サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

Summary

RNAの二次構造は主に成熟RNAで構造プローブ法を用いて観察されています。共転写構造追跡シーケンシング(CoSTseq)は、新生RNA上のポリメラーゼ位置の研究に用いられてきた核ランオンと構造プロービングを統合します。これにより、活性転写下のRNAのRNA二次構造の観察が可能になります。

Abstract

転写過程で、新生RNAはRNAポリメラーゼ(Pols)から抜け出し、塩基対を始めます。この塩基対により、RNA処理、翻訳、安定性のレベルで遺伝子発現に重要な影響を与えるRNA構造の形成が可能となります。RNAの二次構造を研究する確立された方法は成熟した転写産物に限られており、折りたたみ状態についてはほとんど知られていません。さらに、新生RNAの比較的低い存在比(<1%)と一時的な性質が、その分離や特徴付けを複雑にしています。共転写構造追跡(CoSTseq)は、ビオチンNTPおよびジメチル硫酸(DMS)プローブを用いた転写ランオンを活用し、新生転写産物のPol位置と塩基対の状態を同時に取得します。 Saccharomyces cerevisiaeでは、 CoSTseqは3つのRNAポルのいずれかによって転写される新生RNAの3'端付近の配列および構造情報を得ます。転写のランオン中、活性部位に組み込まれたビオチンNTPは効果的にPolsを停止させます。次に、DMSによるメチル酸処理で、未対になったA、C、Uのヌクレオチドを処理します。その後のビオチン濃縮と、テンプレート切り替えリバーストランスクリプトターゼを用いたcDNA合成により、ペアエンドシーケンシングとPol位置に基づくDMS反応の計算が可能になります。CoSTseqはDMSプロービング(DMS-MaPseq)と併用して容易に実施でき、折りたたまれた成熟転写本のキャプチャも可能にします。ここでは、転写ランオン、ライブラリ作成、データ解析を含む並列CoSTseqおよびDMS-MaPseqの詳細なプロトコルを提示します。

Introduction

RNAはRNA分子内の塩基対により二次構造や三次構造に折りたたまれ、これらの構造はRNAの折りたたみを導くシャペロンとして働くタンパク質によってさらに影響を受け^ます。RNA構造は非常に動的であり、細胞RNAは熱力学的地形によって定義されるさまざまな構造に適合し、可能なRNA構造のアンサンブルを生成することができます².動的な立体構造変化は遺伝子調節や発現に影響を与える可能性があります ^3,4。逆に、RNAはtRNA、小さな核RNA、rRNAなど、その機能に密接に関連する非常に好まれる構造を採用することもあります。これらの例は強力な調節役割を持つ成熟RNAを強調する一方で、真核生物のRNA処理ステップは転写と同時進行することが多い。これにはプレmRNAスプライシング、3'端切断、RNA修飾などが含まれる。同様に、RNAの折りたたみは転写本の成熟前に起こることがあり、これは^{他の場所で}議論されています。

RNA配列は二次構造をコードできますが、正確な決定にはしばしば in vitro または in vivoでの実験的検証が必要です。DMS-MaPseq(ジメチル硫酸塩変異プロファイリングとシーケンシング)のような構造特異的化学修飾技術の登場により、^{生細胞から}細胞RNAの二次構造を決定する道が開かれました。DMSは細胞に導入され、アデノシン、シトシン、そしてより小さいが、未対になってのみ利用可能なウリジンのワトソン・クリック塩基対面をメチル化します。DMSによる修飾後、高温忠実度が高く過程的な逆転写酵素(Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase(TGIRT)⁷などが、最終的に調製されたcDNAライブラリー内の変異として改変塩基を再コードするために用いられます。これらの変異は、RNAのヌクレオチドレベルでのアクセス可能性を推測するために用いられます。強力な手法であるDMS-MaPseqおよび関連手法は、すでに完全に折りた^たまれた成熟RNAの研究に主に用いられてきました。

新生RNAの調節と処理を研究するためにいくつかの手法が開発されています。グローバルランオンシーケンシング(GROseq)は、RNA-seqの限界を克服するために開発されました。これは細胞内のRNAレベルを定常状態で測定し、転写、RNA処理、分解プロセスの平均化情報を提供します。GROseqは核ランオンにブロモウリジンを用い、RNAポリメラーゼ(Pol)が数十塩基8の分解能で新生RNAにヌクレオチドを付加する^{ことができました。}この手法に基づいて、ビオチンNTPを用いてRNA Polsを塩基対分解能でマッピングするために、精密ランオンシーケンス(PROseq)が構築されました。ここでは、新たに合成された^RNA9の3'末端でPolが最後に検出された場所にビオチン化NTPを加えます。

最近、SchärfenらはCo-transcriptional Structure Tracking(CoSTseq)を開発し利用し、ビオチンのランオンおよびDMSプロービングを活用し、 S. cerevisiae¹⁰の新生転写産物のRNA構造決定を可能にします。CoSTseqは活性転写中のRNA二次構造の決定を可能にします。このプロトコルは、CoSTseq実験における核ランオンとDMSプローブをどのように組み合わせるかを詳述しています。CoSTseqはサンプル準備時の慎重な取り扱いや、CoSTseq解析時のデータ品質への細心の注意が必要であるため、このプロトコルはIlluminaプラットフォーム上でペアエンドシーケンスに適したライブラリを生成するためのベストプラクティスを詳述しています。CoSTseqプロトコルは同時に新生RNAと成熟RNAを生成し、後者はDMS-MaPseqデータセットとして解析することで、新生RNAと成熟RNAの厳密な比較が可能です(図1)。実験的には、酵母培養の維持や核ランオンおよびDMSプロービングの実施に必要な試薬へのアクセスが必要であり、以下のプロトコルに詳述されています。新生RNA収率はCoSTseqライブラリの準備およびデータ解析の成功に不可欠です。したがって、適切なインキュベーターと培地によって確立された成長条件は、十分な出発物質を確保するために極めて重要です。最後に、CoSTseqデータの計算解析を行うには、高性能計算(HPC)クラスターへのアクセスが理想的です。

