高濃度溶液で良好な特性を持つ抗体の同定のための自動超希釈測定

サマリー

ここでは、抗体コロイド安定性アッセイを大規模に高スループット適応し、大規模データセットを生成し、AI/ML対応の開発可能性予測をサポートする方法を説明します。

要約

抗体工学における主要な課題の一つは、コロイド安定性を評価する分析スクリーニング手法の開発であり、バイオ製剤が高濃度製剤および投与に適していることを保証します。電荷安定化自己相互作用ナノ粒子分光法(CS-SINS)は、従来の親和捕獲自己相互作用ナノ粒子分光法(AC-SINS)の改良版であり、高濃度溶液挙動を予測するための堅牢なコロイド安定性評価法として応用されています。この方法は、コロイド安定性の問題を重要なリソース投入前に特定することで、重要な初期段階の開発可能性判断を可能にし、下流の離脱率を大幅に減らし、候補選定のタイムラインを加速させます。本研究は、アッセイが既存の発見ワークフローにシームレスに統合され、サンプル要件が最小限であるため、典型的な初期段階のアッセイと並行して実施できることを示し、他の特性評価を損なうことなく高濃度の挙動を予測するための貴重なデータを提供します。通常の動的光散乱(DLS)測定とプラズモン共鳴波長のシフトが、ここで述べたHTP法の信頼性を向上させることが示されています。総合的に見て、DLS測定と自動解析プログラムを用いた相互検証が、さまざまなモダリティの候補抗体治療薬の信頼できる選択を促進することが期待されています。

概要

治療用抗体の開発と製剤において、オパル性と粘度は患者中心の商業製品開発において重要な考慮事項です。1,2,3,4,5,6,7,8。古典的には、これらの特性を高濃度で直接観察するには大量のタンパク質が必要であり、抗体発見の初期段階ではタンパク質の利用可能性が限られているため、最適なリード同定が効果的に妨げられます。これらの現象の信頼できる同定は、^{下流1,2,3,4,5,6,7,8}における高濃度溶液の挙動を緩和するために開発可能性評価に不可欠です。そのため、高濃度^{9,10,11,12,13,14,15,16}での溶液挙動不良を予測できる高スループット・低濃度法に大きな関心が寄せられています。その一例であるkD-DLSは高濃度特性の予測に信頼性が高いことが示されていますが、初期段階のワークフローにおける低タンパク質消費と高スループットの要件を満たしていません(^12,13)。

最近では、超低消費の金ナノ粒子を用いたアッセイであるCS-SINSがkD-DLS実験の結果と強い相関関係を示し、高濃度¹⁶での溶液特性の悪さを予測するのにかなり効果的であることが示されています。これらの特性により、CS-SINSは高スループットスクリーニングツールとしての開発に理想的な候補となっています。CS-SINアッセイは、金ナノ粒子表面に固定されたキャプチャ抗体を用いて、候補抗体をFc領域を通じて固定し、Fabアームを溶液相互作用に利用できるようにします。この構成により、Fab-Fab相互作用が測定される自己結合シグナルが支配的であり、研究によればFabドメインが主にmAb自己結合特性に寄与することが示されており、これは相補性決定領域(CDR)表面特性17,18,19,20,21,22,23によると考えられています.この機構的基盤により、CS-SINは高濃度製剤に関連するコロイド安定性リスクの予測に適しています。代替的なHTP法には、スタンドアップ単層吸着クロマトグラフィー(SMAC)、一般的な定常相との自己結合を模倣するサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)カラムベースアプローチ、および交差相互作用クロマトグラフィー(CIC)が含まれ、これらはカラム準備と大量のサンプル要件^{17、24、25、26、27}を必要とします。

ここで説明する方法は、CS-SINアッセイのプレート検証済みセットアップを詳細に説明し、既存手法の利点を組み合わせつつ結果の信頼性を高めることで、ラボでの自動化と分析によるHTPスクリーニングを可能にします。また、この研究は、アッセイにおける自己相互作用の濃縮の性質により、さまざまなサンプルタイプが高品質な結果を生み出すことを示し、この手法がタンパク質源に依存しないことを確立しています。さらに、コロイド特性をプロジェクトチームに早期に伝えることで、戦略的多特異的^抗体薬剤設計をさらに支援できる方法も^{検討します。}

高濃度溶液の特性の研究は、リード選択と工学的完了後の多特異的候補選択キャンペーンの下流で通常行われます(図1A)。これらの特性の早期予測は、CS-SINのような数マイクログラムのサンプルを必要とする手法により実現可能となり、超希釈測定でコロイド安定性リスクを予測できます¹⁶。候補者プールが大きい場合に早期開発可能性スクリーニング(図1A)を導入し、単一特異的および多特異的フォーマットの並行データ生成キャンペーンを行うことで、創^{薬プロセスにより}良く情報が提供される^{可能性があります。}HTP CS-SINは結合や機能決定と並行して既存の分子スクリーニングパラダイムに適合し、既存のワークフローを妨げたり遅らせたりすることなく情報パッケージを補完します。有利なコロイド特性に重点を置いたリード候補選択は、図1Bに示される選択進行に影響を与えます。

