単一分子FRETアッセイにより、細菌のsRNAとmRNA間のHfq介在のアニーリングを定量的に解析し、相互作用の速度論と安定性の測定が可能です。代表的な結果は、種子長、Hfq結合モチーフ、モチーフ間隔がRNA二重形成にどのように影響するかを示しています。
この記事について
サマリー
要約
細菌の小RNA(sRNA)とそのmRNA標的との間のアニーリングを制御するルールを定義することは、これらのRNAが配列や構造が非常に異質であるため、困難です。個々の特徴の寄与を解き明かすために、種子の強さ、Hfq結合モチーフ、それらの間隔など主要な決定因子を体系的に変化させました。これらの特徴がsRNA-mRNA二重安定性に与える影響は、単一分子フェルスター共鳴エネルギー伝達(smFRET)を用いて検証されました。これはミリ秒単位の時間スケールで個々のRNA分子を監視し、アンサンブルアッセイではしばしば隠されがちな動的イベントへのアクセスを可能にします。
私たちは、短い種子領域(4-5 bp)が不安定で短命な複合体を形成するのに対し、長い種子(8-10 bp)は安定した二重複合体を形成することを示しました。Hfq結合モチーフを拡張したり、mRNA上の結合部位の間にスペーサーを導入したりすることで、相互作用寿命がさらに延長され、Hfq介在のアニーリング効率においてモチーフの強さと空間配置の重要性が強調されました。さらに、このアプローチは単一分子分解能でRNA-RNA相互作用の動態を解析し、RNAシャペロン機構を探るための堅牢かつ再現性の高い枠組みを提供します。
概要
細菌の遺伝子発現は転写後レベルで小さなRNAによって広範に調節されています。これらの短い(通常は50〜300 nt)RNAは標的mRNAと塩基対対によって作用します。多くの場合、sRNAはリボソーム結合部位にアナイルして翻訳を抑制したり、RNase2,3をリクルートすることでmRNAの崩壊を引き起こします。これらの相互作用は遺伝学的および生化学的アッセイを用いて広く研究されていますが、利用可能な多くの手法はRNAレベルやタンパク質の出力に対する定常状態の影響から間接的に調節を推定するため、基盤となる結合動態の解明が困難です。
効率的な標的調節には、しばしばRNAシャペロンHfqという小さな六分体Sm様タンパク質が必要です。HfqはsRNAをヌクレアーゼ6から遮蔽することで半減期を延長し、標的mRNA7,8とのアニーリングを促進します。Hfqは異なる好みを持つ3つの異なるRNA結合面を通じてこれらの機能を実現しています。遠位面は通常mRNAに見られるAANモチーフを認識し、近位面はsRNA終端に典型的なUリッチ配列に結合し、縁はRNA骨格と静電気的に相互作用します9。しかし、Hfqは相互作用RNAの総プールよりもはるかに少ない存在量です10,11。この明らかな制限にもかかわらず、新たに合成されたsRNAは転写から数分以内に標的を特定し、調節を引き起こします。この逆説は、RNA-Hfq相互作用が非常に動的であり、RNAが安定複合体に結合するのではなく、連続的に結合・解離していることを示唆しています(13,14)。このような一時的な相互作用がどのように信頼できる調節を生み出すかを理解するには、集団平均ではなく個別の結合イベントへの実験的アクセスが必要です。
sRNAとmRNAの相互作用は、不完全に補完的な種子配列によって媒介されており、これらの配列はしばしば長く高度に構造化されたmRNA内で一致部位を位置づけなければなりません。さらに、sRNAシード領域とmRNA上のHfq結合部位との距離は大きく15倍も変動し、アニーリング過程をさらに複雑にします。Hfqは、標的上の潜在的な結合部位間で柔軟にsRNAを移動させることで、正しいペアリング領域に到達する確率を高めることで、これらの課題を克服します。Hfq媒介のペアリングは局所mRNA構造を再構築し、塩基対領域を一時的に解き放ち、通常アクセスできない配列を露出させることもあります。しかし、このようなリモデリングは、生産的でない、あるいは失敗するアニーリングイベントを引き起こすこともあります。これらの一時的な相互作用は、ペアリング部位17付近に位置する強力なHfq結合モチーフによって安定化されることもあります。この柔軟性にもかかわらず、すべてのsRNA-mRNA遭遇が安定した二重形成をもたらすわけではなく、アニーリング効率を決定する要因もまだ十分に解明されていません。特に、個々の配列決定因子が結合寿命や複雑な安定性に定量的にどのように寄与するかは依然として不明です。