図1:同一生物学的サンプルからのCoSTseqおよびDMS-MaPseqライブラリーの合成概要。(A) サルコシルによる酵母細胞壁および核膜の透過化により、核ランオン反応中に新生RNAの3'末端にビオチン-NTPが取り込まれることが可能になります。 (B) DMSは、透過細胞内の新生および成熟RNAに未対対のAおよびC残基(時にU)をメチル化し、全RNAはフェノール/クロロホルム抽出によって得られます。新生RNAはストレプタビジン共役磁気ビーズによって全RNAから精製されます。トリゾール抽出はビーズから新生RNAを放出します。並行して、ポリアデニル化mRNAを含むビーズ上清液はEtOH沈殿を行うことができます。この物質からmRNAはオリゴ(dT)ビーズプルダウンによって分離されます。ポリA+ mRNAはライブラリー調製前に断片化されます。 (C) テンプレートスイッチングリバーストランスクリプトターゼを用いて、新生または成熟RNAから別々にcDNAを生成し、その後5'および3'アダプターの結合でN₇ UMIとバーコードを導入します(CoSTseqの詳細は 図2 参照)。DMS-MaPseqおよびCoSTseq逆転写ステップは、CoSTseqで使われるビオチンNTPとDMS-MaPseqでNオーバーハングを補完する異なるヘテロデュプレックスアダプターを使用します。増幅には最小限のPCRサイクルが用いられ、バイアスを制限し、サイズ選択はアダプターダイマー除去に適用されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Protocol

注意:始める前に、表1に記載されているすべてのバッファが準備されていることを確認してください。すべての試薬はヌクレアーゼフリーの水で準備されるべきです。バッファーの除去剤は、分子生物学グレードの化学薬品や試薬を用いる場合、バッファーのろ過滅菌が推奨されます。セクション1から4については、事前に以下の準備をしてください。

1. 材料および試薬の調製

1. 完全な溶解に十分な時間を確保できるよう、少なくとも1日前に10%サルコシル(v/v)溶液を準備してください。均質溶液を0.22μmフィルターでろ過滅菌します。実験当日は10%サルコシルを使って0.5%のサルコシル溶液を作り、使用まで氷に置いておきます。
2. 超遠心分離機を4°Cまで予備冷却します。 フルームフード内でサーモミキサーを30°Cに設定し、2.5倍の構造プロービングバッファーのアリコートを予温します。このサーモミキサーは後にDMS処理に使用されます。
3. フームフード内でヒートブロックを65°Cに設定し、1回の反応ごとに650μLの酸性フェノール(クロロホルム)を温めてRNA抽出を行います。
4. DTTを2.5倍の転写バッファーと混合し、最終濃度2 mMにします。DMS処理後すぐに使用できるように、清焼液と洗浄液を新たに準備し予備冷却してください(表1参照)。
5. RNA抽出前に酵母溶解のために20% SDSを40μLのチューブにアリコートします。使用前に100 mMの塩化亜鉛(ZnCl2)溶液を準備し、ろ過で滅菌してください。
6. 芽生酵母の野生型株と比較して、新生RNA塩基対に関する特定の研究課題に対応するために必要な欠失、枯渇、ノックイン酵母株を生成すること。適切な酵母寒天プレート(YPD、ドロップアウト、抗生物質プレート)をストリークして、常に新鮮な株を蘇生させてください。実験開始の前日に単一のコロニーから液体培養を開始します。酵母株の成長および操作に関するさらなる指示については、Schärfenら, 2025を参照してください。

2. CoSTseqのための酵母細胞の製剤

1. 前培養の準備: S. cerevisiae SY4741株を50 mLのYPAD培地で培養し、細胞が中間ログ相(光学密度(OD)600 nm = 0.6)に達し、30°Cで200 rpmで振動させます。必要に応じて培養液をOD 0.2〜0.3まで希釈し、酵母は0.6 ODまで待つ。
2. 酵母の収穫:1.8 OD(~3 mL)の酵母培養液を2,500 x g で3分間、予冷の遠心分離機(4°C)でスピンします。上澄液は廃棄容器に捨てます。冷たいリン酸塩緩衝生食塩水(PBS)10 mLを再懸浮してペレットを洗浄します。再び2,500 x g で4°Cで3分間回転させます。 上澄液は処分し、酵母ペレットは氷の上に保管してください。
3. 酵母細胞の透過化:酵母ペレットを冷たい0.5%サルコシル10 mLに慎重に再懸浮させます。セルの再懸浮にはP1000ピペットを使い、気泡を作らないようにしてください。氷の上で20分間孵卵して、透過性を促します。透過性のある酵母細胞を400 x g で4°Cで5分間ペレットします。 透過化された酵母細胞をヌクレアーゼフリー水100μLに再懸濁させます。

