紫外線硬化樹脂を用いた合成生体適合インプラントのクライオセクション化による免疫蛍光解析の強化

サマリー

本研究は、UV硬化可能な樹脂安定化を用いて、インプラントと組織の界面の完全性を維持しつつ抗原のアクセスを保つクライオセクティングプロトコルを提示し、合成ポリマーインプラントの信頼性が高く高解像度の免疫蛍光解析を可能にします。

要約

合成生体適合性インプラントの組織学的評価は、従来の組織処理方法とこれらの材料の物理化学的特性の不適合性により、重大な技術的課題を伴います。完全な樹脂埋め込みを用いた現在のアプローチは、十分な構造的保存を提供しますが、エピトープのアクセスを著しく損なうため、宿主免疫応答の特性評価に不可欠な免疫組織化学的応用が制限されています。逆に、従来のパラフィン埋め込みは合成基質への接着性が低く、包括的な免疫プロファイリングのための抗体選択を制限します。標準的なクリオセクシングプロトコルは抗原保存を改善することで免疫組織化学的適合性を高めます。しかし、これらの方法はしばしばインプラントを含む標本の構造的完全性を欠き、形態学的評価や切片の品質を損なうことがあります。これらの制約に対処するため、凍結解剖前にインプラント組織構造を選択的に安定化するためにUV硬化可能な樹脂を組み込んだ新しい処理プロトコルが開発されました。この手法は、光高合性樹脂を用いて機械的支援を提供しつつ、通常は完全な樹脂重合で損なわれるエピトープアクセスと抗原決定因子を維持します。このプロトコルにより、免疫蛍光評価に最適な厚さで高品質な断片の再現性が可能となり、従来の樹脂埋め込み試料における抗体浸透を制限する広範な架橋を伴わず、標準的な凍結切片よりも優れた構造保存を実現しています。このアプローチは合成インプラントの組織学的処理において実用的かつコスト効率の高い解決策であり、生体適合性評価のための分析能力を強化し、インプラントと組織の界面における局所免疫応答の詳細な特徴付けを促進します。

概要

免疫蛍光顕微鏡は再生医療研究において不可欠な分析技術であり、蛍光色体結合抗体を用いて組織構造や細胞組成の可視化を促進します。この手法は、免疫化学的認識の分子特異性と蛍光検出の感度と多様性を統合し、組織微小環境内の細胞標的分布を詳細に観察することを可能にします。免疫蛍光アプローチは直接的および間接的な標識戦略の両方を含み、間接免疫蛍光プロトコルは可視光および近赤外線スペクトルにわたる多様な蛍光分子に結合した二次抗体システムを通じて信号増幅を強化します^。この手法はスペクトル分離による同時多標的検出能力を備えており、複雑な組織微小環境内で多様な細胞集団およびそれらの空間的関係の包括的な表現型特徴解析を可能にします^。

免疫蛍光顕微鏡の技術的能力は従来のタンパク質局在化を超え、蛍光強度測定、共局在解析、細胞機能や^{組織組織の}理解に不可欠な空間分布評価などの定量的解析応用にも及びます。インプラント生体適合性研究の文脈では、免疫蛍光解析は、異物反応、炎症カスケード、細胞および^{分子レベルでの}インプラント受容または拒絶を決定する組織統合プロセスなど、宿主免疫応答に関する重要な洞察を提供します。