ここでは、配列決定式の段階的操作とsmFRETを用いたアニーリング速度論の直接測定を可能にする最小再構成単一分子系を確立しました。このシステムでは、当初非効率なアニーリングを施し、種子強度、Hfq結合モチーフ強度、これらの部位間の間隔などの主要特徴を体系的に変化させたRNAペアを設計し、個々のパラメータが二重安定性にどのように影響するかを解析しました。制御された in vitro システム内で定義された配列特徴を単離することで、ネットワークの複雑さや間接的な調節効果のために生 体内で 解きほぐすのが難しいsRNA標的規則の機構的解明を可能にします。
プロトコル
このプロトコルは、sRNA-mRNAのアニーリングを監視するための単一分子FRETアッセイを説明しています。モデルRNA設計、合成、スライドパッシベーションおよび機能化、単一分子イメージング、定量データ解析の手順が含まれます。
RNAの調製
sRNAおよびmRNA配列をサイ リコで設計します。各sRNAは転写終端因子で終結し、U豊富なHfq結合モチーフと標的mRNAを補完するシード配列を含んでいるべきです。対応するmRNAには、Hfq結合モチーフとして機能するAANリピートやsRNAシード領域を補完する配列が含まれるべきです。Hfq結合外の配列はAANモチーフやU豊富な路を避けつつランダム化され、意図しないHfq相互作用を防ぎます。mRNAの3'端にテザー補完配列を追加し、イメージング中の表面固定を可能にします。ウェブサーバー経由で、または局所的にRNA構造を用いて、テザー補完配列を除くRNA二次構造を予測できます18。ウェブ解析の場合は、FASTA配列をRNA構造ウェブサーバー(https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb)にアップロードし、「二次構造を予測する」を選択してください。デフォルトのパラメータ(温度37°C、折りたたみ制約なし)を使いましょう。計算後、構造図と折りたたみの確率を調べます。種子内のヌクレオチドやHfq結合モチーフが塩基対の確率を予測した場合、領域は閉塞領域と分類されました>60%。この閾値を超える配列は再設計されました。
製造元のプロトコルに従い、重なり合うオリゴヌクレオチドをDNAポリメラーゼを用いて伸長させることで、 in vitro 転写用のDNAテンプレートを準備します。プライマー濃度はそれぞれ3μMでした。サーモサイクラープログラムはメーカーの推奨通り使用されましたが、増幅サイクル数が8回に減らされ、これによりプライマーの延長が十分でした。
37°Cで3時間から一晩かけて、T7 RNAポリメラーゼを1×転写バッファー(80 mM Tris-HCl、pH 8.0、2 mM スパーミジン、10 mM NaCl)にそれぞれ1 mMのNTP、40 mM DTT、30 mM MgCl2を補足してRNAを転写します。反応を止めるために、最終濃度30 mMにEDTAを加えます。RNA沈殿の場合は、3 M NaOAc(pH 5.4)の1/10体積を加え、その後2.5〜3の ≥99%エタノールを加えます。よく混ぜて-80°Cで1時間培養します。4°Cで≥20,000 × gで35分間遠心分離してRNAをペレットします。 上清液を取り除き、70%エタノールでペレットを洗い、短時間自然乾燥させます。RNAペレットを8 M尿素入り20 μLに溶かし、90°Cで2分間加熱します。RNAは8%ポリアクリルアミドゲルに8M尿素を含む上で精製します。目的のバンドを切断し、洗脱バッファー(0.3 M 酢酸ナトリウム、pH 5.4、1 mM EDTA)で一晩RNAを洗脱します。RNAはエタノール沈殿法で回収し(DNA沈殿の指示に従い)、ペレットをヌクレアーゼフリーの水に溶かします。
