Method Article

サッカロマイセス・セレビジアにおける新生および成熟転写産物のRNA構造比較解析

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAの二次構造は主に成熟RNAで構造プローブ法を用いて観察されています。共転写構造追跡シーケンシング(CoSTseq)は、新生RNA上のポリメラーゼ位置の研究に用いられてきた核ランオンと構造プロービングを統合します。これにより、活性転写下のRNAのRNA二次構造の観察が可能になります。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

転写過程で、新生RNAはRNAポリメラーゼ(Pols)から抜け出し、塩基対を始めます。この塩基対により、RNA処理、翻訳、安定性のレベルで遺伝子発現に重要な影響を与えるRNA構造の形成が可能となります。RNAの二次構造を研究する確立された方法は成熟した転写産物に限られており、折りたたみ状態についてはほとんど知られていません。さらに、新生RNAの比較的低い存在比(<1%)と一時的な性質が、その分離や特徴付けを複雑にしています。共転写構造追跡(CoSTseq)は、ビオチンNTPおよびジメチル硫酸(DMS)プローブを用いた転写ランオンを活用し、新生転写産物のPol位置と塩基対の状態を同時に取得します。 Saccharomyces cerevisiaeでは、 CoSTseqは3つのRNAポルのいずれかによって転写される新生RNAの3'端付近の配列および構造情報を得ます。転写のランオン中、活性部位に組み込まれたビオチンNTPは効果的にPolsを停止させます。次に、DMSによるメチル酸処理で、未対になったA、C、Uのヌクレオチドを処理します。その後のビオチン濃縮と、テンプレート切り替えリバーストランスクリプトターゼを用いたcDNA合成により、ペアエンドシーケンシングとPol位置に基づくDMS反応の計算が可能になります。CoSTseqはDMSプロービング(DMS-MaPseq)と併用して容易に実施でき、折りたたまれた成熟転写本のキャプチャも可能にします。ここでは、転写ランオン、ライブラリ作成、データ解析を含む並列CoSTseqおよびDMS-MaPseqの詳細なプロトコルを提示します。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAはRNA分子内の塩基対により二次構造や三次構造に折りたたまれ、これらの構造はRNAの折りたたみを導くシャペロンとして働くタンパク質によってさらに影響を受けます。RNA構造は非常に動的であり、細胞RNAは熱力学的地形によって定義されるさまざまな構造に適合し、可能なRNA構造のアンサンブルを生成することができます2.動的な立体構造変化は遺伝子調節や発現に影響を与える可能性があります 3,4。逆に、RNAはtRNA、小さな核RNA、rRNAなど、その機能に密接に関連する非常に好まれる構造を採用することもあります。これらの例は強力な調節役割を持つ成熟RNAを強調する一方で、真核生物のRNA処理ステップは転写と同時進行することが多い。これにはプレmRNAスプライシング、3'端切断、RNA修飾などが含まれる。同様に、RNAの折りたたみは転写本の成熟前に起こることがあり、これは他の場所で議論されています。

RNA配列は二次構造をコードできますが、正確な決定にはしばしば in vitro または in vivoでの実験的検証が....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意:始める前に、表1に記載されているすべてのバッファが準備されていることを確認してください。すべての試薬はヌクレアーゼフリーの水で準備されるべきです。バッファーの除去剤は、分子生物学グレードの化学薬品や試薬を用いる場合、バッファーのろ過滅菌が推奨されます。セクション1から4については、事前に以下の準備をしてください。