提案されている早期開発可能性スクリーニングのワークフローでは、リード識別が製造や患者アクセスを含む有利な薬剤特性の全体像を考慮し、下^{流の開発を}効率化します。生物製剤の高濃度特性によって投与経路が決まります。例えば、入院要する静脈注射や、患者自身が自宅で投与できる皮下注射などで、しばしば高濃度の製品が必要です^35,36。自己結合率が低い開発可能なmAbは、しばしば>100 mg/mL ^5,35で製剤されます。粘度還元剤などの賦形剤を用いた製剤最適化により、CMC現像段階で溶液特性が悪い望ましい候補物のコロイド安定性リスクを克服できます^34,35。しかし、これによりバイオ医薬品製造の下流段階での課題が生じ、医薬品承認の成功までの期間が延びます³⁶。塩やアミノ酸など粘度を低くすることが知られている発現物質もタンパク質の安定性に影響を与え、これまでに特徴づけられた発現性プロファイルを変化させ、プロセスをさらに複雑にします^36,37。さらに、過剰な賦形剤は免疫原性の懸念や様々な安全性上の懸念、治療遵守に影響を与える患者数を制限し、^{生産分野に}新たな課題をもたらすこと^{もあります。}StarrらはCS-SIN法を初めて発表し、PLLとIgGの最適質量比を0.03と記述し、ヒスチジン製剤におけるmAb自己結合のゼータ電位測定によるナノ粒子安定化を確認し^ました。特に、PLLを過剰に添加するとアッセイの過安定化が生じ、mAbの自己相互作用の観察が妨げられます(PLLによる金ナノ粒子の安定性向上は補足図1に示されています)。塩を含まないヒスチジン製剤を使用することで、静電スクリーニングを最小限に抑え(デバイ長を延長)、分子間相互作用の範囲を拡大し、弱い自己結合シグナルを増幅し、抗体が近接する高濃度の挙動を模倣します。一般的に、自己結合が観察されない高濃度製剤には低イオン強度の製剤が好まれます。

大型のPLLポリマーは金ナノ粒子表面により多くのキャプチャmAbを占有するのを防ぎ、プラズモニックシフトウィンドウを狭め、その後のデータ解析のためにより高度な曲線フィッティングプログラムと解析を必要とします。この研究では、内部データベースと同期するウェブポータルツールが利用されました。この初期コストの主な利点は、大規模な配列プールからデータ構築の可能性を持ち、下流の候補者の多様性を最大化し、コストのかかる開発段階^34、35、36でのボトルネックを緩和できることです。ここで述べるCS-SINアッセイは、HTP互換法として際立っており、後期段階のコロイド安定性^アッセイと良好な相関を示すことが示されています。AI支援プロファイリングは、将来のプログラムのための多分野の設計や、各ドメインの個々の貢献を複雑なフォーマットで理解するために進行中です。^41、42、43、⁴⁴。これらの取り組みは、抗体治療薬のメタアナリシスやコロイド安定性特性のより詳細な決定に影響を与え、最終的には初期の研究開発段階での時間を節約します。

プロトコル

図2 はナノ粒子の接合準備を示し、 図3 はワークフロー全体を示し、 図4 はラボ自動化プロセスのマッピング、 図5 はデータ分析パイプラインの図を示しています。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. バッファーの準備

注:第1週(サンプル準備)

1. ヒスチジン(10 mM)、pH 6.0(サンプルおよびアッセイバッファー)を準備します。
   注意:これらのステップは1日目に実施されます。
   1. 5 mM L-ヒスチジンモノハイドロルドモノハイドレートと5 mM L-ヒスチジンを超純水に溶かします。塩酸を滴ごとに加えながらかき混ぜ、校正済みpHメーターでpHが6.0に達するまで加えます。
   2. 溶液を真空下で0.22μmの孔径フィルターでろ過し、無菌ボトルにろ過液を回収します。
   3. 品質管理のために導電率を測定し、約500 μS/cmの読み取り値を確保してください。
2. 酢酸カリウム(20 mM)、pH 4.3(キャプチャmAb共接バッファー)を準備します。
   1. 酢酸カリウムを超純水に溶かし、氷河酢酸でpHを4.3に調整します。
   2. ステップ1.1.2で説明された通り、0.22μmの孔径フィルターを通した真空ろ過で溶液を滅菌します。
3. ポリLリジンを準備します。
   1. 超純水に5 mg/mLのストック溶液を準備し、−20°Cで保存して使用します。

2. すべてのサンプル(候補mAb)の透析

注意:これらのステップは2日目から5日目に行ってください。

1. 100μLまたは300μLのダイアライザーを10 mMヒスチジン、pH 6.0に5分間浸け込みます。
2. すべてのサンプル(50〜100μL)を透析カセットに移します。カセットを10 mMのヒスチジンバッファー、pH 6.0(1箱700 mL)に浸し、リザーバーをリザーバーに加え、リザーバーを磁気攪拌板に置き、4°Cで2時間15分キュベートします。
3. 10 mMヒスチジン(pH 6.0)で2時間15分ごとに7回のバッファ交換を行うか、4晩のバッファー交換を行い、サンプルから塩分を完全に除去します。
4. サンプルを採取し、クリーンなマトリックスバイアルに移し、CS-SINアッセイが行われるまで4°Cで保存します。
5. 透析後に試料濃度を測定し、多分散情報を記録します。補正濃度は、1 mg/mL溶液の280 nmでの生吸光度値で280 nmの吸収度で割って計算します。
6. 液体ハンドラー入力ファイルを、井戸アドレスと濃度(μg/mL)、制御を含むものを準備します。

3. キャプチャーmAbのバッファ交換 (図2、ステップ1)

注意:これらの手順は第2週の1日目に実施してください(アッセイ)。

1. 2 mLの脱塩カラムから貯蔵バッファーを、室温で1,000 × g で2分間遠心分離して取り出します。捕獲mAbの700μLごとに2本の脱塩カラムを準備します。遠心分離の各ステップ後にフロースルーは廃棄します。
2. カラムを20 mMの酢酸カリウムバッファー1 mL、pH 4.3で3回洗浄します。各洗浄時に1,000 × g で2分間遠心分離します。
3. 各カラムに700μLのキャプチャーmAb(ヤギ抗ヒトFcγ特異的抗体)を加え、1,000× gで2分間遠心分離して新しい15mLチューブに溶出させます。
4. 脱塩した溶出液を採取し、2つ目の平衡脱塩カラムに塗布し、1,000 × gでさらに2分間遠心分離します。
5. すべての溶出サンプルを組み合わせます。
6. 脱塩後のキャプチャmAb溶液の濃度を測定します。これは2〜5日目、ステップ2.5で説明されています。
7. キャプチャーmAbのストック溶液を20 mMの酢酸カリウムバッファー液、pH4.3で0.8 mg/mLに希釈し、使用まで保管します。

