSTを実施してください。5分間のテストセッションの24時間前に15分間の事前テストセッションを実施し、動物を水環境に慣らし、新奇性によるストレスを最小限に抑えましょう。事前テストセッション中に行動採点は行わないでください。
    2. ラットを個別に円筒形の容器(直径35cm、高さ50cm)に入れ、水を25 ± 1°Cで5分間保温した30cmの水を入れます。
    3. ビデオカメラを使って、水泳、登攀、動けない時間を記録しましょう。動画録画から行動パラメータを秒単位で定量化する10.
    4. 振る舞いを次のように定義します:
      動かない状態:動物が浮かんでいる状態を、積極的な動きをせずに頭を水面に保つために最小限の動きをしていると考えます。
      スイミング:スイミングとは、4本の足の協調した動きで円筒全体を水平に動かす活動を指します。
      クライミング:クライミングとは、動物が垂直の姿勢を保ちながら、前足をシリンダーの壁に強く上向きに動かすことを指します。
    5. 動物が完全に動かない場合は、あらかじめ定められた基準に従ってその行動を動けないと評価します。
    6. テスト中は外部からの刺激や軌道修正を行わないでください。安全上の理由(例:溺死のリスク)が必要な場合を除き、動物が自由に行動できるようにしてください。
  3. OFT
    1. 31日目にOFTを実施し、運動活動および不安様行動を評価する11.90 x 35 cmのアリーナで、黒い線で24の等しい単位に分割され、5分間個々の動きを記録します。
    2. グループ割り当てを盲目にした研究者によるビデオ記録から以下の行動パラメータを定量化します。
      4本の前足で渡る回数(運動活動)
      中心部や周辺部で過ごす時間(不安に似た行動)
    3. 動物が完全に動かない場合は、その行動を動かない状態として記録し、その期間は渡りをゼロに割り当てます。
    4. テスト中は外部からの刺激、位置調整、進路修正を行わないでください。
    5. 安全上の理由で介入が必要な場合を除き、動物が自由に行動できるようにしてください。
    6. 嗅覚の手がかりを取り除くために、動物間で70%エタノールを敷いてアリーナを清掃します。