1. 材料および試薬の調製

  1. 完全な溶解に十分な時間を確保できるよう、少なくとも1日前に10%サルコシル(v/v)溶液を準備してください。均質溶液を0.22μmフィルターでろ過滅菌します。実験当日は10%サルコシルを使って0.5%のサルコシル溶液を作り、使用まで氷に置いておきます。
  2. 超遠心分離機を4°Cまで予備冷却します。 フルームフード内でサーモミキサーを30°Cに設定し、2.5倍の構造プロービングバッファーのアリコートを予温します。このサーモミキサーは後にDMS処理に使用されます。
  3. フームフード内でヒートブロックを65°Cに設定し、1回の反応ごとに650μLの酸性フェノール(クロロホルム)を温めてRNA抽出を行います。
  4. DTTを2.5倍の転写バッファーと混合し、最終濃度2 mMにします。DMS処理後すぐに使用できるように、清焼液と洗浄液を新た....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このセクションでは、このプロトコルで説明されているCoSTseqワークフローと解析を実装することで生成される実際の結果を示します。まず、このセクションでは、シーケンシング前後の成功した図書館準備の質評価後の期待される成果について説明します。シーケンス前に、研究者はテストPCRおよびTapeStation解析を用いて、ビオチン濃縮後のRNAの存在を確認できます。これはCoSTseqライブラリーの準備中に新生RNAの成功した単離を示しています。シーケンス後のデータ品質評価は、リードカバレッジの目視検査や、後にカスタムPythonベースの解析を用いることで、下流解析のために十分かつ豊富なデータが利用可能であることを保証します。この段階で評価される主な特徴には、イントロン領域へのカバレッジ、重複リードの割合、ヌクレオチドあたりのシーケンス深度、平均リード長などがあります。これらの指標はデータセットの分析的境界を明確にし、結果の過剰解釈のリスクを減らします。次に、このセクションではいくつかの分析的アプローチの可能性を説明しています。例えば、DMS-MaPseqをCoSTseqと併.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAは塩基対の速度が合成速度24,25,26,27よりも速いため、共転写的に折りたたみ始めます。我々の新生RNAフォールディングに関する現在の知見は、原核生物RNAの単一分子研究、in vitroプロービング、またはin silicoアプローチから得られます。このプロトコルでは、CoSTseqの詳細なワークフローが示されています。この技術により、S. cerevisiae10におけるRNAポリメラーゼ位置に対する新生転写の共転写折りをin vivoで検出することが可能になります。ここでのプロトコルは、品質管理ステップに重点を置いたデータ分析の概要を提供します。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは何も明かすことはありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らはコーディングを担当してくれたSK Boopathy Jegathambal博士と、特にNeugebauer研究室のメンバー、特にP. Bechの有益な議論に感謝します。この研究は国立衛生研究所(NIH)からKMNへのR01GM112766およびアメリカ心臓協会の博士前フェローシップ(908949からLSへ)によって支援されました。LPSはNIHのトレーニング助成金5T32GM14943803によって支援を受けていました。LRABはアメリカ心臓協会からのポスドクフェローシップ(26POST1569544)によって支援されました。イェール大学ゲノム解析センターでのデータ取得は、国立衛生研究所一般医学科学研究所(NIH)の支援を受け、助成番号1S10OD03036301A1です。本研究は著者自身の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を代表するものではありません。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10mM ATPインビトロジェン18330019
10mM ビオチン-11-CTPイェナ・バイオサイエンスNU-831-バイオオックス
10mM GTPインビトロジェン18332015
10mM UTPインビトロジェン18333013
10倍 NEBuffer 1ニューイングランド・バイオラボB7001Sステップ7.2.1での使用
10倍リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)ギブコ70011-044
SDS20%RPI L23100-500
酸性フェノール:クロロホルム アンビオンAM9722
サイズ選択用のAMPure XPビーズベックマン・コールター A63880ステップ7.5.1のサイズ選択に使用されます
バクト・ペプトーンギブコ211677
バクト酵母エキスギブコ212750
ビシネシグマ・オルドリッチB3876-100G
クロロホルムシグマ・オルドリッチ319988
D-(+)-グルコースシグマ・オルドリッチG5767-500G
ディフコアガーBD DIFCO214010
ジメチル硫酸塩シグマ・オルドリッチD186309-5ML
ダイナビーズ&トレード;MyOneストレプタビジンC1ビーズ インビトロジェン65001セクション4.1のビオチンプルダウンに使用されます
ダイナビーズ&トレード;mRNA DIRECT™浄化キットインビトロジェン61011セクション5.1のPoly A選択に使用されます
EDTA、pH 8、0.5Mシグマ・オルドリッチ 03690-100ML
エタノールシグマ・オルドリッチE7023-500ML
グリコブルーインビトロジェンAM9516ステップ4.2.7および5.2.4で使用される共沈殿剤
インデューロ&レグ; 逆転写酵素ニューイングランド・バイオラボM0681Sステップ6.3.1で使用されたRT酵素
イソアミルアルコールシグマ・オルドリッチ W205710-1KG-K
イソプロパノールJT-ベイカー9084-05-01
KAPA HiFi ホットスタートPCRキット  ロッシュ07958889001PCR反応用に7.3.2および7.4.1で使用された高忠実度DNA Pol
塩化マグネシウムシグマ・オルドリッチSLCM2154
MinElute PCR精製キットキアゲン28004ステップ6.3.3および7.2.2でのDNAクリーンアップに使用されます
Mth RNAリガーゼニューイングランド・バイオラボM2611A
オリゴ・クリーン&コンセントレーターザイモリサーチD4060ステップ7.1.2でDNAオリゴのクリーンアップに推奨されています
酢酸カリウム シグマ・オルドリッチ236497-500G
塩化カリウムJT・ベイカー3040-01
水酸化カリウムアヴァントール6984-04-01
RNAクリーン&コンセントレーター-5ザイモリサーチR1014PNK治療後のステップ5.3.2で使用したRNAクリーンアップキット
RNaseOUT™組換えリボヌクレアーゼ阻害剤サーモフィッシャー・サイエンティフィック10777019PNK治療中のステップ5.3.1で使用されるRNase阻害剤
サルコシルIBIサイエンティフィックIB07080
酢酸ナトリウムクオリティ・バイオロジカル351-035-721
塩化ナトリウムシグマ・オルドリッチS5150-1L
水素ナトリウム マクロン7708-10
SUPERase·イン&トレード;RNase阻害剤(20 U/μL)サーモフィッシャー・サイエンティフィックAM2696ステップ6.3.1で使用されたRNase阻害剤
T4ポリヌクレオチドキナーゼニューイングランド・バイオラボM0201S
熱安定性5フィートApp DNA/RNAリガーゼニューイングランド・バイオラボM0319L
三塩酸、pH 7.4、1Mサーモ・サイエンティフィックJ60202。K2
トライトン X-100テクノヴァT1105
TRIzol™試薬インビトロジェン15596-0264.2節の初期RNA洗脱については、セクション4では「RNA試薬」とも呼ばれます
&β;-メルカプトエタノールシグマ・オルドリッチM6250-1L

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Fei, Y., Sun, L. Advances and opportunities in RNA structure experimental determination and computational modeling. Nature Methods. 19 (10), 1193-1207 (2022).
  2. Bonilla, S. L., Jones, A. N., Incarnato, D. Structural....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Structure AnalysisNascent RNA FoldingMature RNA StructureSaccharomyces CerevisiaeCo Transcriptional Structure TrackingDMS ProbingRNA Polymerase PositionBiotinylated RNATemplate SwitchingRNA Secondary Structure

Related Articles