人間の皮膚におけるリンパ管の三次元可視化とリンパ浮腫時の構造変化

サマリー

ここでは、3つの異なる組織クリアリング技術を適用した後、共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡を用いてヒト皮膚のリンパ管構造を三次元的に可視化しました。これらの方法と免疫組織化学的染色を組み合わせることで、リンパ浮腫の進行過程におけるリンパ管の機能的変化についての洞察が得られます。

要約

皮膚のリンパ管は毛細血管と集積管から成り、老廃物の除去や免疫応答に重要な役割を果たし、組織の恒常性維持に不可欠です。しかし、人間の皮膚は表皮、真皮、皮下脂肪の三層からなり、コラーゲンが豊富な高密度な細胞外マトリックスを含んでいるため、リンパネットワークを三次元で可視化するのは困難です。この制約に対処するため、本論文では、組織クリアリング試薬と共焦点または光シート顕微鏡を組み合わせてヒト皮膚リンパを三次元可視化するための、関心分子や実験目的に合わせた3つの異なる手法を紹介します。リンパ内皮細胞の付着接合分子を免疫組織化学的に標的化することで、特に特徴的なボタンからジッパー状の毛細血管接合部への再構築など、明確な機能的変化を二次性リンパ浮腫患者由来の皮膚組織で評価しました。この三次元可視化技術は、従来の組織学的組織解剖では識別できない血管構造を明らかにし、リンパ管の構造と機能の理解を深めます。

概要

リンパ管の機能への関心は、がん転移における既に確立された関与を超えて皮膚の恒常性維持に果たす役割が認識されて以来、高まっています^1,2。リンパ管は構造的に毛細血管と集合血管に分かれており、それぞれ異なる特徴を持っています。リンパ毛細血管はリンパ内皮細胞によって形成される単層構造で構成され、間質液、老廃物、免疫細胞の初期集積場所として機能します。対照的に、集合型リンパ管は二層構造を持ち、平滑筋細胞がリンパ内皮層を囲むため、毛細血管ネットワークによって集められたリンパ液を中心循環へと能動的に輸送^{できます。}マウスモデルは特に気管支リンパ管の構造的特徴を解明するために用いられ、炎症状態が構造的再構築を引き起こす様子を明らかにしました^。過去の研究では、紫外線誘発炎症がリンパ毛細血管の異常な拡張を引き起こし、それが液体収集機能を損なうことが示されています。この機能障害の分子メカニズムが特定され、VEGF-A発現の増加とVEGF-C発現の低下がこれらの構造的変化を引き起こすことが示^{されました。}

三次元可視化技術により^{マウスモデルの}リンパネットワークの理解は大きく進み^{ましたが、}人間のリンパ管の構造解析は依然として困難です。この分析上のギャップは、ヒト組織を扱う際の困難さ、サンプルの入手可能性の限界、包括的な三次元イメージングの技術的な課題に起因しています。特に、表皮、真皮、皮下脂肪からなる三層構造を持ち、外部環境とのバリアとして機能する皮膚は、他の軟性器官よりも大きな課題をもたらします。さらに、人間の皮膚はマウスモデルと比べて組織の厚みが大きいなど、解析上の明確な課題を抱え、深部画像の浸透を妨げます。さらに、豊富な細胞外マトリックス成分、特にコラーゲンとその加齢に伴う構造変化は、マウスのリンパ画像診断に革命をもたらした新興組織クリア技術の有効性を低下させる光学的障壁を形成^します。

様々な組織クリアリング剤が以前にヒトの皮膚毛細血管を可視化するために試験されており、その組織適合性が示されました¹¹。その後、組織クリアリング試薬が用いられ、ヒト皮膚リンパ管を三次元で可視化することに^{成功しました。}リンパ内皮細胞の接着接合部に焦点を当てることで、リンパ浮腫の進行に伴うリンパ管の構造変化が特定されました¹³。本記事の目的は、3つの皮膚クリアリング技術、共焦点顕微鏡、ライトシート顕微鏡、免疫組織化学的染色を組み合わせて、ヒト皮膚リンパ管の三次元可視化手順を詳細に記述することです。本研究では、切除当日に固定され凍結融解サイクルを経ていない新鮮な人間の皮膚組織のみに焦点を当てていますが、これらの技術は疾患や加齢におけるリンパ管の構造変化だけでなく、それに伴う機能的変化についても洞察を提供します。

プロトコル

ヒト被験者の皮膚サンプルは千葉大学病院(日本千葉県)から採取されました。ヒト被験者を含むすべての手技は、千葉大学附属病院および資生堂グローバルイノベーションセンターの機関審査委員会によって承認され、被験者全員に書面によるインフォームドコンセントが提供されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 人間の皮膚サンプルの前処理