蛍光標識用RNAを準備するために、前述のin vitro 転写を行い、反応に32 mM GMPを補足して5'モノリン酸を含む転写産物を生成します。RNAを1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩19 (EDC)とイミダゾールで処理し、5'端にアミン基を導入します。製造元の指示に従い、炭酸水素-重炭酸塩バッファー(pH8.5)でAlexa Fluor 555またはCy3 NHSエステルを併用して培養します。修飾RNAをクロマトグラフィースピンカラムで精製し、エタノールで沈殿させ、ヌクレアーゼフリーの水に溶かします。260 nmおよびナノドロップまたは同等の分光光度計を用いて染料特異的吸収最大値での吸収を測定し、分光光度測定で標識効率を測定します。ビーア・ランバートの法則と蛍光素製造元の対応する消光係数を用いてRNAと染料濃度を計算します。標識効率は染料とRNAのモル比で定義され、常に100%に近づいていました。標識されたRNAは-20°Cで保存可能です。
3′ビオチン基と5′アミノC6リンカーを持つDNAオリゴヌクレオチドの順序。上記のようにエタノールと酢酸ナトリウムを用いてDNAを沈殿させます。製造者の指示に従い、炭酸水素-重炭酸バッファー(pH 8.5)中にCy5 NHSエステルでアミン基を標識してください。上記の通り、標識されたDNAの分光光度測定で濃度を決定します。標識されたDNAは-20°Cで保存可能です。
HFQ浄化
Hfq発現プラスミドpET21b-EcHfqを持つ 大腸菌 BL21(DE3) Δhfq::cat-sacB 細胞を培養し、この大 腸菌hfq 遺伝子はIPTG誘導プロモーターから発現されます。Hfqはアフィニティタグなしで表現されます。この天然タンパク質には、Ni2+ 親和性クロマトグラフィーによる精製が可能な十分な表面露出ヒスチジン残基が含まれています。1LのLB-ミラー培地で細胞を培養し、37°Cで100 μg/mLのアンピシリンを補足し、OD600 は0.6にします。IPTGを最終濃度1 mMに加え、37°Cで4時間培養してHfq発現を誘導します。 細胞を5,000 × g で遠心分離して10分間採取し、その後ペレットを50 mLの溶解バッファー(50 mM Tris-HCl、pH 8.0、500 mM NH4Cl、250 mM MgCl2、1 mM 2-メルカプトエタノール)に再懸濁します。注意:2-マーカプトエタノールは有毒なので、フームフード内で取り扱ってください。細胞を氷上で超音波処理し、パルス設定を50%デューティサイクルに設定します。パルスの間に1分間の冷却間隔を氷上で3回40秒ごとにかけます。溶解液を27,000 g で遠心分離×4°Cで20分間加熱します。 上清液を85°Cで45分間加熱し、その後同じ条件下で再び遠心分離機を行います。得られた上澄液を、室温でRNase A(30 μg/mL)およびDNase I(5 U/mL)で1時間優しく振って処理し、その後0.45 μmフィルターでろ過します。精製解体をNiSO4であらかじめ充填された親和性クロマトグラフィーカラムに適用します。バッファー(50 mM トリスHCl、pH 8.0、500 mM NH4Cl、0.5 mM 2-メルカプトエタノール)でカラムを洗浄します。同じバッファーを使用し、10 mMから1 Mまでの線形イミダゾール勾配濃度でタンパク質を洗脱します。Hfqを含む分画をプールし、HiLoad 16/600 Superdex 200サイズ除外クロマトグラフィーカラムに負荷をかけ、HBバッファー(50 mM Tris-HCl、pH 7.5、250 mM NH4Cl、1 mM EDTA、10%グリセロール)で平衡化します。メーカーの指示に従ってコラムを操作してください。Hfq精製の代表的なSDS-PAGE解析は 補足図1に示されています。必要に応じて、遠心フィルター(3 kDa MWCO)を用いて精製タンパク質を濃縮します。精製されたHfqアリコートは-80°Cで保存可能です。
単一分子実験
石英スライドのパッシベーション20
