セロトニン応答性のssDNA-SWCNTナノセンサーの機械学習支援ラマンスペクトル解析によるドーパミンに対する選択性の向上

Summary

このプロトコルは、ssDNAラップされたSWCNTナノセンサーのラマンスペクトル解析を説明し、機械学習モデルの支援を用いてドーパミンに対するセロトニンの選択的測定を改善します。

Abstract

セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)は神経調節に重要な役割を果たしますが、現在の検出方法では5-HTを高感度かつ選択的にリアルタイムで検出するのに苦労しています。以前、近赤外線セロトニンナノセンサー(nIRHT)を開発しました。これはSSDでラップされた単層カーボンナノチューブで構成され、5-HTを感度度よく検出します。しかし、nIRHTの蛍光応答は5HTとドーパミン(DA)を区別できず、実用的な応用は限られています。本研究では、ラマン分光法と機械学習を組み合わせて、この選択性の課題を克服しました。Gバンドスペクトルの特徴は、5HTとDAがnIRHTに結合する際に異なるシグネチャーを示し、DAはGバンドの抑制を強めました。分析対象特異的スペクトル変化を分離するために微分ラマン(ΔRaman)を用い、分類のために3つの機械学習モデルを訓練しました。ΔRamanを用いたランダムフォレストモデルは95.8%の精度で最適性能を達成し、生のラマンスペクトルを用いたモデルを大きく上回りました。このアプローチは特異性が向上し、アセチルコリン、GABA、グルタミン酸に対する反応がほとんどなく、生理学的応用に適した検出限界0.1μMを達成しました。このラマンベースのアプローチは、非選択的なnIRHT蛍光センサーを堅牢な神経伝達物質識別可能なプラットフォームへと変換し、単層炭素ナノチューブ(SWCNT)ベースの分子センシングにおける選択性の問題を克服します。

Introduction

セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)は気分、認知、睡眠、食欲を調節する重要な神経伝達物質であり、うつ病、不安障害、その他の神経精神疾患に関与する機能障害が関与^{しています。}シナプス伝達の時間スケールがミリ秒単位で、^{神経組織の}複雑な化学環境のために、生物学的システムにおけるセロトニン動態のリアルタイムモニタリングは依然として困難です。神経伝達物質検出技術の大きな進歩にもかかわらず、セロトニンの高い感度と分子選択性の両方を達成することは依然として大きな解析上の課題を提唱しています。

現在のセロトニン検出方法は、従来の分析技術から新興のナノセンサープラットフォームまで多岐にわたります。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC-ED)は依然としてゴールドスタンダードであり、検出限界0.056 nMと優れた再現性を達成^{しています。}しかし、HPLCは広範な試料準備と15〜30分の分析時間を必要とし、^{リアルタイムモニタリングは}できません。高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)は炭素繊維微電極でサブ秒単位の時間分解能を可能にしますが、電極の汚れや構造的に類似した神経伝達物質間の選択性の制限を抱えます^5,6。iSeroSnFR⁷やGRAB-5HT⁸などの遺伝子コード蛍光センサーの最近の開発は、驚くべき感度とダイナミックレンジを実現していますが、標的組織の遺伝子改変を必要とし、臨床翻訳を制限しています。

単層カーボンナノチューブ(SWCNT)光学センサーは、ラベルフリー神経伝達^{物質検出の}有望なプラットフォームとして登場しています。DNA官能化されたSWCNTは分析物結合時に近赤外線(nIR)蛍光変調を示し、組織透明ウィンドウ(900-1400 nm)での検出を可能にします^10,11。ランドリーのグループは、リガンドの指数関数的増殖(SELEC)による系統的進化を通じてnIRHTセンサーを開発し、約^10~10の固有のssDNA配列をスクリーニングしてセロトニン応答性構造体を特定しました^。このセンサーは、セロトニン結合時に200%の蛍光増強を伴う微小モル感度を達成し、ドーパミンやセロトニンの酸化に依存しずに動作します。酸化的干渉を除外するため、以前の研究ではこれらの神経伝達物質溶液の安定性が確認されました。UV-VisおよびNMR解析では、純粋な5HT¹²と比較して酸化変化や新たなピーク形成は認められませんでした。さらに、このシステムで使用されている短い培養時間と中性pH条件は、顕著なキノン生成を防ぐよう設計されています。同様に、Stranoグループはコロナ位相分子認識(CoPhMoRe)を先駆け、(GT)₁₅ラップされたSWCNTが11 nM濃度のドーパミンを検出できることを示しました¹³。私たちのグループは最近、機械学習誘導による最適化を通じてこの分野を進展させ、体系的に変異した配列の高スループットスクリーニングを用いて感度を2.5倍向上させ^ました。