1. 採取時に切除された標本の皮下組織を除去します。
   注:皮膚切除と獲得の間の間隔はおよそhでした。輸送中、組織はDMEMに浸され、氷嚢で保管されました。
2. 表皮側が下に向いた状態で、表皮と真皮を分離するために60°Cのホットプレートに45秒置きます。
3. すぐに標本を氷のように冷たいPBSに浸してください。
4. ピンセットで表皮と真皮を分けてください。
5. 真皮部分を4%パラホルムアルデヒドで4°Cで16時間固定し、使用前にPBSで洗い流します。
   注:固定後、サンプルはPBSで4°Cで保存され、免疫染色の手順は数か月以内に開始されました。
   注意:PFA溶液は有毒です。すべての準備と取り扱いは、適切な個人用防護具を着用したまま、排気フード内で行われなければなりません。

2. クリアリング試薬と組み合わせた全マウント免疫染色

1. iDISCO技術
   1. 標本はおよそ5mm×5mm×5mmにトリミングします。
   2. 試料を5%トリトンX-100と2.5%トゥイーン20インチPBSに、軌道シェーカーで50rpm、24°Cで16時間浸漬して透過化します。
   3. 標本をPBSで24°Cで1時間洗い、このプロセスを3回繰り返します。
   4. 試料を新たに調製したブロッキングバッファーA(1% BSA、0.1% トゥイーン20、0.03%ナトリウムアジドをPBSで含めて)に、軌道シェーカーで50rpm、24°Cで72時間浸漬します。
   5. 標本をポドプラニンに対する一次抗体(1:100)とともに、軌道シェーカーでブロッキングバッファーAを72時間、50rpm、37°Cで72時間培養します。
   6. 洗剤A(PBS中の0.1%トゥイーン-20)で24°Cで1時間洗浄し、このプロセスを3回繰り返します。その後、試料を4°Cで50rpmに設定した軌道シェーカーの洗浄バッファーAに72時間保持します。
   7. 標本をAlexaフルオ67に結合したマウスIgG(1:1000)を、軌道シェーカーのブロッキングバッファーAで72時間、50rpm、37°Cで培養します。
   8. ステップ1.6を繰り返します。
   9. 標本を50%MeOHで24°Cで3時間培養します。
   10. 標本を70%のMeOHで24°Cで3時間孵化します。
   11. 標本を100%MeOHで24°Cで16時間孵化します。
   12. 標本を24°Cで15分間培養し、このプロセスを2回繰り返します。
   13. 標本をジベンジルエーテルで24°Cで16時間洗浄します。
       注意:この時点で組織が透明化していなければ、これ以上待っても大きな改善は見られません。
   14. ライトシート顕微鏡で標本の画像を撮影します。
       注意:EC Plan-Neofluar 5×/0.16の対物レンズ付きのライトシートを使用してください。照明(励起)を63 nm、検出を648 nmに設定;ステップサイズが5.8μmのZスタックを取得します。
       注意:メタノール、ジクロロメタン、ジベンジルエーテルは危険です。すべての準備と取り扱いは、適切な個人用防護具を着用したまま、排気フード内で行われなければなりません。
2. ラピクリア1.52試薬
   1. 標本はおよそ5mm×5mm×2mmにトリミングします。
   2. 試料を軌道セイカーで2%トリトンX100 PBSに移し、24°Cで50rpmに設定し、16時間透過化します。
   3. 標本を新たに準備したブロッキングバッファーB(5%ロバ血清、1%トリトンX100 PBS)に、軌道シェーカーで50rpm、4°Cで16時間浸漬します。
   4. 標本をポドプラニンおよびVE-カデリンに対する一次抗体(いずれも1:100)と共に、軌道シェーカーで50rpm、4°Cで設定したブロッキングバッファーBで72時間培養します。
   5. 試料を洗うバッファーB(3% NaClおよび0.2% Triton-X 100 in PBS)を24°Cで1時間洗浄し、このプロセスを3回繰り返します。その後、試料を洗浄バッファーBに置き、軌道シェーカーで50rpm、4°Cに設定されて16時間保持します。
   6. 標本をPBSで24°Cで1時間洗います。
   7. 標本を、マウスのIgGおよびウサギのIgGに対する二次抗体(それぞれAlexa Fluor 647および568に接合し、いずれも1:1000)を、軌道シェーカーでブロッキングバッファーB(50rpm、4°C、4°C)で16時間インキュベートします。
   8. ステップ1.5を繰り返します。そして1.6。
   9. サンプルはRapiclear 1.52の少なくとも5倍の体積で24°Cで16時間クリアします。
      注:組織の末梢領域の除去は1時間未満で観察されました。
   10. クリアした標本を、新鮮なRapiclear 1.52試薬を塗ったカバースリップの上に置いたポリジメチルシロキサンゲルチャンバーに埋め込みます。
   11. 標本を共焦点顕微鏡で画像化してください。
       注意:Plan-Apochromat 10×/0.45 M27対物レンズを持つ共焦点顕微鏡を使用してください。励起を633nmおよび561nm、検出範囲641〜754nmおよび566〜628nmに設定し、GaAsP検出器を用います。ステップサイズ3.15μmのZスタックを取得します。
3. 立方体技法
   1. 標本のサイズはおよそ5mm×5mm×3mmにトリミングします。
   2. 標本を50% CUBIC-Lに24°Cで24時間浸漬し、脱脂の前処理として行います。
   3. 試料を100%CUBIC-Lに、軌道シェーカーで50rpm、37°Cに設定されて7日間移し、脱脂処理を行います。
   4. 標本は室温でPBSで24時間洗い流してください。
   5. 試料を新たに準備したブロッキングバッファーAに、軌道シェーカーで50rpm、24°Cに設定されて72時間浸けます。
   6. 標本をVE-カデリン、ポドプラニン、CD31に対する一次抗体(それぞれ1:100、1:100、1:200)を、軌道シェーカー50rpm・37°Cに設定されたブロッキングバッファーAで72時間キュベークします。
   7. 標本を洗剤Aで24°Cで1時間洗浄します。このプロセスを3回繰り返し、試料を軌道シェーカーの洗浄バッファーAに72時間、50rpm、4°Cで維持します。
   8. 標本を、マウスのIgG、ウサギのIgG、羊のIgGに対する二次抗体(それぞれAlexa Fluor 647、568、488に接合して1:1000)を、軌道シェーカーのブロッキングバッファーAで72時間培養します。これらはAlexa Fluor 647、568、488に接合しています。
   9. ステップ3.7を繰り返します。
   10. 標本を50% CUBIC-R+(M)、24°Cで16時間かけて事前にクリアします。
   11. 標本を100%CUBIC-R+(M)で24°Cで16時間洗浄します。
       注意:この時点で組織が透明化していなければ、これ以上待っても大きな改善は見られません。
   12. 標本を共焦点顕微鏡で画像化してください。
       注意:Plan-Apochromat 20×/0.8 M27対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用してください。励起を633 nm、561 nm、488 nmに設定し、検出範囲は641-754 nm、566-628 nm、479-550 nmに設定し、GaAsP検出器を用います。ステップサイズが0.78μmのZスタックを取得します。