4. 酸化ストレスマーカーの評価

  1. すべての処置は32日目に行ってください。ラットには筋内キシラジン(5 mg/kg)とケタミン(45 mg/kg)で深く麻酔します。ペダルの撤退反射がないことで深麻酔を確認しましょう。心臓穿刺で約3〜5mLの血液をEDTA被覆チューブに採取します。
  2. 深麻酔下での大量出血による安楽死を完全に行い、組織採取前に死亡を確認してください。遠心分離機で3,000 x g で4°Cで10〜15分間血液サンプルを採取します。 バフィーの被毛を乱さずに慎重に血漿を集め、アリクオートは−80°Cで保存してください。 氷の上で脳を素早く解剖する。生化学分析のために左大脳半球と海馬を分離し、液体窒素(−80°C)での急速凍結を行います。組織学的評価のために、右大脳半球を10%中性緩衝ホルマリンで固定します。
  3. プラズマ酸化ストレス解析
    1. 血漿脂質過酸化(TBARSアッセイ)
      1. 遠心分離機プラズマサンプル(3,000 x g、10分、4°C)。0.5 mLの血漿と1 mLのTCA–TBA–HCl試薬(15%トリクロロ酢酸(TCA)、0.375%チオバルビツル酸(TBA)、0.25N塩酸(HCl))を混ぜます。1,000 x g で10分間遠心分離し、上清液をガラス管に移します。人工的な酸化を防ぐため、0.02%ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)を50μL添加します。
      2. 100°Cで15分間加熱し、室温まで冷却、1,000 x g で遠心分離機で10分間、532 nmで上清液の吸収を測定します。ビール・ランバートの法則を用いてMDA濃度を計算する
        ε = 1.56 ×10 5 M⁻1 cm⁻1、l = 1 cmで、nmol/mLの血漿として表現されます。
    2. 血漿チオール(RSH)レベル
      1. 血漿0.5mLに、1%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)と2mMのエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)を含むトリスHClバッファー(100 mM、pH 8.2)を混合します。25°Cで5分間培養し、遠心分離機(3,000 x g、10分、4°C)で加熱します。分析には上澄液を使いましょう。
      2. 0.3 mM 5,5′-ジチオビス(2-ニトロベンゾイン酸)(DTNB)を加え、37°Cで15分間培養します。吸収率は412nm10で測定してください。RSH濃度はε = 13,600 M⁻1 cm⁻1を用いて計算し、 μmol/Lプラズマで表します。
    3. プラズマNOxレベル(グリース反応)
      1. 血漿を0.3 M水酸化ナトリウム(NaOH)と硫酸亜鉛(ZnSO₄)で脱タンパク質化します。20,000 x g で遠心分離機で5分間、上清液を採取します。
      2. 硝酸塩ストック溶液(100、10、1 mmol/L)を準備し、標準曲線(1–100 μmol/L)を生成します。マイクロプレートに100μLの上清液(重複ウェル)を充填します。
      3. 100μLのバナジウム(III)塩化物(VCl₃)を加え、その後50μLのスルファニルアミドと50μLのN-(1-ナフチル)エチレンジアミンを加えます。室温で30〜45分間培養し、540nmで吸収を測定します。標準曲線からNOx濃度を求出し、μmol/Lプラズマとして表します。
  4. 組織酸化ストレス解析
    1. すべての生化学的分析には、左大脳半球組織を約100mg使用してください。
    2. 組織脂質過酸化(TBARSアッセイ)
      1. 氷のように冷たい10%TCAで組織(1:10 w/v)を均質化します。0.67%TBAの同じ量を加え、100°Cで15分間加熱します。冷却および遠心分離機(3,000 x g、10分、4°C)10.535nmで上清液の吸収を測定してください。MDAはε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1 を用いて、 nmol/g 湿った組織で表します。
    3. 組織グルタチオン(GSH)レベル
      1. 組織を10% TCA(1:10 w/v)および遠心分離機(3,000 x g、10分、4 °C)で均質化します。上清液0.5mLとDTNB溶液2mL(1%クエン酸ナトリウムに0.4 mg/mL)を混ぜます10。すぐに412nmで吸収を測定してください。GSHはε = 13,600 M⁻1 cm⁻1 を用いて計算し、μmol/g 湿潤組織として表します。
    4. 組織のNOxレベル(グリース反応)
      1. リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)(1:5 w/v)および遠心分離機(2,000 x g、5分)で組織を均質化します。0.3 M NaOHと5% ZnSO₄で上清液を脱タンパクします。遠心分離機(3,000 x g、20分)で透明な上清液を採取します。
      2. 硝酸塩標準物質(1–100 μmol/L)を準備します。上清液100μLを重複ウェルに注入します。上記の通りVCl₃およびGriess試薬を加えます。37°Cで45分間インキュベートし、540nmで吸収を測定します。標準曲線から濃度を決定し、μmol/g組織として表します。
        注意:TCA、HCl、NaOH、有機溶剤などの有害化学物質を用いる手順は、認証済みの化学煙幕フード内で実施されました。実験室用コート、耐薬手袋、防護メガネ、必要に応じてフェイスシールドなどの適切な個人用防護具(PPE)がすべての実験で使用されました。すべての化学物質は、機関の安全ガイドラインおよび関連する材料安全データシート(MSDS)に従って取り扱われました。