注:DMS標識は細胞壁の透過を必要としませんが、核ランオン反応ではビオチン化ヌクレオチドが転写部位に到達するために透過化が必要です。これはサルコシル処理によって実現され、酵母細胞壁とその核膜の両方を透過します。さらに、サルコシル処理は新たな転写開始イベントを防ぎ、Pol IIおよびクロマチン^11,12からの負の伸長因子を除去することでランオンアッセイを促進します。サンプルを優しく取り扱い、遠心速度を低く保ち、細胞破裂を防ぎ、新生転写本へのビオチンの成功的な組み込みを促進する¹³。

3. 核ランオンおよびDMS探査

注:ビオチンNTPによる核ランオンは、RNAポルスの活性部位を停止させる立体阻害をもたらし、新生RNAの選択的濃縮のためのビオチンのハンドルを提供します。望ましい分解能に応じて、核ランオンは1個、2個、または4つのビオチニル化リボヌクレオチドすべてを用いて実施^{されます。}コスト効率のため、ここで説明するワークフローはビオチニル化ヌクレオチド(すなわちビオチンCTP)のみを使用します。

1. 核ランオン反応の準備
   1. 新たに追加した5 mM DTTを用いた2.5倍転写バッファーの作業液を準備し、2.5倍の構造プロービングバッファーを30°Cまで予温します( 表1参照)。
   2. クリーンな2 mLチューブに、2.5倍転写バッファー120 μL、10 mM ATP 3.75 μL、10 mM GTP 3.75 μL、10 mM UTP 3.75 μL、1 mM Bio-CTP 7.5 μL、10% サルコシル 15 μL、そして46.25 μLのヌクレアーゼフリー水で200 μLまで体積を増やします。
   3. 100μLの細胞をチューブに加え、30°Cに設定されたサーモミキサーで2分間、500rpmで振って培養します。
      注意:このステップは非常に時間的に重要です。信頼できるデータを得るためにサンプル数を制限するようにしましょう。一貫性のためにサンプル間のタイミングをずらして行うのがベストプラクティスです。
2. DMS処理:インキュベーションが完了したら、同時に予温された2.5倍構造プロービングバッファー200μLとDMS試薬25μLを同時にチューブに加えます。2回のパルスで優しく渦巻き、30°Cで500rpmで振る4分間サーモミキサーで孵化を続けます。サンプル間を30秒間隔で確保して一貫性を保ちましょう。
   注:DMSプロービングは即時反応であり、RNA塩基対の高時間分解能¹⁴ を許容します。DMSの継続的な修飾を防ぐためには、強力な還元剤βメルカプトエタノールを用いて迅速にDMS標識を焼き付けることが重要です。さらに、残ったDMSは抽出時のRNA回復を妨げます。遠心分離前に飽和水を含んだイソアミルアルコールを加えることで、細胞ペレット¹⁵中の残留不溶性DMSを除去できます。このステップは非常に時間的に重要です。信頼できるデータを生成するには、限られたサンプル数で作業することが不可欠です。
   注意:DMSは非常に有毒で無色で、わずかに玉ねぎのような臭いがします。DMSを扱う際は極めて注意が必要です。蒸気の直接接触や吸入は、目、口、呼吸器の壊死を引き起こし、臓器への深刻な損傷を招くことがあります。保護ゴーグル、白衣、適切な手袋を着用してください。可能な限り二重手袋を使い、露出後またはDMS使用後すぐに手袋を交換してください。排気フードの下でDMSを使った手順を行ってください。DMS処理には専用の廃棄物容器を使いましょう。
3. 焼入れと洗浄
   1. 表1に記載されているように、事前に停止・洗浄バッファーを準備し、使用まで氷に置いてください。DMSのメチル化を止めるために、1mLのストップバッファーを追加します。
   2. DMSラベル付きサンプルを3,500 x g で5分間、予冷遠心分離機で回転させます。廃棄物は適切な廃棄物容器に捨ててください。
   3. ペレットに1mLの洗浄バッファーを加え、再懸浮します。ステップ3.3.2を繰り返します。直ちにRNA抽出に進め。酵母ペレットは冷凍しないでください。
4. フェノールクロロホルム抽出
   1. DMS標識された酵母を600μLのRNA溶解バッファーに再懸濁させ、その後、懸濁液を20% SDSの40μL入ったチューブに移します。65°Cで30秒間孵育し、950rpmで振る。
   2. 酵母溶解液に650μLの予温酸フェノール・クロロホルムを加え、65°Cで2分間加熱し、950rpmで振る。サンプルを5分間氷の上に置きます。
      注意:その間にヒートブロックやサーモミキサーは室温(RT)に切り替えてください。
   3. 遠心分離機は20,000 x g で3分間RTで加熱します。
   4. 最上層を新しいチューブに移し、クロロホルム650μLを加えます。ボルテックス、短時間。再び遠心分離機で、700μLのイソプロパノールを含む新しいチューブで上層を採取します。
   5. 逆回転させて混合し、-20°Cの冷凍庫で30分間培養し、RNAが沈殿するのを待つ。遠心分離機で20,000 x g で45分間、4°Cで加熱します。 上清液は捨てる。ペレットは75%エタノール(EtOH)750μLで洗浄します。
      注意:これはプロトコルの停止/一時停止点です。サンプルは75%のEtOHに浸かり、-80°Cの一晩放置できます。
   6. 20,000× g で3分間回転させ、上澄液を捨てます。RNAペレットを自然乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水81μLに溶かします。260 nmの波長に設定した分光光度計を使ってRNA収量を定量化します。上記のリサスペンションを1μL塗布して測定します。必要に応じてRNAサンプルを希釈してください。次のステップに進むには、少なくとも80μgのRNAが存在する必要があります。
      注意:必要に応じて、DMS標識RNAは-80°Cで最大2週間保存可能です。