これらの進歩にもかかわらず、セロトニンとドーパミンの選択性が不十分であるという根本的な制約が依然として存在します。両方の神経伝達物質は芳香族環とエチルアミン鎖を含み、ヒドロキシル基¹⁵の差は1つだけです。現在の蛍光ベースのSWCNTセンサーは通常5:1未満の選択比を達成しており、シナプス環境における共放出神経伝達物質の識別には不十分^です。この選択性の課題は、セロトニンとドーパミンが報酬や動機付けを司る脳領域で共局することが多いことを考えると、特に重要です¹⁷。

ラマン分光法は、SWCNT分析物¹⁸の振動モード解析を通じて補完的な化学情報を提供します。SWCNTのGバンド(~1580 cm^⁻1)はG⁺とG⁻成分に分かれ、分子吸着や電子ドーピングに感度の高い周波数を持つ¹⁹。以前の研究では、SWCNT上の非共有結合界面活性剤がGバンド領域²⁰で明確なラマンスペクトル変化を引き起こすことが示されました。

本研究では、nIRHTセンサーの機械学習支援ラマンスペクトル解析を行い、セロトニンとドーパミン間の選択性向上を実現しています。0.01から100μMまでの濃度依存性ラマン応答を体系的に特徴付け、各神経伝達物質ごとに異なるスペクトル指紋を明らかにしました。畳み込みニューラルネットワーク(CNN)、サポートベクターマシン(SVM)、ランダムフォレスト(RF)という3つの機械学習モデルがスペクトルデータセット上で学習され、分析物の同一性を分類しました。特に重要なのは、基準信号を除去して分析物特異的特徴を分離する差分ラマン処理を導入することです。DR処理による最適化されたRFモデルは95.8%の分類精度を達成し、分子識別における大きな進歩を示しています。この多様態アプローチは、nIR蛍光感度とラマン化学特異性を組み合わせることで、複雑な生物学的環境におけるリアルタイム選択的セロトニンモニタリングへの道筋を提供します。

Protocol

1. ssDNA機能化SWCNT nIRHTナノセンサーの製造

1. 1.5mLのチューブに1mgの単壁炭素ナノチューブ(SWCNT)、100μLの1mM E6#9 ssDNA、900μLの1xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を組み合わせます。
   注意:乾燥したSWCNT粉末は吸入の危険性があります。粉末は認定された化学換気フード内で取り扱い、マスクや手袋などの適切な個人用防護具を着用してください。
2. バスソニックケーターで5分間混合液を分散します。3mmプローブを搭載したチップソニックメーターで、50%振幅で氷浴で30分間ソニック処理を行います。
3. 超音波処理溶液を21,500 x g で1時間遠心分離し、非分散した単面CNTを沈殿させます。850μLの上清液を慎重に採取し、新しいチューブに移します。
4. 収集したSWCNT懸濁液の吸収を波長632 nmで測定します。SWCNT消光係数0.036(mg/L)⁻¹ cm⁻¹を用いて濃度を計算します。最終的なnIRHTセンサー溶液は4°Cで保存し、再度使用してください。

2. ラマンスペクトル測定

1. 10 mg/L nIRHT分散液の90 μLを96ウェルプレートに充填します。532 nmのレーザー励起源を用いてPBSバッファ内でセンサーのラマンスペクトルを測定します。この記録されたスペクトルを基準に設定してください。
   注意:生体サンプルを調査する際は、レーザー出力を10 mW、波長532nmに厳密に保つことが重要です。より高いレーザー出力は重度の光毒性を引き起こし、細胞の生存能力を損なう可能性があります。本プロトコルで使用された532 nm、10 mWのレーザーは、生細胞解析において安全かつ非破壊性が確立されており、感受性の小器官²¹ と一次ニューロン²² の電気生理活性を保存しつつ、堅牢なラマン信号取得を確保しています。
2. 90μLセンサー溶液(10mg/L)に分析物溶液10μLをスパイクし、最終濃度0.01、0.1、1、5、10、50、100μMにします。分析物添加後5分待って十分な培養を行います。
3. 培養サンプルのラマンスペクトルを測定してください。各濃度ごとに三重のサンプルを準備し、再現性を確保するためにステップ2.1から2.2を繰り返します。