各長辺の近くに直径0.8mmの平行な穴を5つ開けた石英スライドを準備します。石英スライドとカバースリップをヘレンダールの染色ジャー(スライドホルダー)に入れ、アセトンで20分間ソニック処理します(注意:アセトンは可燃性かつ揮発性があります。フムフード内で作業してください)。洗浄工程をメタノールで繰り返します(注意:メタノールは有毒かつ可燃性です。取るのはフームフード内にあります)。スライドを水でしっかりすすぐ後、1 M KOHで1時間ソニックテージしてください(注意:KOHは腐食性があるため、手袋と目の保護具を着用してください)。スライドを水で洗い流し、アセトンとメタノールでそれぞれ20分間連続してソッケント処理します。KOH洗浄は5M KOHで1時間繰り返し、その後徹底的に水ですすぎます(注意:濃縮KOHは適切な保護具とともに取り扱う)。スライドは自然乾燥させてください。きれいなヘレンダール染色用ジャーを用意し、ヘキサン(注意:ヘキサンは非常に可燃性です。取るのはフームフード)で洗い流し、その後自然乾燥させます。スライドをスライドホルダーに入れ、ヘキサンで2回すすぎます。スライドホルダーに75mLのヘキサンを加え、ヘキサン表面の下に50μLのジクロロジメチルシラン(DMDCS)を慎重に注入します(注意:DMDCSは空気に曝露しないでください)。スライドを優しく揺らしながら1.5時間孵化させます。スライドをヘキサンで1分間すすぎて超音波処理し、この工程を3回繰り返して残留DMDCSを除去します。スライドを自然乾燥させ、50mLチューブ(例:ファルコン管や円錐管)で真空密封します。準備済みスライドは−20°Cの温度で保存され、再利用まで使用可能です。
フローチャネルの組み立てと機能化
簡単なフローチャネルは、クォーツスライド、ガラスカバースリップ、両面テープ、ピペットチップ、エポキシを使って組み立てられます。クォーツスライドの穴の間に薄い両面テープを貼り、カバースリップをその上に置きます。長い端はエポキシでシールしてください。ピペットの先端から約5mmのセグメント(細い先端と幅広のカラーの両方)を切り取り、1つは出口として穴に、もう1つは平行な穴に差し込んで入口貯蔵庫を作ります。両方をエポキシで固定してください。注入前に液体が漏れずに保持されるインレットリザーバーは必要です。チャネルを通じて溶液を引き出すには、1mLシリンジのチューブを出口に接続します。
チャネルを以下の試薬で順次処理し、表面を機能化します:ビオチニル化BSA(0.2 mg/mL)を5分間、Tween-20(0.2%)を10分間、NeutrAvidin(0.1 mg/mL)を1分間使用します。各チャネルあたり約100μLの溶液が十分です。インレットリザーバーに存在する液体よりも多く液体を引き出すのは避けてください。これにより空気がチャネル内に入り泡が発生します。工程間に少量の溶液を貯水槽に残し、チャネルの乾燥を防ぎます。各工程ごとに1× TNKバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、50 mM NaCl、50 mM KCl)で徹底的に洗浄します。この処理により、RNA固定のためのビオチン-ニュートルアビジン表面が確立されます。
固定直前に、40 nM mRNAと20 nMビオチニル化Cy5標識DNAテザーを混合してmRNAテザー二重合成を準備します。混合物を75°Cで変性させ、1×TNKバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、50 mM NaCl、50 mM KCl)で変性させ、その後37°Cで15分間リフォールドし、20°Cで平衡させます。
試料をイメージングバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5、50 mM NaCl、50 mM KCl、4 mM 6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸、0.01%オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、0.8%グルコース、2 U/mL RNase阻害剤)で50倍に希釈し、フローチャネルに注入してmRNAを固定します。1分間培養した後、画像バッファーに酸素除去システム(165 U/mL グルコース酸化酵素および2170 U/mLカタラーゼ)を補充して光漂白を減らします。
