半結紮、塩化鉄、トロンビンの組み合わせにより確立された重度脳静脈洞血栓症の新しいラットモデル

サマリー

重度脳静脈洞血栓症(CVST)の新しいラットモデルは、塩化鉄とトロンビンを半結紮して構築され、ヒトにおける重度CVSTの病態生理的メカニズムをより効果的に模倣できます。

要約

脳静脈洞血栓症(CVST)は、主に若い方、特に妊婦に影響を及ぼす独特のタイプの脳卒中です。CVST患者の約60%が静脈性脳梗塞または出血を発症し、これは重度のCVSTと定義されます。現在、動物モデルでCVSTを誘導するために国内外でさまざまな手法が用いられています。しかし、これらのモデルは重度のCVSTの病態生理学的メカニズムを完全に再現できていないため、この疾患に関する基礎研究は制限されています。重度CVSTの新しいラットモデルは、塩化鉄およびトロンビンと半結紮を組み合わせることで確立できます。半結紮は、パーフリュームススペックルイメージャー(PSI)を用いて、関心領域(SSS)の結紮前後の脳血流(ROI)を測定することで達成されました。SSSの半結紮は静脈洞内で血の静滞を誘発します。SSS表面に塩化鉄を局所的に塗布すると内皮損傷を引き起こし、副洞への直接注射は局所的な過凝固状態を作り出します。このアプローチは、血栓形成の3つの主要な要素であるスタシス、内皮損傷、凝固過性を効果的に模倣します。その結果、複数の静脈洞が同時に関与する大きな血栓性負担が示されます。誘発血栓は少なくとも1週間は安定しています。2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)染色は、このモデルが一貫して大面積の静脈性脳梗塞を引き起こし、最大7日間持続できることを示しています。このモデルは、従来のモデルでは達成できなかったラットのてんかん発作を誘発することさえ可能です。血液脳関門の破壊はエバンスブルー(EB)染色法で観察されました。したがって、半結紮と塩化鉄およびトロンビン投与を組み合わせて確立された重度CVSTモデルは、ヒトにおける重度CVSTの病態生理的進行をより正確に再現し、安定性と信頼性を示しています。

概要

脳静脈洞血栓症(CVST)は、動脈脳卒中とは異なる異なる脳血管障害の一種です。特に妊娠^{中の女性で}発生頻度が高く、近年発症率は着実に増加しています。オーストラリアで行われた疫学研究によると、CVSTの年間発生率は100万人あたり13.0件から15.7件の範囲であることが示^{されています4.}アメリカ合衆国では、CVSTの発症率は年齢とともに増加傾向を示しています。それでも、女性の発症ピーク年齢^{は男性に比べて}低い5。2021年から2023年の間に、アメリカ合衆国で救急外来を受診した患者のうち43人がCVST⁶と診断されました。臨床現場では、多発性洞血栓症が最も一般的に観察される形態であり、全症例の約57.14%を占めています。続いて上矢状静脈洞(SSS;16.19%)、横静脈洞(11.43%)、S状結腸洞(8.57^%)の関与が続きます4。主な臨床症状には、てんかんを伴うことがある頭痛、意識障害、局所^{神経症状7,8,9}が含まれます。しかし、これらの顕現は特定のものではありません。CVST患者の約60%が脳静脈梗塞または出血を発症し、これは重度のCVST^10,11に分類されます。CVSTの治療には抗凝固療法や外科的介入が含まれますが、重度CVSTの死亡率は依然として34.2^%と高いままです。この高い死亡率は、重度のCVSTの根本的な病態生理学的メカニズムがまだ完全には解明されていないことに起因している可能性があります。したがって、重度CVSTの適切な動物モデルは、その病因、病態生理進行、および潜在的な治療戦略を調査するための重要な実験ツール^です。