4. ポリLリジンの作動ストックの準備

1. ポリL-リジンストック溶液の小さなアリコートを超純水で2.66 mg/mLに希釈します。

5. 金ナノ粒子の 濃度(図2、ステップ2)

1. 20nmの金ナノ粒子を含むポリプロピレンマイクロ遠心機チューブを用いて、1.2mLのストック懸濁液を1mL管に、または5mL管に4.8mLのアリコートを準備します。遠心分離機で21,130 g ×6分間。
2. ペレットを乱さずに上清液(~1.1–1.15 mL)を取り除き、別の円錐形チューブに移します。
3. 濃縮されたペレットと残留体を清潔なマイクロ遠心分離機のチューブに混ぜ合わせます。ピペッティングでナノ粒子の体積を決定し、保存された上清液を使って(1 mLのチューブ数×50 μL)または(5 mLのチューブ数×200 μL)に調整します。例えば、1.2 mLのアリコット10個を1 mLのチューブで遠心分離した後、濃縮ナノ粒子の最終体積を500 μLに調整します。

6. ナノ粒子の組み立て

1. ポリLリジン作動液1.5 μLとバッファー交換キャプチャーmAb 48.5 μLを十分に混合します(図2、ステップ3)。
2. ステップ5の濃縮ナノ粒子溶液とステップ6.1のポリL-リジン/キャプチャmAb溶液を1:1の混合物を準備します(図2、ステップ4)。
3. 混合液を室温(23°C)で一晩孵育します(図2、ステップ5)。

7. 液体ハンドラーアッセイプレートの設置

注意:これらのステップは2日目に実施してください。

1. アッセイに必要な材料をまとめます。透析抗体、透析後の濃度を含む液体ハンドラー入力ファイル、共役金ナノ粒子、ロボット操作チップ、プレート、貯留槽などです(図3、ラボオートメーション、ステップ1)。 図3 (ラボ自動化、ステップ1)のレイアウトに従って、チップ、サンプル、プレート、リザーバーをデッキに事前にロードします。
2. 対照群を試料プレートのウェルA12–D12に追加します(陽対照2つと陰性2個)。液体ハンドラーが準備したバッファーサンプルのために、H12井戸を空にしておきます。
3. 液体ハンドラーCS-SINメソッドを開き、プログラムを開始します(図3、ラボオートメーション、ステップ2–3)。入力ファイルを読み込み、サンプル数を入力します(図4A)。その後の2つの計算チェックウィンドウ(図4B,C)を確認し、値を確認して実行を進めます。
4. 対照を含むサンプルを、マトリックス試料チューブからポリメラーゼ連鎖反応プレートへ最終体積100 μLで移すことで、pH 6.0の10 mMヒスチジンバッファーで55.5 μg/mLに正規化します(図4D、ステップ1)。進捗を監視し、完成したプレート領域はグレーに表示され、アクティブなステップは緑色で強調表示されます(図4E)。
5. 各サンプルを11.1 μg/mLで10 mMヒスチジンバッファー、pH 6.0で、ポリメラーゼ連鎖反応プレートから最終体積200 μLの深ウェルブロックへ移すことで、より大きな希釈液を準備します(図4D、ステップ2)。
6. ステップ2の後にシステムを一時停止させてください。指示があれば、ステップ6.3で調製した濃縮金ナノ粒子をチューブを逆さまにして約10回上下にピペットで混ぜます。
   1. ナノ粒子を2本のポリプロピレンマイクロ遠心分離機管に均等に分散させ、キャップを開けてチューブをデッキ上の指定されたチューブラックの位置に置きます(図4D、「AuNP」が強調表示)。ランを再開し、液体ハンドラーが2つずつ2つの深井戸ブロックの各井戸に20μLのナノ粒子を注入できるようにします(図4D、ステップ3)。
7. 液体ハンドラーが11.1 μg/mLサンプルを含む深層ウェルブロックから2番目の深部ウェルブロックへ192μLのサンプルを移し、十分に混合させます。各サンプルごとに4× CS-SINマスターミックスを作成し、48 μLの金ナノ粒子を加えて最終体積240 μLに後、最終サンプル濃度10 μg/mLとなります(図4D、ステップ3)。この時点で4時間の孵化タイマーを始めてください。
8. 液体ハンドラーがソースウェルに30μLを供給し、さらに384ウェルプレートの各四分円の4つのウェルのうち3つに60μLを供給することで、各サンプルごとに技術的な三重回路を生成します(図4D、ステップ4)。残りの30μLをソースプレートに戻します。
9. 走行が進むにつれて液体ハンドラーデッキの配置を監視してください。使用された先端と充填されたサンプル井戸がリアルタイムで明るい灰色から濃い灰色に変化し、アクティブな動きは緑色で示されています(図4E)。
10. 走行終了後はプレートを外してください。プレートを最小限の粘着性の透明なプレートシールで封印し、室温で合計4時間培養します。3.5時間の時点で、 補足図2に示された設定を使ってチャンバーを20°Cに平衡させる動的光散乱プログラムを開始します。
11. 各ウェルの吸収スペクトルを4時間の時間点で1 nm単位(ピークの両側それぞれ30 nm)単位で測定します。
12. 補 足図2に示された設定で、4.5時間の時点で動的散乱プレートリーダーを用いてすぐにプレートを測定します。
    注意:ダイナミックレンジが限られているため、スペクトル測定には高性能プレートリーダーを使用してください。速読み機能は使わないでください。

8. データ解析 (図5、データ処理方式)