5. ウェスタンブロット解析によるKeap-1およびNrf-2レベルの決定

  1. 海馬組織を50mgの塊に切り分け、500μLのRIPAバッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルを補足した均質化チューブに入れます。
  2. 適切な量の磁気ビーズを加え、1,000 x g で2サイクル均質化します。遠心分離機で14,000 x g で10分間、4°Cで加熱します。
  3. 上清液を洗浄したマイクロ遠心分離機チューブに移し、同じ条件で再度遠心分離機を行います。サンプルを氷に保管し、タンパク質濃度を測定してください。
  4. 製造元の指示に従い、Protein BRアッセイキットで蛍光計を使ってタンパク質濃度を測定してください。
  5. 電気泳動用に10%のSDS–PAGEゲルを準備します。タンパク質濃度を30 μg/μLに調整します。
  6. 3:1の比率で4個のラエムリバッファーを加え、10%βメルカプトエタノールを補給します。95°Cで5分間加熱し、その後短時間遠心分離機をかけます。
  7. 各レーンに5μLのタンパク質マーカーと30μgのタンパク質をロードします。ゲルは110Vで60〜90分間使用します。
  8. PVDF膜を100%メタノールで3〜5分間活性化し、その後室温で1×移送バッファーで10分間平衡させてから移送します。
  9. フィルターペーパーとスポンジを移送バッファーで濡らし、気泡を完全に除去するために慎重に組み立ててください。100Vの湿式トランスファーシステムを用いて、4°C(一定電圧)で90分間タンパク質輸送を行います。
  10. 膜を3%牛血清アルブミン(BSA)で、室温で軌道シェーカーで1時間ブロックします。膜を4°Cで一晩、3%BSAで希釈した一次抗体(Keap-1およびNrf-2、1:3,000 β、-アクチン1:1,000)で培養します。
  11. 3×緩衝食塩水1個と0.1%のTween 20洗剤(TBS-T)で5分間、膜を5回洗います。室温の暗闇で1時間、二次抗体(1:15,000)を併用してインキュベートします。
  12. 説明通りに洗浄し、製造元の指示に従い強化化学発光(ECL)基質(例:ルミノール系HRP基質)でインキュベーションします(使用直前に試薬AとBを同量混合)。膜表面を完全に覆う十分な基質(1膜あたり約1 mL)を塗布し、室温で1〜2分間培養します。
  13. 化学発光信号を検出するために、化学発光検出用のデジタルイメージングシステムを用いて検出します(特定の励起波長は不要で、光はHRP–ルミノール反応によるものとなります)。非彩度帯を確保しながら自動露出設定で画像を取得します。同じブロット内のすべてのサンプルで同一の露光パラメータを維持してください。
  14. 同一のROI選択、背景減算、正規化パラメータのもとで画像解析ソフトウェアを用いてデンシトメトリック解析を行います。Keap-1およびNrf-2バンドの強度を対応するハウスキーピングタンパク質βアクチンに正規化します。正規化された値を統計分析用の.csvファイルとしてエクスポートしてください。

6. 組織病理学的解析

  1. 右大脳半球を10%中性ホルマリンで72時間固定します。段階化されたエタノール系列(70%–100%)で脱水し、パラフィンに埋め込み、5μmで切断します。
    Paxinos と Watsonの著『The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates』(Academic Press)で定義された立体走位座標に基づき、海馬および内嗅皮質レベルで冠状脳断片を取得します。対話型ラット脳アトラスビューアー(https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas を使用して解剖学的局在を検証・精緻化します11。
  2. 標準的な組織学的手法を用いて、パラフィン埋め込み脳組織から4回連続の冠状切片(厚さ5μm)を準備します。従来のプロトコルに従い、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で切片を染色します。すべてのスライドを200×倍率で光学顕微鏡で調べます。組織学的評価は盲検研究者によって行われ、観察者のバイアスを最小限に抑えること13.
    注:この手術により、グループ間の解剖学的比較が一貫していました。
  3. 神経細胞の喪失、細胞浮腫、核ピクノーシス、炎症浸潤、血管充血を各セクション10のランダムフィールドで半量的に評価します。
  4. 各グループごとのパラメータごとの平均スコアを計算します。スコアリング基準は以下の通りです:0(なし、<5%)、1(軽度<33%)、2(中等度、33–66%)、3(重度、>66%; 表1)。