4. 初期RNA(CoSTseq)

注:フェノール:クロロホルム抽出から得られる総RNAには、DMS標識成熟RNAおよび3つのポリメラーゼすべてから得られるDMS標識ビオチニル化新生RNAが含まれています。新生RNAを総RNAから精製するために、以下の手順でストレプタビジンビーズを用いてビオチニル化された新生RNAを濃縮します。ビオチンはストレプタビジンに対して強い親和性を持つため(K_d = ^10-14 - ^10-15 M)、2回連続したRNA試薬抽出(材料表参照)を行い、ストレプタビジンビーズからRNAを溶出します。成長条件¹⁶によりますが、酵母RNAのうち新生RNAは1%未満です。

1. ビオチンプルダウン
   1. ストレプタビジン磁性ビーズの調製
      1. 表1に示すように、予洗バッファーAと予洗バッファーBを準備します。ストレプタビジン磁性ビーズは渦を合わせて均質化します。80μgの総RNAを含む44μLの均質磁気ビーズをサンプルごとに取得します。
         注意:サンプル数を積んでスケールアップしてください。
      2. 磁気ビーズを磁気ラックに置き、保存液を取り出します。磁気ビーズを1mLの予洗バッファーAに再懸浮させます。
      3. 室温で2分間培養します。磁化して上清液を取り除きます。洗いを繰り返します。予洗剤Bを1mLで1回洗浄し、磁化して上清液を除去し、素早く結合と洗浄の工程に進みます。
   2. 製本と洗浄
      1. 表1に示すように、2倍結合バッファー、1倍結合バッファー、高塩、低塩の洗浄バッファーを準備します。
      2. 予洗いされたビーズを元の体積(88μL)の2倍の結合バッファーを加えて再懸浮します。80μLのビーズを、80μLのビオチン化RNAサンプルを含む無菌1.5mLチューブに移します。
      3. ビーズとサンプルの混合物を室温で回転させて20分間回転させます。成熟RNAを含む流路を磁気段階で収集します(沈殿段階に進みます)。
      4. ビーズ新生RNA複合体を高塩バッファー500μLで2回洗い流します。1x結合液500μLで1回の洗浄を行い、その後500μLの低塩バッファーで1回洗浄します。
2. RNA試薬抽出による洗脱
   1. サーモミキサーを60°Cまで予熱します。 20,000 x g から4 °Cの速度を達成できる遠心分離機を冷却します。
   2. ビーズ発生RNA複合体に300μLのRNA試薬(材料表参照)を加え、再懸濁します。サーモミキサーで60°Cに設定して5分間孵化します。
   3. クロロホルム60μLを加え、ボルテックスを加熱し、RTで3分間培養します。14,000 x g で5分間、予冷遠心分離機で回します。
   4. 上部水相を新しい集水管(~180μL)に移します。有機相は捨て、ビーズと残った水相を残します。
   5. 抽出を繰り返し、最終的な360μLの水相を収集チューブ内で得ます。
   6. クロロホルム360μLを収集チューブに加え、短時間ボルテージします。14,000 x g で5分間、予冷の遠心分離機で回します。
   7. 上層の約350μLを新しいチューブに移します。絶対EtOHを900μL、共沈殿剤1μLを加えてRNAを沈殿させます。
   8. 渦が一瞬起こり、-20°Cで20分間または夜間は-80°Cで降水が起こります。
   9. 予冷の遠心分離機で、20,000 x g で20分間遠心分離機を置きます。上澄液は慎重に捨てます。
   10. ペレットを750μLの75%EtOHで洗浄し、その後20,000 x g で5分間の冷間遠心分離を行います。
   11. 残留するEtOHを除去するためにペレットを10分間乾燥させます。RNAペレットを3.75μLのH_2Oに溶かします。
       注:溶出したRNAのドットブロットとストレプタビジン-HRP共役体によるプローブが、ビオチンプルダウンを評価する最も効果的な方法です。しかし、この方法はサンプルの大量を消費するため、ライブラリの準備に必要な材料が不足します。
3. 上清液の沈殿
   1. 成熟RNAを含む上澄液にEtOHを2.5〜3体加えて沈殿させます。降水は-20°Cで1時間待つ。
   2. 予冷遠心分離機で20,000 x gの圧力で45分間回転させます。上清液を慎重に吸引してください。
   3. RNAペレットは75%EtOHの0.5mLで洗浄します。ペレットを乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水50μLに溶かします。チューブを65°Cのヒートブロックに置き、RNAペレットの溶解を促進します。
   4. 次のステップでは分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。

5. 成熟RNA(DMS-MaPseq)