3. 機械学習に基づくデータ分析

1. データセットは合計208のラマンスペクトルから構成し、そのうち77はドーパミン(DA)応答、76はセロトニン(5HT)応答、47は対照群(PBS)反応です。
2. スペクトルデータのGバンド領域に背景引き算を行います。背景を減算したデータをG+バンドピークに基づいて正規化します。
3. 正規化されたスペクトルのノイズを減らすために中央値フィルターを適用します。各分析物処理スペクトルから正規化された制御スペクトルを差し引くことでスペクトル変化を分離します(ΔRaman)。
4. 5HT、DA、または対照群の三項分類のための畳み込みニューラルネットワーク(CNN)、ランダムフォレスト(RF)、サポートベクターマシン(SVM)モデルを開発します。
5. データセット全体を6:2:2の比率でトレーニング、検証、テストセットに分割します。
6. CNNアーキテクチャを、ReLUの活性化関数と最大プーリングサイズ2を用いて3つの1次元畳み込み層、さらに2つの完全接続層で構成される構成を行います。
7. 非線形分類のために放射基底関数(RBF)カーネルを用いてSVMを構成します。
8. デフォルトのハイパーパラメータを使ってRFモデルを構成します。
9. 構築されたモデルは5重クロス検証を用いて訓練します。統計的な堅牢性を確保するために、5つのフォールドすべての平均パフォーマンス指標を計算してください。
10. 最終解析のために、検証データで最も正確率が高いモデルを選択してください。
11. テストセット上で選択されたモデルを評価し、その一般化能力を検証します。
12. 0.1μMの濃度閾値未満のデータを訓練セットから逐次除外することで間接検出限界(LOD)を決定します。
13. 基準以下の濃度を含む全濃度範囲で訓練済みモデルをテストし、最終的なLODを決定します。

Results

SELEC法で開発されたE6#9 ssDNA機能化SWCNTナノセンサー(nIRHT)は、5HT結合時に可逆的なnIR蛍光増強を示し、in vitroおよびex vivoでのリアルタイム5HTイメージング^{を可能にします。}E6#9配列(5'-CCCCACCACCACACAGACACACCCCCCCCC-3')はSWCNTを巻き込み、5HTの結合部位を作ります。しかし、このセンサーは特異性に欠けており、5-HTとDAは強度の増加がほぼ同じ(図1B)ため、DAと5-HTの識別に限定的です。

この制約を克服するために、私たちはラマン分光法を用いて神経化学物質とnIRHTナノセンサー間の分子レベルの相互作用を調査しました。nIRHTナノセンサー溶液のラマン解析では、Gバンド領域(~1580 ^cm-1)に明確なスペクトル特性が見られました。これはSWCNTのグラフ...

Discussion

ラマン分光分析により、従来の蛍光応答では達成できなかったnIRHTセンサーの特異性が大幅に向上しました。DAは5HTと比較してG⁻バンド(1570cm-1)の抑制をより顕著に誘導することが観察されました。これらの差異的なシグネチャーは、SWCNT表面の分子配向や結合形状の違いに起因すると考えられます。具体的には、DAのカテコール部分はSWCNT表面とより強いπ π相互作用を形成し、より大きな電子摂動を引き起こし、G⁻抑制の強化として現れると考えられます。対照的に、5HTのインドール環系は電子結合が弱く、内在的なラマン署名をより多く保持しているように見えます。この差異的な相互作用は、構造的に類似した2つの神経伝達物質を識別するための明確な分光学的基盤を提供します。

ナノセンサーの連続監視の実用性を評価するため、APTESコーティングされたガラス基板に固定されたナノセンサーを用いたウォッシュアウト実験を実施しました。ラマンスペクトルは5-HTとDAを加えた際に明確なピーク変化を示し、その後の洗浄工...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	ナノインテグリス
iDus1.7 InGaAs	アンドール	DU490A-1,9
ラマンタッチ	ナノフォトン
ビブラセル130	ソニックス