免疫蛍光プロトコルの成功裏の実装には、形態学的な完全性を維持しつつ蛍光信号を維持し、背景自己蛍光を最小限に抑える組織処理手法の慎重な検討が必要です。従来の埋め込み培地の選択は、組織の種類、下流の分析要件、そして関心のある特定の抗原に依存します。合成材料やインプラントに関しては、現在の文献では主にセクション作業中の構造安定性を維持するために完全な樹脂埋め込みを推奨^{しています。}しかし、この手法には重合樹脂ブロックの断片用に特殊なウルトラミクロトームやブレードが必要であり、多大な機器投資と技術的専門知識が必要となるため、大きな制約があります。パラフィン埋め込みは、切片のための十分な構造的サポートを提供する一方で、広範な脱水、化学硬化、有機溶媒による浸透を通じて、固定および処理中に抗原決定因子の立体構造変化をもたらし、タンパク質の変性やエピトープを覆い隠すことができる。パラフィン処理はまた、信号検出や定量解析を妨げる固有の自己蛍光干渉も生じさせます。これらの変化には抗原回収手法が必要であり、通常は熱誘発エピトープ回出(HIER)やプロテオリシス誘導エピトープ回出(PIER)が用いられ、抗体のアクセス性を回復^します。これらの介入にもかかわらず、市販されている多くの抗体はパラフィン埋め込み試料と互換性がなく、過酷な採取条件は蛍光信号の品質をさらに損ない、光漂白アーチファクトを引き起こす可能性があります。

クライオセクシングは免疫蛍光応用のための代替処理方法を提供します。組織調製には2つの凍結保存法が用いられます。最初の方法は、新鮮な組織標本を液体窒素で事前に冷却したイソペンタン浴に直接浸漬し、温度を-20°C以下に抑え、その後、温度制御された切断チャンバーを備えたクライオスタットマイクロトームを用いて断片を行うというものです。2つ目のプロトコルでは、プラホルマルデヒド(PFA)またはホルマリンでの短い固定期間を経て、その後段階的にショ糖浸透によるクライオプロテクションを経て凍結します。この凍結保存プロセスは、抗体認識に不可欠な天然タンパク質の構造を保ちつつ、組織の完全性を維持する剛性マトリックスを作り出します。凍結切片は、最小限の化学的修飾で組織をほぼ原生状態に保つ^{7により、}厳しい抗原回収手順の必要性を減らし、エピトープマスキングや変性によるパラフィン埋め込み組織と相容れない一次抗体を含むより幅広い一次抗体の使用^{を可能にします8。}

クライオセクショニングプロセスでは、最適切断温度(OCT)化合物が通常使用されます。OCTはポリビニルアルコールとポリエチレングリコールからなる水溶性埋め込み媒体で、セクション作成時に構造的サポートを提供しつつ、透明性を保ち、蛍光検出システムと互換性があります。OCT埋め込みは、特定の分析要件や^{組織特性に応じて}、厚さ5〜15μmの薄く均一な断片の生成を可能にします。凍結切片におけるネイティブタンパク質の立体構造の保存は、定量的免疫蛍光解析に不可欠な最適な信号対雑音比を維持しつつ、パラフィン埋め^{込み組織と}適合しないものを含む幅広い一次抗体の使用を可能にするエピトープを保持します8。

しかし、凍結組織切片は、特に自然生物組織と異なる物理化学的特性を持つ合成インプラント材料の処理において、独特の技術的課題を伴います。凍結中の合成ポリマーと生物組織界面間の熱膨張の差異により、局所的な機械的応力が生じ、構造の完全性が損なわれ、断面アーティファクトが生じる可能性があります^。さらに、多くの合成材料は凍結生物組織に比べて固有の剛性があるため、断面の断片のたわみを引き起こし、断面厚の不均一や試料および切断装置の損傷を引き起こすことがあります。これらの技術的制約により、インプラント含有標本の特有要件に対応しつつ、免疫蛍光応用における凍結切片の利点を維持するための専門的な処理プロトコルが必要です。

これらの制約に対処するため、本研究は選択的UV硬化樹脂安定化と制御されたクライオスタット切断パラメータを組み合わせたクライオセクシングプロトコルを開発し、高解像度で多パラメータの免疫蛍光解析をインプラント組織構造体に可能にしました。

プロトコル

本研究は、メイヨークリニック施設動物ケア・利用委員会(IACUC)のガイドラインに準拠して実施され、承認番号A00003765-18-24のもとで行われました。合成生体適合性インプラントを含むすべての処置は、適切なバイオセーフティプロトコルに従い、無菌条件下で実施されました。