1. ポリアムA選択
   注:ポリアデニル化成熟RNAはオリゴ(dT)ビーズベースの親和捕獲を用いて精製されます。このプロトコルはDynabeads mRNA DIRECT精製キット(材料 表参照)を使用するよう最適化されています。初期調製として、ヌクレアーゼフリー水1mLを80°Cに予熱して洗脱し、ヒートブロックを70°Cに設定します。
   1. ポリAプルダウン用RNAの調製:沈殿RNA50μgを転移し、ヌクレアーゼフリー水で最終体積300μLまで増やします。RNAを70°Cで2分間加熱して二次構造を破壊し、すぐに氷の上に置きます。RNAを300μLの溶解/結合バッファーと混ぜて短時間ボルテックスします。
   2. 磁気ビーズの準備:少なくとも30秒の渦巻きで磁気ビーズを懸浮させます。1サンプルあたり100μLの懸浮ビーズを無菌1.5mLチューブに移します。磁化してストレージバッファを廃棄します。磁気ビーズを等量の溶解液と結合バッファーで洗い流し、磁化して上清液を捨てます。
   3. 製本と洗浄
      1. 100μLの洗浄ビーズを600μLの準備済みサンプルRNAに加えます。室温で5分間回転させ続けます。
      2. ビーズは磁気ラックに置いて集め、流れ抜けた部分を捨てます。ビーズを600μLの洗浄バッファーAで洗い、ピペットで混合します。
      3. 再びビーズを集めてウォッシュを捨てます。ビーズを300μLの洗浄バッファーBで洗い、ピペットで混ぜます。
      4. 再びビーズを集めてウォッシュを捨てます。ビーズを温かい水90μL(80°C)と混ぜ、90μLの溶解・結合バッファーを加えて結合させます。ステップ5.1.3.1-5.1.3.3を繰り返します。
   4. 洗脱:ビーズを温かい(80°C)のヌクレアーゼフリー水30μLに再懸浮させます。75°Cから80°Cで2分間培養します。ビーズを素早く磁場にさらし、RNaseフリーのチューブにイリュートを採取します。洗脱を繰り返し、溶出したRNAを回収します。
2. 断片化
   注:mRNAの断片化は酵素的または化学的手段のいずれかで達成可能です。ここでは、塩化亜鉛と熱を用いて断片化を行います。特定の配列や構造要素を必要とする酵素とは異なり、亜鉛イオンはルイス酸として2'酸素(求核剤)を活性化し、リン酸の骨格を切断します。これにより、生成物RNA鎖¹⁷に5' OHおよび2',3'環リン酸エステルが生成されます。
   1. 熱サイクラーを予熱し、ブロック温度を94°C、蓋温度を105°Cに設定します。 54μLの溶出mRNAをPCRチューブに入れます。
   2. 100 mMの塩化亜鉛溶液6 μL(最終濃度10 mM)を加え、2秒のボルテックスを加え、予熱した熱サイクル器で94°Cで55秒間培養します。
   3. インキュベーション終了時に、0.5 M EDTA(最終濃度50 mM)の6.6 μLで断片反応を焼き入れ、ピペットを上下に混ぜてから、素早くチューブを氷の上に置きます。内容物を無菌の1.5 mLチューブに移します。
   4. 断片化されたmRNAの沈殿を許可し、150μLのイソプロパノール、15μLの3M酢酸ナトリウム、pH5.2、1μLの共沈殿剤を加えます。
   5. -20°Cで30分間置きます。20,000 x g で45分間、予冷の遠心分離機で回します。ペレットを75%のEtOHで洗浄し、ヌクレアーゼフリー水15μLに溶かします。

6. テンプレートスイッチング逆転写反応

注:ビオチンプルダウン(ステップ4.2)およびPNK処理後のフラグメント化されたmRNA(ステップ5.3)は、ライブラリー調製のために以下の手順を踏みます( 図1 および 図2参照)。簡単に言うと、テンプレートスイッチングが可能な合成RNAテンプレート/DNAプライマースターターデュプレックス(R2 RNA/DNAヘテロデュプレックスアダプター)を準備します。このヘテロ二重配列は短い補完配列を提供し、逆転写酵素(RT)による鋳型スイッチングを可能にし、RTがRNAからDNAプライマーに鎖を切り替えることで、RNAからアダプター配列へのcDNA合成をシームレスに可能にします。ここではインデュロ逆転写酵素が使用されており、このプロトコルに合わせてテスト・最適化されています。必要に応じて、CoSTseqライブラリの準備には他のテンプレート切り替え逆転写酵素も使用できますが、ユーザーによる最適化が必要です。

1. DNA/RNAヘテロデュプレックスアダプター配列
   注:DMS-MaPseqサンプルの逆転写に使用されるDNA/RNAヘテロデュプレックスアダプターは、Xuら7に記載^され、 Schärfenら¹⁰によって参照されているものと同じです。
   1. CoSTseqサンプルの逆転写に使用されるDNA/RNAヘテロデュプレックスアダプターには、オーバーハング領域に「G」が付いたアダプターを使用します。これにより、GはRNAの3'端でビオチンCを捕捉できるようになります。異なるビオチニル化NTPを使用する場合は、ヘテロ二重DNAプライマーを編集して、適切なペアリングヌクレオチドをオーバーハングに設定します(表 2参照)。
   2. DMS-MaPseqアダプタの場合、3'端が断片化後にランダムになるため、1つのNオーバーハングがあることを必ず確認してください。以下のライブラリ準備ステップの概要については 図2を参照してください。
2. テンプレートスイッチング用のDNA/RNAハイブリッドの調製:10 mM Tris-HCl、pH 7.5、1 mM EDTAからなるバッファーに、1μMのR2 RNAおよびR2R DNAプライマーを準備します。プライマーミックスを82°Cで2分間孵化し、その後0.1°C/sの速度で25°Cまで冷却します。混合物を分割して冷凍し、後で使うために保存します。
3. テンプレート切り替え逆転写
   1. 以下の試薬を加え、室温で30分間インキュベートします:5x反応バッファー2 μL、1 μM DNA/RNAヘテロデュプレックス1 μL(CoSTseqサンプルは単Gオーバーハングを含むヘテロデュプレックスを使用、DMS-MaPseqサンプルはランダムNオーバーハングを含むヘテロデュプレックスを使用)、酵素0.5 μL、RNase阻害剤0.5 μL、RNAサンプル3.75 μL(または水を加えて7.75 μLの総体積を達成)。
   2. この混合物(dNTPなし)をRTで30分間培養します。次に反応に10 mM dNTPを1.25 μL加え、熱サイクラーで以下のサイクル条件を適用します:25°Cで10分、42°Cで10分、50°Cで10分、55°Cで10分、60°Cで30分、65°Cで20分、75°Cで15分。
   3. RNaseHを1μL加え、37°Cで20分間インキュベートします。PCR反応をカラムベースDNA精製法で精製し、残ったプライマー、ヌクレオチド、酵素を除去します。最終体積20μLを溶出します。