1. 分光光度計プラットフォームから生ファイルをエクスポートし、アクセス可能なドライブフォルダに保存します。
2. 内部サーバーに連携したスクリプトウェブポータルにアクセスしてください。必要なCS-SIS入力パラメータを入力します。以下は以下の通りです:(1) 開始波長;(2) 生の結果ファイルのディレクトリ位置;(3) ナンバープレートセットおよび候補者識別子;(4) 正規化のための正および負の制御井戸アドレス;(5) メソッドセットアップの指定(「マニュアル」または「液体ハンドラー」);(6) スペクトルスキャンおよび動的光散乱測定に使用される機器;(7) 電子実験ノート(ELN)識別子;(8) 取得日。
3. パラメータをウェブポータルに提出し、raw-resultsディレクトリのサブフォルダに3つのExcelファイルが生成されていることを確認します。
4. ウェブポータルで実行される曲線フィッティングスクリプトを使ってλmax値を計算します。
5. レプリケート値、正規化結果、スペクトルスキャンおよび動的光散乱測定の代表グラフを含む2つの出力ファイルをレビューしてください。
6. 3つ目の出力ファイル(アッセイメタデータと正規化された結果を含む)を使い、データベースのユーザーインターフェースで一括検査結果を作成します。グループ固有の要件に応じてレポート属性を定義し、結果をデータベースにアップロードして全社でのアクセスを可能にします。

結果

図6 は結果を示し、 補足図3Aは 代表的な原油および精製サンプルからのCS-SINスコアの例を示し、 補足図3B は異なる日間のウェル間の信号の変動を示し、 補足図4 はプレート検証プロセスの結果を示し、 補足図5 は両方のCS-SIN読み取り値の正規化計算を示しています。

重要なのは、透析後に少なくとも55μg/mLの濃度を報告し、10 mMヒスチジン(pH 6.0)で採取し、これは最低ストック濃度(サンプルあたり最低6μg)であるため、アッセイの実現可能性を考慮し、新たな子識別子が作成されたことです。合計で70個の精製サンプルと20個の原油発現サンプルがあり、それぞれ異なる開発可能性チェックポイント(リード最適化段階で精製されたものと 、図1Aに示されたリード同定段階の1段階または2段階精製された原油物質)を代表しています。粗物質は完全自動化された哺乳類発現システムであるタンパク質発現精製プラットフォーム(PEPP;GNF(カリフォルニア州サンディエゴ、アメリカ合衆国)からも活動しています。対照群は商業資料に基づいており、最大または最小粘度、kD-DLS、CS-SINの値を持つことが以前に検証されています。新鮮なアリコートは-80°Cで保存され、各アッセイごとに新しいアリコートが使用されます。

図6A、B はサンプルタイプ別にプロットされた平均スペクトルおよびDLSスコアを示し、棒グラフは誤差バー(標準偏差)と一致する色コードを示しています。正規化は、試料と負のコントロール値(スペクトルシフトまたはZ平均、水力学的直径(nm単位)で計算されるラムダ最大値)を対照群の差で割ることでスクリプトによって計算されます(補足図5参照)。 図6C はスペクトルスコアとDLSスコアをプロットしており、解析アプローチ間の明確な相関を示しています。 表1には 、識別子、井戸アドレス、試料タイプ、スペクトルスコア、DLSスコアおよびそれらの標準偏差が記載されています。単一特異性IgGのコロイド安定性リスクのカットオフ(スペクトル値やDLS測定値に関わらず)は、正規化値0.35( 図6A、Bの緑色点線で示されている)、6/70(重複対照を除く)を超える場合、精製サンプルは高リスク、64/70は低評価とされました。重要なのは、多分野フォーマットではカットオフが上昇傾向にあると予想される点です。粗発現サンプルでは、20サンプル中2%が高得点、18/20が低評価でした。ここで試験された精製された物質のうち、サブセットの親バッチの粗発現もスクリーニングされ、同様の結果が得られました( 補足図3Aに示)。これにより、独立したバッチからの候補タンパク質のスケールアップ(精製)時にアッセイが代表的であることが示されました。サンプルサイズは制限されているものの、標準誤差は粗PEPP試料の方が精製された試料よりも高くなる傾向があることが指摘されています。後期段階でCS-SINを行う利点は、粘度やkD-DLS測定など、より多くのタンパク質を必要とするアッセイで直交評価を実施できることを保証し、早期現像性スクリーニングでCS-SINを行うことでコロイド安定性リスクを事前に対処し、最終リード候補プールに影響を与える可能性があります(図1B)。誤差の高い境界候補は、下流のアッセイで高リスクまたは低リスクとして確認できます。

検出されるプラズモニックシフトが小さいため、アッセイに自信を与える代替の読み取り方法が記載され、これによりダイナミックレンジが広がり、高性能なプレートリーダーが存在しない場合に特に有用となり得ます。DLSの読み出しは、ナノ粒子クラスタリングとナノ粒子のスペクトル特性への依存を区別します。しかし、両記述子は標準誤差の範囲が似ており、測定値に比べて小さいです。外れ値の読み取りに弱いサンプルは誤差が高く(または「マルチモーダル」でDLSで結果を報告しない)、しかしアッセイの作業範囲内のCS-SIN値は誤差分布が低いようです。DLS値とスペクトルスコア値を比較すると、粗サンプルから取得したDLSの結果の誤差分布はスペクトルスコアよりも狭いです。しかし、これはDLSスコアとしてカットオフを下回った1人の候補者にしか影響を与えず、スペクトルスコアとしては影響が出なかった。もし研究所に異なる機器があれば、これは有用になるかもしれません。