1. 試料処理および低温保護

注意:ホルマリンは化学換気フード内でのみ取り扱い、適切な個人用防護具(PPE)を着用してください。ホルマリンには強力な刺激物、感作剤、発がん物質であるホルムアルデヒドが含まれているためです。

1. 組織統合型生体適合性インプラント標本を、10%中性緩衝ホルマリンに4°Cの一晩、組織体積に対して最低10量の固定剤を使用して、完全な浸水と十分な浸透を確保します。この限定された固定期間の目的は、組織の形態を保存しつつ架橋を最小限に抑えることです。(プロトコルで使用される材料 については「材料表 」を参照してください。)
2. 標本をリン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)で調製した15%ショ糖溶液に移し、4°Cで一晩穏やかに攪拌しながら培養します。組織沈下によって証明される完全なショ糖浸潤を確保しましょう。
3. 標本をPBS中の30%ショ糖溶液に移し、4°Cで2度目の一晩培養します。組織が容器底に沈み、完全な平衡を確認し、十分なショ糖浸透と水の置換を示します。
4. 30%ショ糖溶液とOCT化合物の1:1の体積比を準備します。この遷移培地で4°Cで2時間培養し、その後100%OCTに移して1時間完全に平衡状態にします。これは組織の均一不透明な外観によって示されます。
5. 試料を新鮮なOCT化合物で満たした標準的なクライオモールドに慎重に配置し、断面の最適な向きを確保します。インプラントと組織のインターフェースを後続の処置に備えて体を向きます。冷やした鉗子を使って気泡を取り除きましょう。
6. ドライアイスプラットフォームの上に充填されたクライオモールドをすぐに置き、下から上へと急速な氷結晶形成を促進する温度勾配を作ります。完全に固化するまで10〜15分間観察し、凍結したOCT化合物の特徴的な不透明な白色の外観で確認されます。凍結ブロックは–80°Cの保管室または直接クライオスタットチャンバーに移し、即時の区切を行います。

2. クライオスタットのセットアップと初期の区切り

1. クライオスタットの温度制御チャンバーは–15°Cに保ちます。統合デジタルモニタリングで温度を確認し、試料導入前に一晩平衡状態に保ちます。
2. 新しい使い捨てブレードを取り付けましょう。合成・生物材料の複合切断時の刃角はメーカーの仕様に従って設定します。
3. 所望の断面厚さ(50–100μm)は、コントロールパネルで厚さ設定を選択し、矢印キーで調整し、Setキーを押してパラメータを確認することでクライオスタットにプログラムされます。
4. 埋め込まれた標本を進み、インプラントと組織の接面に対応するあらかじめ決められた深さに到達します。組織の不透明度や初期のインプラント-末梢露出の微妙な変化が特徴となるUV樹脂塗布に最適な面を特定するために、進行する切面を監視し、これらの特徴が連続するトリム切片で一貫して見えることで深さが確認されます。
   注意:重要な界面に到達したら直ちに区画化を停止し、目標領域を超える進行を防げ。

3. UV硬化樹脂の応用

注意:UV硬化可能な樹脂は、適切なPPEを着用し、換気の良い場所で取り扱い、LED-UV硬化光から目や肌を保護してください。これらの樹脂には皮膚や目の反応を引き起こす刺激物が含まれており、LED-UV曝露は紫外線による目の損傷を引き起こす可能性があります。