図2:CoSTseqライブラリ準備の詳細な回路図表現。ビオチン化3'末端を持つ新生RNAは、ビオチンCTPと相補的なGオーバーハングを含むテンプレートスイッチングアダプターでインキュベーションされます。断片化成熟RNA(DMS-MaPseq)には、Nオーバーハングを持つアダプターが使用されます(図1参照)。cDNA合成は、熱安定性のあるII族イントロン逆転写ターゼ(TGIRT)などの非常に過程的な逆転写ターゼを用いて行われ、その後RNase H処理でRNA鎖を分解します。その後、5' App DNA/RNAリガーゼがN₇ UMIリンカーのリボースアデニル化5'末端(rA^pp)を単鎖cDNAの3' OHに接続します。N₇ UMIアダプターにはブロックされた3′端が含まれており、アダプター間の自己連結を防ぎます。最後に、PCR増幅は、各サンプルに固有のIllumina i5およびi7バーコードを割り当てた重なり合う領域や5′オーバーハングを含むプライマーを用いて行われます。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

7. ペアエンドタグシーケンシング用の最終cDNAライブラリーの調製のための5'アダプターライゲーション

1. 5フィートエンドアダプターの準備
   1. 以下の反応成分とともに、RNAリガーゼベースの反応(例:Mth RNAリガーゼ、材料 表に記載)を用いて5'端アダプターをアデニル化します:8 μL 10×5'-DNAアデニル化反応バッファー、8 μL 1 mM ATP、100 μM R1R DNA(これは一意分子識別子またはUMIを含むTruSeqプライマー)、8 μL Mth RNAリガーゼ、 52μLのヌクレアーゼフリー水。
      注:N₇ UMIアダプター設計の詳細については、 表2 および 図2を参照してください。
   2. この反応を65°Cで1時間、その後85°Cで5分間培養します。製造元の指示に従い、EtOH沈殿またはシリカ膜スピンカラムベースのDNAクリーンアップ法によるcDNAの純化を行います。
   3. EtOH沈殿では、DNAを-20°C(最低20分)で、最終濃度0.3 Mおよび95%〜100%のコールドEtOHの2×2.5倍を用いて沈殿できます。EtOH沈殿反応を、4°Cの冷蔵分離機で最大速度で15分間遠心分離し、70%EtOHでペレットを洗浄し、再遠心分離機で自然乾燥させます。ペレットを40μLのヌクレアーゼフリー水に再懸浮(またはスピンカラム使用の場合は溶出)します。長期保存は-20°Cで行う。
2. 5'アダプターリゲーション
   1. 単一の20μL反応体積に対して、10μLのcDNAに以下の成分を加えます:10xNEバッファー12μL、50mMMnCl22μL、5' AppDNA/RNAリガーゼ2μL、ステップ7.1のアデニル化アダプター4μL10μM(100ng/μL)です。
   2. この反応を65°Cで1時間培養し、その後90°Cで3分間培養します。 minElute PCR精製キットで反応を洗浄し、最終量の20μLヌクレアーゼフリー水で洗出します。
3. パイロットテストによるcDNAライブラリーの最小限のPCR増幅
   1. 進める前に、固有のバーコードを含む10μMのインデックスプライマーを準備してください。各ユニークなCoSTseqまたはDMS-MaPseqサンプルには、スムーズな下流解析のために固有のバーコードが関連付けられるべきです。 表2のプライマー配列を参照してください。順方向および逆方向の個別のバーコード含有プライマーは1:1の混合で組み合わせてバーコードプリミックスとして保存できます。
   2. ステップ7.2のPCR産物2 μLを用いて、高忠実度PCRバッファー2.5 μL(例:市販HiFiバッファ)、dNTP 0.375 μL(10 mM)、バーコードプリミックス0.75 μL(または個別のi5およびi7のバーコードプライマー0.375 μL)、高忠実度ホットスタートDNAポリメラーゼ(例:市販HiFiホットスタート酵素)0.25 μLを加えます。 ヌクレアーゼフリー水6.625μL。
   3. この反応を95°Cで培養し、[98°Cで15秒、62°Cで30秒、72°Cで30秒]を23サイクル繰り返し、72°Cで1分間の培養で終了します。 最適なサイクル数を決めるために1%アガロースジェルで走ってください。
      注:低サイクル条件を試験するためには、低サイクルの終わり(例:15または16サイクル終了)にサンプルを準備し、アガロースゲル上で走査して、サイクル長を超えたcDNAライブラリースメアの強度を比較することができます。
4. ライブラリ増幅のための最終PCR
   1. ステップ7.2のPCR産物18 μLを用いて、KAPA HiFi PCRキットから以下のものを追加します:高忠実度PCRバッファ22.5 μL、dNTP 3.375 μL(10 mM)、バーコードプリミックス6.75 μL(または個別のi5およびi7のバーコーディングプライマー3.375 μL)、高忠実度ホットスタートDNAポリメラーゼ2.25 μL、ヌクレアーゼフリー水59.625 μL。
   2. この反応を95°Cでキュベートし、ステップ7.3で決定されたサイクル数に応じて[15秒98°C、30秒62°C、30秒72°C]を繰り返します。72°Cで1分間の潜伏で終了します。
5. サイズ選択
   1. 常磁性ビーズベースの精製(例:AMPure XPまたは同等品)を用いてPCR産物のサイズ選択を行います。ビーズの体積を1.3倍にします(例:50 μL PCR反応の場合は65 μLのビーズスラリーを使用)し、均一になるまでよく混ぜます。ビーズが常温で10分間サンプルを結合させます。
      注:この1:1.3倍のサンプル対ビーズ比率により、プライマーアダプターダイマーの除去が可能となり、保持されるDNA断片の量が150塩基p秒以下かつ800塩基錠を超えないことを保証します。
   2. ビーズを乱さずに上清液を取り除き、メーカーのプロトコルに従って80%EtOHでビーズを洗浄してください。
   3. 最終生成物を11μLで溶出。アガロースゲルに1μLを投与してライブラリーを検証します。最終成果物をシーケンスに提出してください。