データ処理の信頼性と手法自体の信頼性を具体的に考慮するため、上記のデータセットにおける正・陰の対照群の読み取り時間はエンドツーエンドで修正され、さらに384ウェルプレートの開始と終了の中間基準として複数の中・低対照が設置されました。 補足図4は 最終的なプレート検証の結果を示しており、プレートの開始時と末尾に配置された試料の値にほとんど有意な違いが見られず(補足図4A、B)、両表示値の相関が高いことを示しています(補足図4C)。最後に、 図6のスペクトル走査およびDLSデータセットから対照群のZファクターと%CVを計算しました。ここで示した対照群のデータから、スペクトルスキャンの読み取り値はZファクター0.648、陽性対照群は0.019%のCV、負の対照群は0.012%と判明しました。DLSの表示ではZファクター0.998と計算され、陽性対照群は0.025%、陰性対照群は0.021%のCVでした。全体として、このアッセイ(図6C)におけるサンプル値間のスピアマン相関係数は0.829と強く正の数値と計算されました。これらの値は両方の測定タイプにおいて確かな精度と再現性を示しており、予想通り、新しく有利なDLS検出戦略はZファクターを最適化しますが、スペクトルスキャンは信頼できる結果を記録するのに十分な分離帯(Z > 0.5)を提供します。DLSスコアはCS-SINワークフロー内で同時に収集される直交的な読み取りであり、追加のサンプル準備は不要であることに注意が必要です。生のDLSスコアの値差が大きいことはZファクターの改善を意味しますが、「スコア」は生の値から正規化されているため同じように解釈されます。さらに、DLSの読み取りはナノ粒子クラスターの三次元サイズを捉え、プラズモニクスシフトやスペクトル情報による近接性の間接的な指標と区別し、CS-SINSアッセイの動態に関する理解を深める可能性があります。HTPアッセイはプレートベースかつ時間的に重要であることを考慮し、これらの手法でアッセイの信頼性を高めることを目指しました。