1. はさみでパラフィルムを2〜3mmの寸法でインプラントの周囲を上回るまでカットします。保護用紙の裏側からは滅菌鉗子で慎重に切り離してください。
2. 露出したパラフィルム表面に5〜10μLのUV硬化樹脂を塗布します(図1A)。樹脂の体積は、段階的に量を分散し、その結果得られた広がりを目視的に評価することで最適化されます。これにより、試料表面の均一な被覆が保証され、過剰な樹脂蓄積が妨げられて断片を妨げることはありません。
3. 保護用紙の裏地は、樹脂充填パラフィルムの上にすぐに交換してください。ポリウレタン継ぎ目ローラー(2インチ)を一定の圧力で重なり平行にかけ、その後垂直に通すと薄く均一な樹脂層を作り出します(図1B)。
4. 保護用紙層を慎重に剥がし、均一に分布した樹脂フィルムが現れます。樹脂パラフィルムを露出したインプラント表面に直接配置し、インプラントと組織の界面との正確な整列を確保します(図1C)。
5. インプラントの中心から外側に向かってポリウレタン継ぎローラーを塗布し、気泡を除去し樹脂と合成・生物学的表面の密接な接触を確保します(図1D)。
6. 405nm波長のUV LED光源をインプラント表面に直接2〜3cmの距離に置きます。完全な重合を確実にするために90秒露光し、樹脂硬度と粘着性のない特性の触覚評価で検証されます(図1E)。樹脂硬化作業中に有害な紫外線曝光からオペレーターを保護するため、UV光重合前にクライオスタットチャンバーの窓にUV保護カバーを設置します。

4. 断面回収とスライド準備

1. 樹脂と組織の界面の機械的破壊を防ぐため、パラフィルムを単一の連続動作で除去します。樹脂の完全な密着性は、クライオスタット照明下で露出した表面の樹脂被覆の均一性、組織端での浮き上がりの欠如、目に見えるパラフィルム残留物の有無を確認することで確認されます。
2. 校正済みのミクロトーム推進機構を用いて、あらかじめ定められた8μm厚さに標本を切片します。各セクションの厚さが一定で、圧縮、断裂、不完全な断片などのアーティファクトがないかを監視してください。アンチロールプレートを最適な位置に配置し、カールを防ぎます(図1F)。
   注:親水性の正に帯電した接着ガラススライドが使用されるのは、難しい試料の保持力が向上し、切面移送およびその後の処理時の接着性を向上させるためです。セクション転送前にスライドを個別にラベル付けしてください。
3. スライド接着面を位置づけ、セクションの端で最初に接触し、その後全体にわたって徐々に接触します。UV硬化樹脂の表面がスライドに密着しつつ、組織表面は上向きに保ちつつ免疫蛍光を行うようにしてください(図1G)。
4. 気泡を取り除くためにセクションスライドアセンブリを優しく押します。クライオスタット照明下で正しい向きを確認し、インプラントと組織のインターフェースが無傷であることを確認してください。

5. 保管と保存

1. 完成したスライドは、72時間以内の処理が必要な用途のために、あらかじめラベル付き保管箱に-20°Cの温度で保管してください。
2. 保存期間は1週間を超えるため、80°Cの条件を利用しましょう。