8. データ分析

注:CoSTseqパッケージおよび解析コードの完全な内容はGitHub(https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq)で入手可能で、解析のワークフローは図3に示されています。このパイプラインはCoSTseqおよびDMS-MaPseqのシーケンスデータを処理するよう設計されています。CoSTseqはSnakemakeというバイオインフォマティクスワークフローを使用しており、利用可能なCPUコア数を¹⁹個に最適化することで分析を容易に並列化します。ワークフローはSnakefileによって定義されており、これは実行される分析を決定する一連のルールで構成されています。GitHubパッケージをインストールした際に利用可能なSnakefileを変更する必要はありません。

1. 設定ファイル(.yamlファイル)を正しいファイルパスで、生データが保存される場所に合わせて調整してください。これらの設定には、アダプターシーケンスへのパスと関連するサンプル名が含まれているべきです。設定ファイルを変更して、Snakefileで定義された特定の解析を実行するようにしてください。
2. 解析を開始するには、生のペアリングエンドリードをfastq.gz形式でダウンロードしてください。fastp²⁰ を用いてアダプタシーケンスをトリムし、Phredスコアが少なくとも20のリードに対して品質フィルターを処理します。これらのリードをSTAR²¹ を使って参照ゲノムにアライメントし、BAMファイルを生成します。
3. さらに確認として、統合ゲノムビューア(IGV)ブラウザでCoSTseq解析パイプラインを実行した後に生成されたBAMファイルを可視化してください。IGVを用いると、BAMファイルは対象遺伝子のすべての部分にわたるリードを容易に解釈可能にし、リードが新生RNAであることを示します。予想通り、成熟RNAリードは成熟した、かつ効率的にスプライシングされた転写産物から導出されるため、イントロニック領域でのカバレッジは最小限のはずです。
4. fastp出力(ウェブブラウザで開ける.htmlファイル)を使って、重複した読み取りの推定割合を算出してください。CoSTseqリードは非常に重複性が高いことがあり、次のステップの重要性を強調しています。
5. UMICollapse²²を用いて、同一のUMIやアラインメントを持つリードを倒すリードを重複解除し、ユニークなリードのみを保持し、PCRバイアスを軽減します。結果として得られるファイルは重複リードがなく、BAM形式であるべきです。ここではrRNAにアラインメントされたリードは非rRNA遺伝子に関連するリードと分離されます。
6. モジュール式CoSTseqパイプラインの最終主要コンポーネントとして、カスタムPython実装を使って各ヌクレオチドの突然変異数とカバレッジを計算します。この実装を説明する関数はGitHubのソースコードに記載されており、Snakefileには入力、出力、パラメータ、そしてこれらのデータを生成するための関数が詳細に記載されており、それらは.pkl形式で保存されています。
   注:CoSTseq解析パイプラインを用いて実行可能な他の多くの解析がありますが、個別化分析のニーズに応じてパラメータの最適化が必要な場合があります。CoSTseqに適応された有用な手法の一つにHDProbeがあります。これは変^異率のゲノム全体比較を可能にするRパッケージです。簡単に言えば、HDProbeはすべての複製株のデータを必要とし、対照群と比較して変異率の有意な差異を体系的に分類できます。他にも、実験的なDMS反応性に基づく構造予測など、実施したい分析の種類があります。これはRNA構造パッケージ²³を用いて行うことができます。

図3:モジュール型CoSTseq解析パイプラインの解析ステップと期待される出力。 分析のステップは、既存のツールの推奨利用と、期待される出力ファイルやコンテンツを含むCoSTseq解析パイプラインの利用を推奨します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