7. 海馬および内嗅皮質におけるNrf-2およびKeap-1反応性の免疫組織化学的解析

  1. 海馬と内嗅皮質から厚さ5μmの断片を準備し、ガラススライドにマウントします。
  2. 切断部分を脱硫・再水和させた後、室温のリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)で洗浄します。
  3. 3%過酸化水素で切片を5分間培養し、内因性過酸化酵素活性を阻害します。PBSによるウォッシュセクション
  4. 抗原回収を行い、スライドをクエン酸ナトリウムバッファー(pH 6.0)で10〜15分間加熱します。スライドを30分冷ましてからPBSで洗います。
  5. 3%過酸化水素で切片を15分間培養し、完全な過酸化酵素阻害を確保します。PBSで区画を洗いましょう。
  6. 非特異的な結合を減らすためにブロッキング溶液を10分間塗布します。切片を4°Cで一晩、Nrf-2(1:100希釈)およびKeap-1(1:200希釈)に対する一次抗体とともに培養します。孵化後はPBSで切面を洗いましょう。
  7. 適切な二次抗体で切片を室温で30分間インキュベートします。PBSで区画を洗いましょう。
  8. ストレプタビジン・ペルオキシダーゼを切片に塗布し、室温で加湿チャンバーで20分間培養します(湿らせた濾紙を入った密閉された培養箱で相対湿度を95〜100%に保ちます)。孵化後はPBSで切面を洗ってください。
  9. DABクロモゲンを塗布し、100×倍率で光学顕微鏡で色の発生を観察します。反応を止めるために、水道水でスライドを洗い流してください。
  10. 室温で5分間、ヘマトキシリンを1:9で希釈した部分をカウンターステインします。PBSと蒸留水でしっかりすすいでください。セクションは永久的な取り付け媒体を使って取り付けます。
  11. 染色された部分を光学顕微鏡で調べてください。各断面16の代表フィールドから×400倍率の顕微鏡写真を撮影します。
  12. 画像解析ソフトウェアを用いてNrf-2およびKeap-1の免疫反応性を定量化します。定量化されたデータを記録・分析し、さらなる統計評価に用いてください。
  13. 免疫組織化学分析の場合は、ImageJで画像を開き、Set Scaleツールでキャリブレーションしてください。すべての画像を8ビットグレースケールに変換して強度測定を標準化します。正に染色された領域と隣接する背景領域の関心領域(ROI)を手動で定義し、ROIマネージャーに保存してください。
  14. 一貫したH-DABカラーデコンボリューションを用いて染色強度を定量化し、すべてのサンプルで同一の閾値パラメータを適用します。平均グレー値、光学密度、正の面積の割合を測定します。
  15. セルベース解析では、Watershedツールで閾値画像をセグメント化し、Analyze Particlesを使って正セルを定量化します。すべてのデータは統計解析のために.csvファイルとしてエクスポートされました。

8. 統計分析

  1. SPSSバージョン29.0を用いて統計解析を行う。生データをデータビュータブに入力し、各行は個々の動物を表し、変数ビュータブで定義します。実験群はカテゴリ変数(Control、TQ、DTM、DTM+TQ)として符号化されました。
  2. Shapiro–Wilk検定を用いてデータの正規性を評価するには、「 Analyze > Descriptive Statistics > Explore」を選択し、結果変数を従属リストに、グループを因子リストに割り当て、検定を用いた正規性プロットを有効にします。正規分布変数については、 Analyze > Compare Means > OneWay ANOVAによる一方向分散分析(ANOVA)を用いてグループ比較を行い、オプションで記述統計と分散の均一性のLevene検定を有効にします。
  3. 有意な主効果が検出された場合、TukeyのPost-Hoc検定をPost-Hocメニューから適用し、ペアワイズグループの違いを特定します。Levene検定の結果を使って分散均質性(p > 0.05)を確認してください。
  4. パラメトリック仮定を満たさなかった組織病理学的スコアリングデータについては、「 Analyze > Nonparametric Tests > Legacy Dialogs > K Independent Samples」を選択し、その後Independent Samples nonparatricテストモジュールを用いてBonferroni補正付きのダンの事後検定を行い、Kruskal–Wallis検定を用いたノンパラメトリック解析を行います。
  5. 統計出力および要約表を.xlsまたは.csvファイルとしてエクスポートし、結果は平均±標準偏差(SD)として表現され、p値<0.05は統計的に有意とされました。

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結果

体重測定
体重は1日目、10日目、20日目、30日目に記録されました。C群およびTQ群のラットは、実験期間中に体重が徐々に増加し、30日目時点で両群間で有意な差はありませんでした。対照的に、DTMに曝露されたラットは対照群と比較して体重の有意な減少を示しました。TQの併用投与はDTM関連体重減少を軽減しました。研究期間中は死亡は観察されませんでした (図1)。

行動評価
運動活動
運動活動は、野外試験における格子交差の数によって評価されました。CグループとTQグループは同等の運動活動を示した。DTM曝露は交差回数を有意に減少させた一方で、TQ併用はDTM群と比較して運動活動を部分的に増加させました (図2)。

OFT
探索行動は、アリ...