sRNA-Hfq複合体は、1×TNKバッファーで最終濃度250 nMに対して1:1の比率で混合し、室温で5〜15分間インキュベートします。酸素スカベンジングシステムを含むイメージングバッファー内で複合体を50倍に希釈し、イメージング直前にフローチャネルに注入します。
単一分子データ取得
EMCCDカメラとレーザーを起動してプリズム式全反射蛍光顕微鏡(TIRF)を設置しました。準備済みスライドを組み立てたフローチャネルをマイクロコーステージに取り付け、プリズムをその上に置きます。データを取得するには単一ソフトウェア(https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab)を使用してください。ソフトウェア内でAutoScaleを選択してバックグラウンドレベルを決定し、得られた値をバックグラウンドフィールドにコピーします。取得フレームレートを100msに設定します。532nmレーザーでAlexa Fluor 555またはCy3を、633nmレーザーでCy5をExcite Shotします。両方のチャネルから60×の水浸水目標を通じて同時に排出量を収集します。各映画では、633 nm励起の10フレームから始め、視野内のCy5標識mRNAを局在させます。532nm励起で5分間録画を続けてください。取得を終了時には633nm励起を1秒行い、Cy5の光漂白を検証します。これにより.pmaの動画ファイルが生成され、分析に利用できます。
単一分子データ解析
カスタムIDLスクリプトを用いて生の.pmaファイルを解析し、ドナー-アクセプターチャネルマッピングを行い、蛍光強度の軌跡を抽出します。まず、532 nmまたは633 nmレーザーで励起時にドナーチャネルとアクセプターチャネルの両方で検出可能な多色蛍光ビーズを使ってキャリブレーションムービーを記録します。このキャリブレーションムービーを使って、ドナーチャネルとアクセプターチャネルを整列させるマッピングファイルを生成します。得られたマッピングファイルをすべての実験記録に適用し、対応するドナー-受容体のペアを特定し、蛍光スポットを検出し、強度時間の痕跡をエクスポートしてFRET解析に用いられます。詳細な手順はスクリプト(https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab)とともに提供されています。
MATLABでスクリプトs_tr_E.mを使って強度トレースを処理します。スクリプトを起動し、.tracesと.pksファイルを含むディレクトリに入り、その後ファイルインデックスと時間分解能を入力します。スポット識別に使われるフレームウィンドウを選択してください。スクリプトは1スポットごとのドナーおよびアクセプター強度を表示します。キーボードのコマンド(bで戻る、gで指定された分子にジャンプ)を使って分子を移動します。必要に応じてプロットをクリックしてドナーおよびアクセプターの基準線(k)を定義し、漏れを修正します。受理されたトレースを、時間、ドナー、アクセプター強度を含む.datファイルとして個別に保存するには、sキーを押します。エクスポートしたファイルを下流の定量分析に活用してください。
ピークファインダープログラムを用いて個々のsmFRET痕跡を解析し、結合イベントを抽出して定量化(滞留時間解析やFRET状態分布を含む)を抽出します。プログラムを起動し、エクスポートした.dat traceファイルが入っているフォルダをファイルメニューから開いてください。MATLABスクリプトで事前に決定したベースライン値およびドナーからアクセプターへのリーケージ値を設定します。次に、強度の閾値を設定し、すべての視覚的に検証された結合イベントが選択値より上に位置するように自動ピーク検出を導きます。ノイズで単一のイベントが複数のピークに分割される場合は、内蔵のマージ機能を使って手動でそれらをマージしてください。