図1:開発可能性パラダイムとCS-SINデータ収集。(A) 多特異的抗体の発見キャンペーンから候補選定までの典型的なワークフローは、この図に示されています。発見プロセスでは単一種候補をスクリーニングし、その後様々なデータパッケージから単一特異性を絞り込み、多特定フォーマットにまとめる過程を経ます。データパッケージは繰り返しまたは拡張され、リード候補を絞り込み、最適な開発候補が選ばれます。現在の作業ストリームでは、分子の小さなパネル(紫色の箱)を選択することで、低スループットアッセイが行われます。HTP CS-SINS は経路のすべての段階で実施でき、貴重なデータを追加し、選択プロセスを改善します。(b) 上位6候補のコロイド特性の仮説的結果を示し、低スループットアッセイによるリード候補選択とHTP CS-SISによるリード候補選択の2つの経路を示します。不利な解の行動を示す候補者は、グローで表されます。最初のシナリオでは、発見スクリーニングの最適結合特性に基づくリード候補の半数が高濃度挙動を示しました。2つ目のシナリオでは、コロイド安定性が中程度に低い候補者1名のみが含まれており、これはCS-SINデータが早期発見スクリーニングで結合データと並行して考慮されたためです。2つ目のシナリオでは、1つ目のシナリオよりも潜在的な候補者の多様性が高いです。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:SINSアッセイのワークフロー。金ナノ粒子の調製および共役:(1)キャプチャmAbはバッファー交換で20 mMの酢酸カリウム、pH 4.3に変換され、0.8 mg/mLに希釈される。(2) 金ナノ粒子はストックから濃縮されます。(3) ポリLリジンはバッファー交換されたキャプチャーmAbと混合されます。(4) 金ナノ粒子をポリL-リジンおよびキャプチャーmAbと共にインキュベートし、十分に混合します。(5) CS-SINS複合体を室温で一晩培養すること。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ラボ自動化ワークフロー。ラボオートメーションのワークフロー:(1) 液体ハンドラー法のために材料とサンプルをまとめます。10 mMヒスチジン(pH 6)で透析されたサンプルは、マトリックスチューブまたは96ウェルプレートで採取されます。サンプル濃度は液体ハンドラー入力ファイルにフォーマットされます。CS-SINSの複合金ナノ粒子をmAb捕捉に結合し、ロボット液体取扱チップ、プラスチック器具を収集し、液体ハンドラーアッセイセットアップの準備を行います。(2) アッセイプレートは液体ハンドラーで準備され、室温で4時間培養されます。3) 4時間経過時に、サンプル井から25分間のスペクトルスキャン(読み出し1)が収集されます。4.5時間経過後は動的光散乱(Readout 2)が均一な井戸集団ごとにサイズ情報を収集します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図4:液体ハンドラープログラムとプレートセットアップ。(A) プログラム開始後、システムが初期化された後、指定された井戸アドレスと試料濃度を含む入力ファイルを選択するための別のウィンドウ/プロンプトが開きます。試料数は毎回指定する必要がありますが、200μLの体積(384ウェル板スタンピング前の混合試薬の最終体積)は一定のままです。(B)(A)の前のウィンドウから「続行」をクリックすると、この2つ目のウィンドウが表示され、左側の入力ファイルの解釈と右側の値の解釈を確認します。(C) (B)からの解釈を確認すると、この3つ目のウィンドウが表示され、標準化(100μL体積)への試料濃度(100μL体積)の計算を二重チェックするダイアログボックスが表示されます。(D) このレイアウトは液体ハンドラーソフトウェアモジュールのメソッドエディタービューから得られます。左側には300μLの標準チップが装填され、ステージ中央には50μLの箱1つと300μLのスリムチップが3箱装填されており、液体取り扱いロボットに対応しています。前方には10 mMヒスチジン(pH 6、サンプルが透析されたバッファー)を充填します。金ナノ粒子は2本のマイクロ遠心分離機管に均等に分割され、右側のチューブラックの後ろにキャップなしで積み込まれています。サンプルチューブ付きのマトリックスプレートはキャリアの背面の10列に積み込まれます。試料の後には、正規化プレート(1)、11.1 μg/mLサンプルを用いた深ウェルプレート(2)、結合試料とナノ粒子の200 μL深ウェルプレート(3)、384ウェルフォーマット済みプレート(4)が示されます。(E) 液体ハンドラーデッキのレイアウトは、チップの回収とサンプルディスペンスのリアルタイムを示し、各工程の進行に伴い井戸にマーキングを示します。ここでは、すべてのサンプル(キャリア背面の^3列目の96ウェル画像)およびその後の正規化プレートがグレーアウトされており、これはサンプルがソースマトリックスプレートから正規化プレートに追加されたことを示します。緑色では、トラフからバッファーを吸引し、混ぜながら正規化プレートの第1カラムに送り出した後の8チャンネルヘッドを示しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:データ処理方式。データ処理方式:(1)生データファイルは内部サーバーに提出されます。(2) データファイルは、スペクトルスキャンの曲線フィッティングの微調整、CS-SIN複製のラムダ最大値を計算し、DLSによるマルチモーダル集団の検証を行うためにカスタマイズされたスクリプトで読み取られます。(3) データは複製ごとにグループ化され、その後平均化され、指定されたコントロールに正規化されます。結果をリンクするために、データベースポータル内の一致プレートマップが提供されています。(4) すべてのデータはデータベースにアップロード可能なテンプレートに整理され、ELNレポート用のグラフが自動的に作成されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図6:表示1および表示2の代表的なデータ。(A) 正規化されたスペクトルシフトスコアは、精製済みの粗発現サンプルおよび垂直点線で区切られた対照サンプルのPPB IDによってプロットされ、バーグラフプロットでサンプルタイプ間の誤差バー分布を決定しました。赤い実線はアッセイの上限を示し、これは陽性対照群に対応し、緑の点線はCS-SINSの低リスク分子プロファイルのカットオフ値を示しています。(B) 正規化されたDLSスコアは、PPB IDによって精製済み粗発現サンプルおよび対照サンプル(点線で区切られた箇所)で棒グラフプロットを行い、サンプルタイプ間の誤差バー分布を決定しました。一部の値が欠落しています(例えば、DLS出力からのマルチモーダルスキャンによる薄青色の2^番目の 値(A)は、スクリプトソフトウェアのウェブポータルが無効と判断したためです。赤い実線はアッセイの上限を示し、これは陽性対照群に対応し、緑の点線はCS-SINSの低リスク分子プロファイルのカットオフ値を示しています。(C) スペクトルシフトとDLS値の平均化された正規化スコアを相関ドットプロットで比較しました(スペクトルシフトスコアはY軸、DLSスコアはX軸に対応します)。色分けはDLSスコアのみと連動しています。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1。