現在、CVST動物モデルの誘導方法は一般的に以下のタイプに分類できます:永久結合^13,14、化学的誘導15,16,17、介入的アプローチ^18,19、自作移植片の移植20,21,22、および双極電気凝固^23,24.従来の動物モデルで誘発された血栓は持続時間が短く、複数の静脈洞血栓と大面積静脈性脳梗塞を同時に誘発することができませんでした。したがって、複数の静脈洞を同時に関与する重度のCVSTモデルの開発が緊急の課題となっています。半結紮法と塩化鉄およびトロンビンを組み合わせることで、重度CVSTの新しいラットモデルを確立できます。さらに、この新しい重度CVSTモデルは、静脈洞血栓負荷、静脈性脳梗塞、血脳関門の破壊という3つの主要な側面を通じて、重度CVSTのヒト病態生理学的プロセスをより正確にシミュレートします。このモデルは重度CVSTの病態生理学的メカニズムおよび治療戦略の研究に応用可能です。この新しいラットモデルは将来的に重度のCVSTの病態生理学的メカニズムの調査に利用される可能性があります。

プロトコル

この実験プロトコルは中国北京の首都医科大学動物実験・実験動物福祉委員会(AEEI-2020-119)によって承認され、同機関の動物ケア・利用委員会の規則に準拠して実施されました。

1. 動物の調理

1. 平均体重300 ± 10gの健康な成年オスのSprague-Dawley(SD)ラットを、実験群または偽手術群のいずれかにランダムに割り当てます。すべての動物は、12時間交互に明暗を切り替え、 自由に食事と水を供給する形で管理されていました。

2. PSIの適用

1. PSIを用いて、モデリング過程を通じてラットのSSS内の脳血流(CBF)の変化を継続的に監視します。SSS内の固定された円形領域を関心領域(ROI)として選択します。手術中のROIのCBF変化をモニタリングすることで、半結紮の完了と血栓誘導の成功を判断します。

3. 重度CVSTラットモデルの確立

1. ラットには5%のエンフルランを使い、70%の亜酸化窒素と30%の酸素からなるガス混合物を麻酔マスクで投与します。手術中はエンフルラン濃度を1%〜2%の範囲内に保ちます。立体走位フレームを使って、麻酔を受けたラットを伏せの姿勢に置き、頭部を中央線に固定します。手術中はサーモスタット温熱パッドを使って、体温を37 ± 0.5°Cに保ちます。
2. ラットの頭蓋骨の中央線に沿って縦方向に1.5cmの切開を入れます。皮下組織を解剖して、下の頭蓋骨を露出させます。
3. 顕微鏡的可視化では、高速デンタルドリルを使ってブレグマとラムダの間に縦方向の頭蓋窓(10×4 mm)を作ります。硬膜の完全性を保ちつつ、SSSと両側の大脳皮質を露出させます。頭蓋ドリルの過程では、硬膜や皮質への熱損傷を防ぐため、通常の生理食塩水でドリルビットを継続的に冷却します。
4. SSSへの曝露後、PSIを用いてSSSのROIのCBFを評価し、対応するデータを記録します。SSSを前方と尾側で8-0で半結紮します顕微鏡観察下のポリアミド縫合。
   注意:SSS結紮時は、力は適度で過剰でないものが望ましいです。そうでなければ、半結合効果は達成できません。結紮は理想的には、単一の連続的な処置で行うべきです。繰り返しの結紮はSSSの穿孔を引き起こし、モデル製作の成功を妨げる可能性があります。
5. PSIを用いて、SSSの結紮区間にあるROIのCBFを評価し、半結紮前の約50%まで減少していることを確認します。結果を体系的に記録してください。
6. 遮光条件下では、長さ7mmの3-0シルク糸を40%の塩化鉄に浸し、SSSリゲーション部位の表面を5分間覆います。絹糸を外した後は、通常の生理食塩水で畑を洗いましょう。
7. 結紮部位の副鼻腔にマイクロインジェクターを用いて1分以内に0.1 mLのトロンビン溶液(500 U/mL)を注入します。注射をさらに2回連続で繰り返し、合計150 Uのトロンビン投与を行った。硬膜外腔へのトロンビン逆流は血栓形成の悪化にはつながらなかった。
   1. SSSへのトロンビン注入を容易にするために、挿入前にマイクロインジェクターの針を優しく曲げてください。この調整により、刺し穴時の針の角度をより正確に制御でき、SSSを誤って貫通するのを防ぐのに役立ちます。
8. トロンビン注射後にPSIを用いてROIのCBFを再評価してください。半結紮後と比べてCBFが有意に減少していることを確認し、血栓の誘導が成功したことを示すこと。データを体系的に記録し、さらなる分析のために活用しましょう。
9. 骨の窓を骨ワックスで封じ、その後切開部を縫合します。手術後、各ラットにケトプロフェン(5 mg/kg)を皮下投与し、術後の痛みを和らげます。
10. 偽手術グループでは、追加の外科的介入なしに開頭手術のみを行います。

