セロトニン応答性のssDNA-SWCNTナノセンサーの機械学習支援ラマンスペクトル解析によるドーパミンに対する選択性の向上

Summary

このプロトコルは、ssDNAラップされたSWCNTナノセンサーのラマンスペクトル解析を説明し、機械学習モデルの支援を用いてドーパミンに対するセロトニンの選択的測定を改善します。

Abstract

セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)は神経調節に重要な役割を果たしますが、現在の検出方法では5-HTを高感度かつ選択的にリアルタイムで検出するのに苦労しています。以前、近赤外線セロトニンナノセンサー(nIRHT)を開発しました。これはSSDでラップされた単層カーボンナノチューブで構成され、5-HTを感度度よく検出します。しかし、nIRHTの蛍光応答は5HTとドーパミン(DA)を区別できず、実用的な応用は限られています。本研究では、ラマン分光法と機械学習を組み合わせて、この選択性の課題を克服しました。Gバンドスペクトルの特徴は、5HTとDAがnIRHTに結合する際に異なるシグネチャーを示し、DAはGバンドの抑制を強めました。分析対象特異的スペクトル変化を分離するために微分ラマン(ΔRaman)を用い、分類のために3つの機械学習モデルを訓練しました。ΔRamanを用いたランダムフォレストモデルは95.8%の精度で最適性能を達成し、生のラマンスペクトルを用いたモデルを大きく上回りました。このアプローチは特異性が向上し、アセチルコリン、GABA、グルタミン酸に対する反応がほとんどなく、生理学的応用に適した検出限界0.1μMを達成しました。このラマンベースのアプローチは、非選択的なnIRHT蛍光センサーを堅牢な神経伝達物質識別可能なプラットフォームへと変換し、単層炭素ナノチューブ(SWCNT)ベースの分子センシングにおける選択性の問題を克服します。

Introduction

セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT)は気分、認知、睡眠、食欲を調節する重要な神経伝達物質であり、うつ病、不安障害、その他の神経精神疾患に関与する機能障害が関与^{しています。}シナプス伝達の時間スケールがミリ秒単位で、^{神経組織の}複雑な化学環境のために、生物学的システムにおけるセロトニン動態のリアルタイムモニタリングは依然として困難です。神経伝達物質検出技術の大きな進歩にもかかわらず、セロトニンの高い感度と分子選択性の両方を達成することは依然として大きな解析上の課題を提唱しています。

現在のセロトニン検出方法は、従来の分析技術から新興のナノセンサープラットフォームまで多岐にわたります。高性能液体クロマトグラフィー(HPLC-ED)は依然としてゴールドスタンダードであり、検出限界0.056 nMと優れた再現性を達成^{しています。}しかし、HPLCは広範な試料準備と15〜30分の分析時間を必要とし、^{リアルタイムモニタリングは}できません。高速スキャンサイクリックボルタンメトリー(FSCV)は炭素繊維微電極でサブ秒単位の時間分解能を可能にしますが、電極の汚れや構造的に類似した神経伝達物質間の選択性の制限を抱えます

Protocol

1. ssDNA機能化SWCNT nIRHTナノセンサーの製造

1. 1.5mLのチューブに1mgの単壁炭素ナノチューブ(SWCNT)、100μLの1mM E6#9 ssDNA、900μLの1xリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を組み合わせます。
   注意:乾燥したSWCNT粉末は吸入の危険性があります。粉末は認定された化学換気フード内で取り扱い、マスクや手袋などの適切な個人用防護具を着用してください。
2. バスソニックケーターで5分間混合液を分散します。3mmプローブを搭載したチップソニックメーターで、50%振幅で氷浴で30分間ソニック処理を行います。
3. 超音波処理溶液を21,500 x g で1時間遠心分離し、非分散した単面CNTを沈殿させます。850μLの上清液を慎重に採取し、新しいチューブに移します。
4. 収集したSWCNT懸濁液の吸収を波長632 nmで測定します。SWCNT消光係数0.036(mg/L)⁻¹ cm⁻¹を用いて濃度を計算します。最終的なnIRHTセンサー溶液は4°Cで保存し、再度使用してください。

2. ラマンスペクトル測定

Results

SELEC法で開発されたE6#9 ssDNA機能化SWCNTナノセンサー(nIRHT)は、5HT結合時に可逆的なnIR蛍光増強を示し、in vitroおよびex vivoでのリアルタイム5HTイメージング^{を可能にします。}E6#9配列(5'-CCCCACCACCACACAGACACACCCCCCCCC-3')はSWCNTを巻き込み、5HTの結合部位を作ります。しかし、このセンサーは特異性に欠けており、5-HTとDAは強度の増加がほぼ同じ(図1B)ため、DAと5-HTの識別に限定的です。

この制約を克服するために、私たちはラマン分光法を用いて神経化学物質とnIRHTナノセンサー間の分子レベルの相互作用を調査しました。nIRHTナノセンサー溶液のラマン解析では、Gバンド領域(~1580 ^cm-1)に明確なスペクトル特性が見られました。これはSWCNTのグラフ.......

Discussion

ラマン分光分析により、従来の蛍光応答では達成できなかったnIRHTセンサーの特異性が大幅に向上しました。DAは5HTと比較してG⁻バンド(1570cm-1)の抑制をより顕著に誘導することが観察されました。これらの差異的なシグネチャーは、SWCNT表面の分子配向や結合形状の違いに起因すると考えられます。具体的には、DAのカテコール部分はSWCNT表面とより強いπ π相互作用を形成し、より大きな電子摂動を引き起こし、G⁻抑制の強化として現れると考えられます。対照的に、5HTのインドール環系は電子結合が弱く、内在的なラマン署名をより多く保持しているように見えます。この差異的な相互作用は、構造的に類似した2つの神経伝達物質を識別するための明確な分光学的基盤を提供します。

ナノセンサーの連続監視の実用性を評価するため、APTESコーティングされたガラス基板に固定されたナノセンサーを用いたウォッシュアウト実験を実施しました。ラマンスペクトルは5-HTとDAを加えた際に明確なピーク変化を示し、その後の洗浄工.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	ナノインテグリス
iDus1.7 InGaAs	アンドール	DU490A-1,9
ラマンタッチ	ナノフォトン
ビブラセル130	ソニックス