結果

表皮有無の透明化された人間の皮膚組織の光透過率の違い
図1は、Rapiclear 1.52試薬による透過化とクリアリング後の表皮有無のヒト皮膚標本の代表的な写真を示しています。表皮除去は、強力な光吸収因子であるメラニンを除去することで組織の透明度を高めます。これはサンプルの下にある黒い線の視認性が向上していることが証明されています。

ヒト皮膚のリンパ管の三次元マクロスケール可視化
iDISCO技術を用いた組織クリアリングとライトシート顕微鏡を組み合わせることで、主要なリンパ管マーカーであるポドプラニンの免疫染色により、ヒト皮膚組織におけるリンパ管の三次元マクロ可視化が可能^{になりました(}図2)。この方法は詳細な構造的特徴ではなく、リンパネットワーク全体の構造に関する包括的...

ディスカッション

生体組織におけるリンパネットワークの三次元可視化は、その構造的特徴や生理機能、さらには病理学的変化を理解する上で極めて重要です。このプロトコルは、ヒトの皮膚組織に最適化された3つの異なる組織クリアリング方法を提示し、それぞれが特定の観察目的に合わせて調整されています。

表皮除去はメラニン除去の重要なステップと考えられており、メラニンは組織の透明度を低下させ組織学的評価を妨げ^ます。これに一致して、iDISCO法を用いた表皮を保った人間の皮膚サンプルの免疫染色では、特に表皮のすぐ下で弱い信号が見られ、抗体の浸透や表皮側からのレーザー透過が妨げられていることを示唆しました。さらに、このプロトコルでは表皮を除去するために短時間の熱刺激が用いられました。この方法は、ディスパース²⁰を用いた酵素法よりも皮膚組織構造や細胞膜タンパク質へのダメージが少ないと考えられています。

本...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗CD31抗体	R&Dシステムズ	AF806	1:200での希釈
抗ポドプラニン抗体	ダコ	M3619	1:100での希釈
抗VE-カデリン抗体	細胞シグナル伝達技術	#2500	1:100での希釈
立方体L	東京化学工業	T3740
立方次元+(M)	東京化学工業	T3741
DMEM、低血糖、ピルビン酸	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	11885084
ロバ抗マウスIgG(H+L)高交差吸着セカンダリ抗体、Alexa fluor 647	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A-31571	1:1000での希釈
ドンキー抗ウサギIgG(H+L)高度交差吸着二次抗体、Alexa fluor 568	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A10042	1:1000での希釈
ドンキー抗羊IgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	A-11015	1:1000での希釈
ラピクリア 1.52	スンジン研究所	RC152001
ツァイスライトシートZ.1顕微鏡	カール・ツァイス
ZEISS LSM 880 共焦点レーザー走査顕微鏡	カール・ツァイス