6. 免疫蛍光染色プロトコル

注意:ペプシンは皮膚や呼吸器の刺激物であるため、適切な個人防護具(PPE)を着用してください。

1. スライドを保管から回収し、室温の平衡のために15〜20分間湿度チャンバーに移します。
2. 連続して2分間のPBS洗浄サイクルを3回行います。
3. 抗原回収:
   1. 熱誘起エピトープ回収法(HIER):1倍のターゲット回収溶液を搭載したマイクロ波安全容器内で水平スライド。電子レンジ(1000ワット出力)を高出力で15分間加熱し、その後室温まで冷却します。
   2. プロテオリティック誘導エピトープ回収法(PIER):各切片あたり100–150μLの即使用ペプシン溶液を塗布します。仮のプラスチックカバースリップで覆い、37°Cで加湿室で10分間孵化します。
4. PBS洗浄を3回連続で(各2分)行います。
5. PBSに0.1%サポニンと2.5%の通常のヤギ血清を含む1 mLのブロッキング溶液を塗布します。加湿チャンバーで室温で30分間孵化します。
6. PBS洗浄を3回連続で(各2分)行います。
7. 最適化濃度の100μL一次抗体溶液を適用します:
   1. 抗コラーゲンIVウサギ用ポリクローナルを1:100の希釈で使用。
   2. 1:500希釈の抗ラミニンウサギポリクローナル。
   3. 抗F4/80ウサギモノクローナル抗体を1:500希釈で投与しました。
8. 仮設のプラスチックカバースリップで覆い、4°Cの加湿室で一晩培養します。
9. PBS洗浄サイクルを3回(各2分)行います。
10. 10 μg/mL濃度の二次抗体を適用します。
    1. ドンキーアンチラビット IgG Alexa フルアフレックス 555
    2. ヤギ抗ウサギ IgG Alexa フルオ 488
11. 暗い環境で室温で60分間孵育します。
12. 任意の小麦胚物凝集素(WGA)染色:
    1. WGA-Alexa Fluor 647をPBSに5 μg/mLで、2.5%の通常のヤギ血清と共に塗布します。
    2. 蓋を覆い、37°Cで30分間培養します。連続して2分間のPBS洗浄サイクルを3回行います。
13. 各セクションごとに80μLのハードセッティング用マウンティングメディアを核酸化染色剤で塗布します。
14. カバースリップをカバーガラスで覆い、気泡を除去します。
15. スライドは室温で2時間、暗闇で水平に硬化させます。
16. 最適な画像品質のために、最大4°Cで保存してください。

7. 蛍光顕微鏡および画像取得

1. 逆蛍光顕微鏡を用いて、メーカーのフィルターセット(360/460 nm励起/発光、470/525 nm励起/発光、545/605 nm励起/発出、620/700 nm励起/発出)を用いてイメージングを行います。
2. 画像は顕微鏡ソフトウェアの フィルター メニュー内の各蛍光チャネルを選択して撮影します。露出最適化の前に、各チャンネルの正確な基準補正を確保するために 「ブラックバランス調整」 を選択することでブラックバランス手順が行われます。露出パラメータは、 画像キャプチャ ウィンドウを開き、 ライブ モードを有効にし、 露出 と 光強度 の調整を行い、ピクセル飽和なしで高い信号対雑音比を実現することで最適化されます。彩度はソフトウェアの ヒストグラム 表示と ハイライトサチュレーション ピクセルツールで監視されます。各チャンネルは画像取得前に独立して調整されます。
3. 隣接するフィールド間でメーカーの10%の重複を前提に自動タイル取得を行います。取得シーケンス全体を通じて自動フォーカス調整を維持しましょう。

結果

セクション品質評価と最適化
UV樹脂安定化と8μm厚さでの断片処理後、接着スライドに断片を収集し、品質管理の評価を行います。高品質な切片は、亀裂や破砕状の遺物がなく、連続した組織構造とインプラント-組織界面が保存されている形態を示します(図2A)。樹脂で安定化されたインプラント表面からの骨折や組織分離など、重大な構造的損傷を示す切片はさらなる解析から除外されます(図2B)。特に、UV硬化樹脂の塗布はOCTブロックを損なわず、ブロックの全深部にわたって均一な厚さの連続断片が確実に得られたため、樹脂の浸透やUV硬化が切断品質に悪影響を及ぼさないことを示しています。その後の免疫蛍光染色プロトコルのために品質基準を満たす切片を保持します。

検体タイプを通じた免疫蛍光染色の性能
免疫蛍光染色は、マウス皮下組織を含むインプラントや...

ディスカッション

このUV硬化可能な樹脂安定化法は、標準的な凍結切片技術では処理が難しい合成材料を含むOCT埋め込み組織標本のクライオセクションの代替アプローチを提供します。チャージングスライド、組織接着テープ、その他の接着式サポート材など、組織切片や脆弱なサンプルの取り扱い防止に役立てる接着剤が存在しますが、これらの製品はスライド接着を提供し、切断時に必要なインプラントと組織の接合部に必要な機械的補強力を提供しません。さらに、現在、生物標本に直接薄く均一に塗布してクリオセクティング中の構造安定性を向上させるための拡散可能なUV硬化樹脂は存在しません。この文脈で、ここで提示するUV硬化可能樹脂プロトコルは、凍結処理を必要とする抗体に対してエピトープアクセスを維持しつつ、標的的を絞った機械的支援を提供することで方法論的なギャップを埋め、合成高分子成分を含む試料の信頼性の高い切片を可能にします¹¹。