4. 静脈洞血栓症負担および脳梗塞

1. モデル確立後1日、2日、7日の3つの時点で静脈洞血栓症の負担を評価します。生贄のラットを生け贄にし、異なるタイミングで正常生理食塩水を用いた心臓灌流を行います。
2. 静脈洞血栓症の関与程度を視覚的に評価するために開頭手術を実施してください。血栓を単離し、定量分析を受けてください。脳組織を切除し、厚さ2mmの冠状スライスに分割します。
3. スライスを2%TTC溶液に浸し、37°Cの水浴で20分間培養して染色を促します。その後、脳静脈梗塞を目視的に評価し、ImageJソフトウェアを使って梗塞量を定量化して統計解析を行います。
   梗塞容積 = 梗塞面積(平方mm×厚さ[2mm])

5. 血脳関門(BBB)の透過性の破壊

1. 手術後2日目に、モデル群と偽手術群の両方からランダムにラットを選び、尾部静脈に2%エバンスブルー(EB)を静脈注射します。
2. 注射が成功して2時間経ったら、ラットを安楽死させ、左心室にリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を灌流します。脳組織を採取し、厚さ2mmのスライスに分けてEBの浸透範囲を評価します。

6. 統計分析

1. SPSS 17.0ソフトウェアを用いて統計解析を行うこと。測定データを平均±標準偏差として提示します。グループ比較には一方向分散分析(ANOVA)または独立標本t検定を用いてください。
2. 同一グループ内の複数の時点で測定された連続変数の分析には、反復測定ANOVAを用いて時点間の違いを評価します。p値が0.05未満であれば統計的に有意とされました。

結果

モデリングプロセス
図1Aは矢印で示されるラットのSSSを示しています。SSSの前縁部と尾部部は半結紮され(図1B)、その後結紮部の表面に塩化鉄浸透糸を塗布しました(図1C)。その後、結紮されたセグメントにトロンビンを注射して血栓症を誘発しました。矢印で示された、トロンビンが注入された部分は黒くなっています(図1D)。図1E-Hの白い円はROIを示しています。図1Eでは、SSS曝露後のROIに強い赤血流信号が観察されました。図1Fでは、半結紮後のこの領域の血流信号が著しく低下しました...

ディスカッション

塩化鉄とトロンビンを組み合わせた半結紮による重度CVSTの新しいラットモデルは、静血や内皮損傷をシミュレートするだけでなく、血液の高凝固状態、すなわち血栓形成の3要素をシミュレート^します。さらに興味深いのは、この方法で開発されたラットモデルがてんかん発作を発作できることです。てんかん性てんかん発作はCVST患者における顕著な臨床症状であり、約12%から31.9%の症例で発生します。特に、皮質静脈血栓症および静脈性脳梗塞を伴う重度のCVST患者はてんかん発作のリスクが高まっています²⁶。したがって、ヒトCVSTの病態生理学的メカニズムにより近い位置にあります。

SSSの連結とトロンビン注射を組み合わせたモデルでは、Liらが述べたアプローチが非常に代表的と考えられています。この方法は、SSSの前後両節を永久に結紮し、その後洞内トロンビン注射および一時的な両側頸動脈閉塞を行うこと...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物	シグマ・オルドリッチ
40%塩化鉄	天津志遠化学試薬有限公司、中国
エヴァンス、ブルー	シグマ・オルドリッチ
温熱パッド	ハーバード・アパラタス・ホリストン、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国	50-7061-f,nbsp;
高速歯科用ドリル	韓国釜山市西信市	ストロング-207B
レーザースペックルメーター	スウェーデンのPeriCam PSIシステム
顕微鏡	カール・ツァイス社、ベルリン、ドイツ
ポリアミド縫合および	中国、寧波承和微小器材工場
立体定向フレーム	David Kopf Instruments、カリフォルニア州トゥフンガ、アメリカ合衆国
スロンビン	中国 長春雷雲尚製薬有限公司