「ピークを保存」をクリックすると、検出されたイベントを開始時間、終了時間、平均FRET効率を含む.csvファイルとしてエクスポートできます。出力ファイルはピークディレクトリに保存され、フレーム解決された各イベントのFRET値はピークフレットディレクトリに書き込まれます。FRET効率は、受容体蛍光強度をドナーとアクセプター強度の合計で割ることで計算され、背景およびドナーチャネルへの漏れを補正した値を用います。手動でCy5光漂白の痕跡を検査し、FRET効率の急激な低下とCy3強度の増加が見られます。光漂白が起きた場合、Cy3蛍光が検出可能な限り結合が持続すると仮定し、対応する.csvファイルを編集してピーク持続時間を補正します。
ピークフレットファイルからフレーム分解FRET効率値をGraphPad Prismにインポートします。周波数分布関数を用いてFRETヒストグラムを作成し、分布をガウスモデルで当てはめて支配的なFRET集団を特定します。
分離時点から関連性を差し引いて、スプレッドシートを使って個々の結合イベントの滞留時間を算出します。各実験リピートごとに過渡現象の割合(<10秒)を計算します。統計解析はGraphPad Prismで実施されました。2つの疾患間の比較は非ペアt検定で評価され、3つ以上の疾患間の比較は一方元ANOVAとTukeyの事後検定で分析されました。
結果
種子長はsRNA-mRNAペアリングの動的な領域を設定します
配列特徴がHfq媒介アニーリングをどのように支配するかを検証する最小限の単一分子アッセイを確立しました。モデルRNAは、以前に記載されたHfq依存型sRNA-mRNAペアの構造に従って設計され、mRNAにはアデノシンを豊富に含むHfq結合モチーフ、sRNAにはウリジン豊富な縁結合部位を有しています(図1A)。sRNAは5ʹ末端にAlexa Fluor 555(ドナー)とmRNA-DNAテザーで標識され、Cy5(受容体)で標識され、FRETを通じて塩基対対誘導による近接性を検出可能にしました。
種子の補完性を4、5、8、10塩基対に変化させることで、異なる動的挙動が生まれました。4塩基基対シードでは、相互作用は主に一時的で、FRET効率が異様であり、塩基対が不完全であることを示唆しました(図1B-D)。対照的に、8塩基および10塩基の種子は観察ウィンドウを通じて持続する安定した二重種子を生み出しました(図1C)。相互作用は期待される高いFRET状態(EFRET ≈ 0.79-0.80、図1D)をもたらし、これはRNA間の完全な塩基対合と一致します。5塩基のシードは短命ながら明確に定義された結合イベント(EFRET ≈ 0.66)を生み出し、RNA配列の後続修飾に有効なダイナミックレンジを提供しました(図1B-D)。したがって、すべての下流試験に5塩基基対補完性を用いました。
より強いHfq結合モチーフはsRNA-mRNA複合体の安定性を高めます
次に、Hfq結合強度が固定された5塩基相補性で結合寿命をどのように調節するかを調査しました。mRNAモチーフをAAN4からAAN6に拡張することで、安定複合体形成の確率が大幅に増加しました(p < 0.001)。平均寿命は7.5秒から18秒に上昇し、10秒<不安定事象の割合は80±2%から68.3±2.9%に減少しました(図2A-C)。
次に、Hfq結合モチーフがsRNAに与える影響を検証しました。縁結合部位をUUAUUUUUUからCUUC(sRNA-SR、「ショートリム」)に短縮すると非常に不安定な相互作用が生じ(AAN4との平均寿命は1.9秒)、その文脈でmRNAモチーフを強化しても効果は控えめでした(AAN6との平均3.0秒、有意ではありません、 図2B、C)。したがって、両パートナーは生成された複合体の安定性に寄与しますが、弱いsRNA-Hfq接触は強いmRNAモチーフによる利益を制限します。
mRNA上のHfq位と種子位の間のスペーサーは、より長寿命な複合体を促進します
HfqはAAN領域に結合したまま、その縁面を利用して最適なsRNAペアサイト16の探索を容易にすることができます。この性質は、mRNA上の2つの結合領域間の間隔が増えることが相互作用の安定性に影響を与える可能性を示唆しました。