CS-SINSによって決定された抗体サンプルのコロイド安定性スコア。 表は、CS-SINアッセイから得られたサンプル識別子、ウェルアドレス、サンプル分類、正規化スペクトルスコア、動的光散乱(DLS)スコアをまとめたものです。この表をダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図1:PLLはCS-SINSに対してAuNPの安定性を10 mMで改善。彼のバッファーpH 6。この図は、陰性コントロールmAbがPLL被覆されたCS-SINS複合体に結合しバッファーのみ制御が緊密に重なっている様子を示しています。これは、陰性対照mAbまたはバッファーのみの被覆金ナノ粒子では全く異なるピークが異なるのとは対照的です。青色で示されているのは、10 mMで培養された共役AuNPの4時間時点で1nm単位で測定されたインクリメンタルスペクトルスキャンです。彼のバッファーは、ポリL-リジンの事前インキュベーションなしに負の対照群(PPB-117487)で培養された共役ビーズと重ねられています。赤字表示は、10 mMでインキュベーションされた共役AuNPの増分スペクトルスキャン(4時間の時点で1nm単位で取得)です。ポリL-リジンの前インキュベーション後、彼のバッファーは負対照(PPB-117487)でインキュベートされた共役ビーズで重ねられています。PLL存在下での両陰性対照の計算ラムダ最大値はほぼ一致しています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図2:DLSプレートリーダーのDLSおよびウェルプレート選択の設定。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図3:PEPPで発現したAbsとPurified下流のCS-SINスコア。(A) 正規化スペクトルシフトスコアは、PEPPサンプルのウェルIDとプレートID(例:A1PL1=プレート1のウェルA1)でAb64を表現し、下流の純化Ab64の正規化スペクトルシフトまたはDLSスコアとは垂直点線で区切って、試料タイプ間の誤差バー分布(標準偏差)をバーグラフプロットで算出しました。緑の点線はCS-SINの低リスク分子プロファイルのカットオフ値を示しています。(B)(A)で実施されたすべての実験サンプルの総AUCとプレート全体の分布をここにプロットします(対応する実験ごとに色分け)。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図4:コントロールのエンドツーエンド384ウェルプレート検証。(A) 384ウェルプレートの先頭のサンプルの平均化・正規化スペクトルスコアは赤色でプロット・表示され、384ウェルプレートの末尾でスキャンされた重複値はライムグリーンで示されます。レプリケート値は並べて並べられており、正のコントロール(PPB IDの横にプラス記号で示される)から負のコントロール(PPB IDの横にマイナス符号で示される)までさまざまです。液体ハンドラープログラムによって作成されたバッファ制御の値は(サンプル入力プロンプトとは独立)チェッカーパターンで示されています。(B) 384ウェルプレートの最初の列にあるサンプルの平均・正規化されたDLSスコアは赤色でプロットされ表示され、384ウェルプレートの末尾でスキャンされた重複値はライムグリーンで示されます。レプリケート値は並べて並べられており、正のコントロール(PPB IDの横にプラス記号で示される)から負のコントロール(PPB IDの横にマイナス符号で示される)までさまざまです。DLS読み取りにはバッファ制御値がありません(マルチモーダル読み取りのため)。(C) 平均化された正規化スペクトルスコアは、384ウェルプレートの開始列から384ウェルプレートの末尾までのサンプルの相関ドットプロットでDLSスコアとプロットされます。データポイントの色分けは、平均的な正規化されたスペクトルスキャンスコアに直接対応します。DLS読み取りにはバッファ制御がないため(マルチモーダル読み取りのため)、このプロットでは両方の読み取りから重複した6つの制御のみを比較します。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足図5:ユーザーと日数間の普遍的な報告と参照を可能にするためのスペクトルスコアまたはDLSスコアの正規化計算。陽性対照群は1、陰性対照群は0とされ、高得点はコロイド挙動が悪いと関連しています。このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルは、元のCS-SINメソッド¹⁶からのいくつかの重要な修正を示しています。重要なのは、最適化されたPLL:IgG比率とヒスチジンバッファーが元の研究から維持されていたことです^。特に、このアッセイは液体ハンドラーロボットプラットフォーム向けに適応され、HTP処理(1日で最大352サンプルに対し20~20サンプル)を実現し、手作業時間を短縮し、自動液体取り扱いによる再現性を向上させました。このロボティクスシステムは、384ウェルプレートなどの新しいフォーマットへのスタンピングを含むプレートベースのフォーマットや様々な実験器具タイプに対応しています。プログラムは独立して動作でき、エンドツーエンドのワークフローにより、サンプル制限のある環境下で高ボリュームの読み取りと再現性の向上が可能となります。DLS測定はスペクトルシフトの直交読み取りとしても組み込まれ、スペクトルシフト解釈よりも最適なZファクター(0.998対0.648)となり、スペクトルスコアの境界線や標準偏差が高いサンプルに特に有用であり、プレートリーダー出力だけで得られるダイナミックレンジを強化するためのプラズモンシフトの解釈も説明しています。高性能なマルチモードプレートリーダーが利用できないラボでも、DLSを用いてCS-SINを安定して実行できると提案されています。384ウェルプレート全体で時間依存的な変動の可能性に対処するため、プレートの開始点と終了点の両方に対照を配置し、スキャン時間効果が最小限であることを確認した(補足図4参照)広範なプレート検証が行われました。さらに、粗なPEPP試料が精製された物質と同等の結果を得ていることが示され(図6、補足図3A)、これにより、精製タンパク質が入手できない初期の発見段階への応用が拡大されました。これはこれまで報告されていなかったことです。補足図3のデータは、サンプル間の信頼性を示していますが、異なるデータセットから収集・正規化されたため、日ごとのアッセイばらつきは最小限であることも示しています。より具体的には、補足図3Bは、各実験プレートの全ウェルの曲線下の総面積を示しており(補足図3Aの同じ実験のプレートと色分けされています)、同一実験内および異なるビーズ調製の異なる日における予想される最小限の変動を示しています。初期発見段階では、kD-DLSやカラムベースアプローチ(SMAC、CIC)などの方法は、サンプル消費量の増加と粗物質12,13,24,25,26,27の処理が困難であるため実現不可能です。CS-SINは、この段階で1サンプルあたりわずか6μgでコロイド安定性スクリーニングを可能にし、1段階で精製可能です。最後に、曲線フィッティングスクリプトはマイナーラムマックスシフトの微調整に対応し、ファイル処理の改善と内部データベースへの自動データ報告を可能にするために更新されました。