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ディスカッション

本研究は、亜慢性の口腔DTM曝露がラットにおいて一貫した行動的、生化学的、分子的、組織病理学的変化を引き起こし、TQを併用することでこれらの影響を効果的に軽減することを示しています。標準化された行動検査と酸化ストレスプロファイリング、Keap-1/Nrf-2シグナル伝達の経路レベル解析、組織病理学的評価を統合することで、農薬誘発性の神経毒性および抗酸化剤ベースの神経保護を評価するための堅牢かつ再現性の高い枠組みを提供します。

選択されたDTM用量(1.28 mg/kg/日、経口ガベジ、30日間)は確立された亜慢性曝露モデルに基づいており、死亡率や急性全身毒性を誘発することなく測定可能な神経行動的および生化学的効果を生じさせました14。同様の投与方法と曝露経路を用いた先行研究と一致し、DTM処理ラットは体重減少、運動活動の減少、FSTの不動性の増加、中心探索の減少を示しました。OFTは

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開示事項

著者には利益相反や競合する金銭的利益はありません。

謝辞

この研究は外部からの資金援助を受けていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5,5'-ジチオビス(2-ニトロベンゾウ酸)サーモ・サイエンティフィック  69-78-3 
ベンチトップ遠心分離機 NF048Nüve43560
Beta_Actin サーモフィッシャー・サイエンティフィック、アメリカ合衆国7D2C10
BSAソリューションとnbsp;プロテインテック、アメリカ合衆国)66201-1-Ig
ブチル化ヒドロキシトルエンシグマ・オルドリッチ128-37-0
Dijital Homojenizatör 大韓サイエンティフィックhttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM  バイエル TR01426058O
ヘマトキシリン–eosin バイオオプティカW01030708
塩酸メルク7647-01-0
Image J ソフトウェアプログラム NIH;ワシントン、アメリカ合衆国https://imagej.net/ij/
免疫組織化学染色キット Lab VisionTM UltraVisionTM 大型体積検出システム:アンチポリバレントHRP、TA-125-HL
ライカ オートカット 14051956472ドイツhttps://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
クロトム/histocore-autocut/
光学顕微鏡 ニコン、エクリプスなど;Ni-U、940728
N-(1-ナフチル)エチレンジアミンサーモ・サイエンティフィック 1465-25-4
ナノマイクロプレートリーダーBMGラボテックスペクトロスター・ナノ
リン酸緩衝塩水 メルクP4417
一次抗体 Keap-1 プロテインテックカタログ番号10503-2-AP、1:200
一次抗体 Nrf-2およびnbsp;プロテインテックカタログ番号16396-1-AP、1/100
Qubit Protein BRアッセイキット サーモフィッシャー・サイエンティフィック・インヴィトロジェンQ33211
クエン酸ナトリウムメルク03-04-6132
ドデシル硫酸ナトリウムサーモ・サイエンティフィック 151-21-3
水酸化ナトリウムメルク1310-73-2
硝酸ナトリウムメルク7631-99-4
ストレプタビジンペルオキシダーゼ サーモ・サイエンティフィック SHRP248-B
スルファニルアミドサーモ・サイエンティフィック  63-74-1 
チオバルビツル酸およびnbsp;メルク504-17-6
TQ ケイマン 490-91-5
トリカルバリル酸、99%サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ 139360500
トリクロロ酢酸サーモ・サイエンティフィック・ケミカルズ76-03-9
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塩化物バナジウム(III)シグマ・オルドリッチ7718-98-1
West Pico PLUSケミルミネッセンス基板とiBright 750 サーモフィッシャー・サイエンティフィックシステムhttps://www.clinxsci.com/product
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硫酸亜鉛溶液メルク7733-02-0

参考文献

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