これを検証するために、Hfq結合部位とsRNA結合部位(N15)の間に15 ntの単一鎖スペーサーを導入しました。この修飾により、安定アニーリングイベントの寿命は7.5秒(AAN4)から47秒(AAN4-N15)に大幅に延長されました(p < 0.01)(図3A,B)。結合イベントが10秒未満続く割合も80±2%から44±6%に減少しました(図3C)。これらのデータは、結合モジュール間の柔軟性を高めることでアニーリング中間体の安定化と長寿命の二重合成を促進することを示しています。
データの利用可能性:
本研究の結果を裏付けるすべてのデータ、例えば単一分子FRET軌跡、処理データセット、解析スクリプトは、Mendeley Dataリポジトリ(doi:10.17632/3z8fng2c8g.1)で公開されています。
図1:sRNA-mRNAの相補性が結合効率に与える影響。(A) sRNA-mRNAアニーリングのためのsmFRETアッセイ。Alexa Fluor 555標識されたsRNAと固定化されたmRNA-Cy5-DNAテザー複合体との塩基対は高いFRETシグナルを生み出します。モデルmRNAはHfq結合部位(AAC)4(青)とsRNA結合部位(S5、赤)、さらに5つのヌクレオチドとRNA-DNAハイブリッド領域を含みます。sRNAには縁結合部位(オレンジ)があります。(B-D)のパネルは実験条件(種子長)でグループ化されています。(B) 単一のmRNA分子に対する代表的なsRNA結合イベント。Alexa Fluor 555標識sRNA(ドナー、緑)およびCy5-DNAテザー(受容体、赤)の蛍光強度微量が示されています。Cy5は録画の最初の10フレームと最後の10フレームで直接興奮していました。(C) sRNA-Hfqで結合した代表的なmRNA分子50個を描いたラスタグラム。各水平バーは単一のsRNA-mRNA相互作用を表します。(D) 4 bp(N = 416 mRNA)、5 bp(N = 513 mRNA)、8 bp(N = 191 mRNA)、または10 bp(N = 105 mRNA)の相補領域を含むmRNAとsRNA間の相互作用におけるFRET効率のヒストグラム。FRET効率は、0.1秒間隔の個々の結合イベントにおけるベースラインおよび漏れ補正ドナーおよびアクセプター強度から算出されました。ガウスフィット(青)は支配的なFRET集団を示すものであり、E_FRET値の計算には用いられませんでした。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図2:Hfq結合モチーフ長がsRNA-mRNA相互作用に与える影響。 すべてのバリアントで塩基対領域の長さは5塩基対です。 (A) sRNA-Hfq複合体に結合した50個の代表的なmRNAを示すラスタグラム。各水平バーは単一の相互作用を表します。上のカートゥーン図は、対応するRNA設計を示しており、mRNA内の(AAC)反復数とsRNAの縁結合領域の長さ(SR = 「短い縁」)が変化しています。 図1Aのような色付けです。(B) sRNA-mRNA結合寿命の散布図。各点は単一の結合イベントを表します。平均寿命(赤い横線):mRNA-AAN4 + sRNA(N=188 mRNA)は7.5秒、mRNA-AAN6 + sRNAは18秒(N=142 mRNA)、mRNA-AAN4 + sRNA-SR(N = 85 mRNA)は1.9秒、mRNA-AAN6 + sRNA-SRは3秒(N = 149 mRNA)。(C) 10秒未満の結合イベントの割合を示す棒グラフ。誤差バーは2つの独立したデータセットからの標準偏差を表します。Tukeyの事後検定を用いた一元ANOVAによる統計的分析による多重比較。p < 0.001, ****p < 0.0001;特に重要ではありません。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