Results

このセクションでは、このプロトコルで説明されているCoSTseqワークフローと解析を実装することで生成される実際の結果を示します。まず、このセクションでは、シーケンシング前後の成功した図書館準備の質評価後の期待される成果について説明します。シーケンス前に、研究者はテストPCRおよびTapeStation解析を用いて、ビオチン濃縮後のRNAの存在を確認できます。これはCoSTseqライブラリーの準備中に新生RNAの成功した単離を示しています。シーケンス後のデータ品質評価は、リードカバレッジの目視検査や、後にカスタムPythonベースの解析を用いることで、下流解析のために十分かつ豊富なデータが利用可能であることを保証します。この段階で評価される主な特徴には、イントロン領域へのカバレッジ、重複リードの割合、ヌクレオチドあたりのシーケンス深度、平均リード長などがあります。これらの指標はデータセットの分析的境界を明確にし、結果の過剰解釈のリスクを減らします。次に、このセクションではいくつかの分析的アプローチの可能性を説明しています。例えば、DMS-MaPseqをCoSTseqと併...

Discussion

RNAは塩基対の速度が合成速度^24,25,26,27よりも速いため、共転写的に折りたたみ始めます。我々の新生RNAフォールディングに関する現在の知見は、原核生物RNAの単一分子研究、in vitroプロービング、またはin silicoアプローチから得られます。このプロトコルでは、CoSTseqの詳細なワークフローが示されています。この技術により、S. cerevisiae¹⁰におけるRNAポリメラーゼ位置に対する新生転写の共転写折りをin vivoで検出することが可能になります。ここでのプロトコルは、品質管理ステップに重点を置いたデータ分析の概要を提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10mM ATP	インビトロジェン	18330019
10mM ビオチン-11-CTP	イェナ・バイオサイエンス	NU-831-バイオオックス
10mM GTP	インビトロジェン	18332015
10mM UTP	インビトロジェン	18333013
10倍 NEBuffer 1	ニューイングランド・バイオラボ	B7001S	ステップ7.2.1での使用
10倍リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)	ギブコ	70011-044
SDS20%	RPI	L23100-500
酸性フェノール:クロロホルム	アンビオン	AM9722
サイズ選択用のAMPure XPビーズ	ベックマン・コールター	A63880	ステップ7.5.1のサイズ選択に使用されます
バクト・ペプトーン	ギブコ	211677
バクト酵母エキス	ギブコ	212750
ビシネ	シグマ・オルドリッチ	B3876-100G
クロロホルム	シグマ・オルドリッチ	319988
D-(+)-グルコース	シグマ・オルドリッチ	G5767-500G
ディフコアガー	BD DIFCO	214010
ジメチル硫酸塩	シグマ・オルドリッチ	D186309-5ML
ダイナビーズ&トレード;MyOneストレプタビジンC1ビーズ	インビトロジェン	65001	セクション4.1のビオチンプルダウンに使用されます
ダイナビーズ&トレード;mRNA DIRECT™浄化キット	インビトロジェン	61011	セクション5.1のPoly A選択に使用されます
EDTA、pH 8、0.5M	シグマ・オルドリッチ	03690-100ML
エタノール	シグマ・オルドリッチ	E7023-500ML
グリコブルー	インビトロジェン	AM9516	ステップ4.2.7および5.2.4で使用される共沈殿剤
インデューロ&レグ; 逆転写酵素	ニューイングランド・バイオラボ	M0681S	ステップ6.3.1で使用されたRT酵素
イソアミルアルコール	シグマ・オルドリッチ	W205710-1KG-K
イソプロパノール	JT-ベイカー	9084-05-01
KAPA HiFi ホットスタートPCRキット	ロッシュ	07958889001	PCR反応用に7.3.2および7.4.1で使用された高忠実度DNA Pol
塩化マグネシウム	シグマ・オルドリッチ	SLCM2154
MinElute PCR精製キット	キアゲン	28004	ステップ6.3.3および7.2.2でのDNAクリーンアップに使用されます
Mth RNAリガーゼ	ニューイングランド・バイオラボ	M2611A
オリゴ・クリーン&コンセントレーター	ザイモリサーチ	D4060	ステップ7.1.2でDNAオリゴのクリーンアップに推奨されています
酢酸カリウム	シグマ・オルドリッチ	236497-500G
塩化カリウム	JT・ベイカー	3040-01
水酸化カリウム	アヴァントール	6984-04-01
RNAクリーン&コンセントレーター-5	ザイモリサーチ	R1014	PNK治療後のステップ5.3.2で使用したRNAクリーンアップキット
RNaseOUT™組換えリボヌクレアーゼ阻害剤	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	10777019	PNK治療中のステップ5.3.1で使用されるRNase阻害剤
サルコシル	IBIサイエンティフィック	IB07080
酢酸ナトリウム	クオリティ・バイオロジカル	351-035-721
塩化ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	S5150-1L
水素ナトリウム	マクロン	7708-10
SUPERase·イン&トレード;RNase阻害剤(20 U/μL)	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	AM2696	ステップ6.3.1で使用されたRNase阻害剤
T4ポリヌクレオチドキナーゼ	ニューイングランド・バイオラボ	M0201S
熱安定性5フィートApp DNA/RNAリガーゼ	ニューイングランド・バイオラボ	M0319L
三塩酸、pH 7.4、1M	サーモ・サイエンティフィック	J60202。K2
トライトン X-100	テクノヴァ	T1105
TRIzol™試薬	インビトロジェン	15596-026	4.2節の初期RNA洗脱については、セクション4では「RNA試薬」とも呼ばれます
&β;-メルカプトエタノール	シグマ・オルドリッチ	M6250-1L