一般的なトラブルシューティングシナリオには、(1) スペクトルやDLSスコアの標準偏差が高いこと、しばしばナノ粒子の不完全な混合(ステップ7.6)やサンプル集積を示すことが含まれます。そのような場合、透析後の完全性を確保するためにDLSによる品質検査を行い、標準的な表示としてスペクトルスコアをデフォルトで行うことが推奨されます。(2) マルチモーダルのDLS分布やDLS測定の失敗は、通常、既存のサンプル凝集や塵の汚染によって引き起こされます。透析前に0.22μmフィルターを通したろ過でこれを軽減できます。(3) スペクトルスコアとDLSスコアの不一致(これは通常、DLS測定の歪みに起因するもので、スペクトルスコアでは正常-高範囲内に現れる可能性が高い)に起因します。(4) 通常はナノ粒子の不適切な貯蔵や劣化したキャプチャーmAbによる不安定な正のコントロール値;-80°Cで保存された新鮮なアリコートは各アッセイに使用すべきです(4°Cで数日以上保存しないでください)。

アッセイの制限には、試料を徹底的に透析し、アッセイ前日に半手作業で含めてナノ粒子を準備する時間が必要であること、ただし、透析時間はサンプルセットの大小に関わらず同等です。チップの詰まりリスクに関しては、液体ハンドリングチップは吸引時の圧力変化を監視し、操作中に関連するエラーが発生します。方法開発段階では、ログファイル(およびサービス後も継続)を確認し、スクリプトで期待される体積が計算されているか確認しました。アリクオティング機能は濃縮ビーズ製剤に対して試験されており、問題は予想されていません。アッセイの時間的制約性、Fab主導の評価、そして粘度やオパルスなどのコロイド挙動を直接測定しない代理アッセイとしての役割を認めています。しかし、この適応により、創薬プロセスの初期段階で大規模なデータセットを効率的に特徴付けることができ、これまで存在しなかった強力なスクリーニングツールとして機能します。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、再現可能な結果を確保するために細心の注意が必要です。まず、バッファー準備時の正確なpH調整(ステップ1.1.1および1.2.1)が不可欠であり、±0.1pH単位を超える偏差はナノ粒子の安定性や抗体捕捉効率に影響を与える可能性があります。キャプチャ抗体製剤に使用される低pHバッファーは最適な結合を保証し、指定されたバッファー条件は電荷安定化および広範な抗体適合性(通常は製剤の文脈で)に最適化されています。10 mMのヒスチジンpH 6.0バッファーは、最適な静電気相互作用を提供しつつタンパク質の安定性を維持します。次に、塩分を完全に除去する徹底的な透析(ステップ2.3)が不可欠です。不完全な透析は、ナノ粒子組み立て中の静電気相互作用に干渉することがあります。第三に、金ナノ粒子濃度のステップ(プロトコルステップ5.1–5.3)は、ナノ粒子濃度の不均一がアッセイ感度に直接影響するため、ペレットを乱さないように慎重に行う必要があります。第四に、PLL:キャプチャmAb比0.03(ステップ4.1)は、前述の¹⁶の通り、十分なプラズモニックシフトウィンドウを維持しつつ、最大限の表面被覆を最適化しています。液体取り扱いの力学に関しては、金ナノ粒子が導入されるまで、液体センシングチップが正規化やプレート混合を行うために使用されていました。金ナノ粒子は溶液中で信頼性が高く測定されず(したがって分配量を標準量に設定します)、上流の液体検出では、プレートのずれやサンプルの欠落などの問題をオペレーターが指摘し、384ウェルスタンピングステップではZアライメントの問題を特定できます。最後に、4時間のインキュベーションタイミング(プロトコルステップ7.10–7.12)を厳格に守り、未完成のプレートであっても最初から終了まで一貫してプレートを読み取ることが極めて重要です。なぜなら、プラズモニックシフトやナノ粒子のクラスタリングは時間依存的な現象だからです。遅延や早期の読み取りはCS-SINスコアの不正確さを招くことがありますが、HTP形式ではプレート全体を読むことで日ごとのスコアの一貫性を確保します。

多特異的抗体のコロイド安定性がますます研究される中で、CS-SINSのようなHTP生物物理アッセイが提供する大規模なデータセットは、分子安定性に対する組み合わせ効果をより深く理解するためのAI/MLモデルの活用に寄与する可能性があります。研究によれば、配列の多様性が高まるにつれて、AI/ML結果の精度向上のためにより大きなデータセットの必要性が高まることが示されています(41,42,43)。単一特异物の性質や分子記述子は、二特種や三特異物に再フォーマットされると変化する可能性があり、化学分解責任などの属性に対する配列やモチーフ特異的要素ではなく、分子全体の電荷分布とバランスを考慮します。17,18,19,20,21,22.特に、予測される静電パッチ、疎水性、溶媒でアクセス可能な表面積などの構造的特徴は、配列特異的特性に依存しない集積や安定性の予測を向上させ、予測準備と互換性のある小規模データセットを複数作成します 17,18,19,20,21,22.CS-SINスコアが分子の生物物理的プロファイルの代表的な集大成を示す単純な指標であることから、このアッセイはAI/MLモデルの訓練に適しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CLEARSEAL FILM 100PKCLEARSEAL	Fisher Scientific	500214
CO-RE II (50 μL Conductive Tips, 300 μL Conductive Tips, 300 µL Slim Conductive Tips)	Hamilton Company	235966, 235902, 235806
Eppendorf Tubes Snap Cap (5.0 mL, Microtube)	Eppendorf	30119401
Falcon Conical Centrifuge Tubes (15 mL)	Thermo Fisher Scientific	Falcon 352196
Goat antihuman Fcγ-specific antibody	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-005-008
Gold nanoparticles (20 nm)	Ted Pella Inc.	157051
Greiner Bio-One 384-well μClear Bottom Polystyrene Microplates – (SS & DLS assay plates)	Fisher Scientific	07-000-057
Greiner Bio-One MASTERBLOCK 96 Deep Well Conical Bottom 2 mL Storage Plate – (mastermix and reagent mixing plates)	Fisher Scientific	07-000-122
Hard-Shell PCR Plates normalization (96-Well, low profile, thin wall, skirted, white/clear HSP9601)	Bio-Rad	HSP9601	URL: https://www.bio-rad.com/en-us/sku/HSP9601-hard-shell-96-well-pcr-plates-low-profile-thin-wall-skirted-white-clear?ID=HSP9601
Histidine hydrochloride buffer sample (10 mM, pH = 6.0, sample and assay buffer)	Sigma	H8125; H6034	最終濃度5 mMを超純水で調製し、pHを6.0に調整し、超純水で最終量を調整し、0.22 μmフィルターで濾過
Matrix ScrewTop Tubes sample (500 μL)	Thermo Fisher Scientific	3744
MD100 or MD300 Xpress Mini Dialyzer (Xpress Micro Dialyzer, Scienova, 6-8 kDa, 96 pcs. in deep well plate (12 cartridges), sealing sheet) and dialysis reservoir/box (low volume dialysis cassettes)	Vivaproducts, Inc.	40789, 40076
Microcentrifuge tubes pure polypropylene (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Nalgene Disposable Polypropylene Robotic Reservoirs – (buffer trough)	Thermo Fisher Scientific	1200-2300
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes	Thermo Fisher Scientific	567-0020
Poly-L-lysine, >70,000 MW	MP Biomedicals	219454405	超純水で5 mg/mLのストック溶液を調製
Positive and negative Controls (1 mg/mL dialyzed into 10 mM Histidine, pH 6)	Internally-produced commercial antibodies	N/A	正のコントロールのスペクトルシフトは約2 nm、DLSサイズは250-300 nm。負のコントロールのスペクトルシフトはわずかで、DLSサイズはバッファーのみのコントロールに匹敵
Potassium acetate buffer capture (20 mM, pH = 4.3, mAb conjugation buffer)	Fisher Scientific	P171-500	超純水で10 mMの試薬の最終濃度を調製し、酢酸でpHを4.3に調整し、超純水で最終量を調整し、0.22 μmフィルターで濾過
Zeba desalting columns (2 mL, 5 mL, or 10 mL)	Thermo Fisher Scientific	PI-89889; 89891; 89893