いくつかの手続き要素は、成功裏に実施するために注意が必要です。樹脂選択は、セクション加工時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5Wグースネック紫外線ライト395–樹脂硬化用405nm	アマゾン	UPC & lrm;603335835561
抗体 - 抗F4/80(モノクローナル)	アブカム	AB300421	1:500
抗体 - コラーゲンIV(ポリクローナル)	アブカム	AB6586	1:100
抗体 - ドンキー抗ウサギ IgG AlexaFluor Plus 555	インビトロジェン	A32794	10 μg/mL
抗体 - ヤギ抗ウサギ用IgG AlexaFluor 488	インビトロジェン	A-11008	10 μg/mL
抗体 - ラミニン(多クローナル)	インビトロジェン	PA1-16730	1:500
バイオメッドクリア	Formlabs	FLBMCL01	生体適合性材料 #1
BioMed 耐久性	Formlabs	FLBMDU01	生体適合性材料#2
バッファリング10%ホルマリン	カーディナル・ヘルス	C4320-101
BZ-XフィルターCy5	キーエンス	OP-87766	フィルターセット
BZ-XフィルターDAPI	キーエンス	OP-87762	フィルターセット
BZ-XフィルターGFP	キーエンス	OP-87763	フィルターセット
BZ-Xフィルター TRITC	キーエンス	OP-87764	フィルターセット
BZ-X800アナライザーソフトウェア	キーエンス	BZ-X800	統合ソフトウェア
フィッシャーブランドプレミアムカバーガラス 50 x 24 mm	フィッシャー・サイエンティフィック	12-544-14
Form4B 3Dプリンター	フォームラボ	F4Bプリンター
Form4レジンタンク	Formlabs	RT-F4-01
ヤギ血清	ギブコ	16210064
HM525 NX クライオスタット	エプレディア	956641EC
家庭用電子レンジ	パナソニック	NN-S766BA	1000ワット出力
IHC-Tek プラスチックカバースリップ 24 mm x 60 mm	IHCワールド	IW-2601	一時的なカバースリップ
JDiction 低粘度UV樹脂	アマゾン	6974143904430	高い自己蛍光
キーエンス BZ-X800	キーエンス	BZ-X800
レジンUVレジンクリアハードタイプ	アマゾン	ALR00038	高い自己蛍光
レジンクリアUV高粘度タイプ	アマゾン	ALR00048
松波MASマイクロスライドガラススライド	ニューカマー・サプライ	SUMAS1190	接着スライド
メドポル外科用インプラント	ストライカー	8662	生体適合性材料#3
ミスター・レジン UV レジン クリスタルクリア	アマゾン	B08FRF9QTB	高い自己蛍光
MX35 ウルトラミクロトームブレード	エプレディア	3053835
パラフィルムMラボラトリーフィルム	パラフィルム	P7543-1EA
ペプシン	シグマ	R2283-15ML
リン酸塩緩衝塩水pH 7.4	シグマ	P3813
プラン・アポ&ラムダ;40倍	キーエンス	BZ-PA40	対物レンズ
プラン・アポ&ラムダ;4X	キーエンス	BZ-PA04	対物レンズ
ポリウレタン継ぎ目ローラー	アマゾン	682698799567
ProLong ガラスアンチフェードマウント(NucBlueステイン付き)	インビトロジェン	P36985	ホエシュト33342カウンターステイン
サポニン	ミリポール	558255-100GM
ステイントレイ	インポート	M920-2
滅菌シリコーンシート	ベンテック	PR72034-51N
標的回収溶液、シトレートpH6	アジレント	S236984-2
組織技術O.C.T化合物	さくら	4583
小麦胚凝集素AlexaFluor 647	インビトロジェン	W32466	5 ug/mL