図3:Hfq結合部位とsRNA結合部位間のスペーサー長がsRNA-mRNA相互作用に与える影響。 すべてのバリアントで塩基対領域の長さは5塩基対です。 (A) sRNA-Hfq複合体に結合した50個の代表的なmRNAを描いたラスタグラム。各水平棒は単一の結合イベントを表します。上のカートゥーン図は対応するRNA設計を示しています。N15 = 15 nt のランダム配列間隔。 図1Aのような色付けです。 (B) sRNA-mRNA結合寿命の散布図。各点は単一の結合イベントを表します。平均寿命(赤い横線):mRNA-AAN4 + sRNA(N=188 mRNA)は7.5秒、mRNA-AAN4-N15 + sRNAは47秒(N=289 mRNA)。 (C) 10秒未満の結合イベントの割合を示す棒グラフ。誤差バーは2つの独立したデータセットからの標準偏差を表します。非ペアt検定による統計解析。**p < 0.01。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
補足図1: 大腸菌 の精製 Hfq。 Hfqの発現と精製に関するSDS-PAG解析。(トップ)Ni2+ 親和性(HiTrap)カラム上で精製中に採取されたサンプルで、誘導前、誘導後、ペレット、溶解液、負荷、流通過、洗浄分率、脱出ピーク分率などが含まれます。(下)HiLoad 16/600 Superdex 200カラムのサイズ排除クロマトグラフィー後のピーク分数のSDS-PAGE。Hfqの単量体(~11 kDa)および六量体(~66 kDa)型が示されています。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
ディスカッション
本研究は、特定のRNA配列特徴がHfq介助sRNA-mRNAアニーリングの効率をどのように決定するかを解析するための最小限の単一分子アッセイを確立します。シードの長さ、Hfq結合モチーフの強度、結合モジュール間の間隔を変化させることで、各パラメータが単一分子分解能での二重安定性にどのように寄与するかを直接定量化しました。集団平均効果を報告するアンサンブル測定とは異なり、このアプローチは個々の結合および解離イベントを直接解決し、動力学的異質性や一時的な相互作用の測定を可能にします。私たちの結果は、短い種子領域でも一時的に関与できることが示されていますが、長い種子は寿命が長い安定した二重種子を生み出します。これらの発見は、細菌のsRNAにおける自然な種子領域は通常6〜12ヌクレオチドに及び、完全に相補的な二重鎖(21,22,23)を形成することは稀であることを示す、従来のin vivoおよびアンサンブルデータと一致しています。
また、mRNAおよびsRNAのHfq結合モチーフが二重安定性に強く影響することを発見しました。mRNAのAANモチーフを延長すると結合寿命が延び、sRNA縁結合部位が短くなることで着しく不安定化しました。これは、Hfqの遠位面がアデノシン豊富なmRNAモチーフを固定し、縁がウリジン豊富なsRNAをリクルートして補完領域9,17の効率的なアライメントを促進する協働モデルを支持します。通常、生産的な調節結果のみを検出する遺伝学的またはレポーターベースのアッセイとは異なり、このシステムは結合安定性と下流効果を定量的に分離し、個々の配列特徴が物理的相互作用寿命をどのように調節するかを直接比較することを可能にします。強い縁結合モチーフは、sRNA-mRNAペアリングに必要な構造的再配置が必要な場合に特に重要であり、Hfq17上のRNA保持を促進します。また、リムはsRNA-Hfq複合体16によるmRNAの横走査を促進すると考えられており、これは特にHfq結合領域から遠い標的部位に重要となる可能性があります。結合部位間に15 nt間隔を設けた結果は、種子とHfqモチーフ間の柔軟性がペアリングの安定性を高め、鎖交換時の立体的制約を減らす可能性があることを示しました。
自然系を超えて、これらの結果は合成または工学的sRNAの設計にも関連しています。既存の設計戦略の多くはシード領域や一般的な足場の最適化に焦点を当てていますが、本データはHfq結合モチーフとターゲット領域の間隔などの追加の決定要因を強調しています。配列の特徴は制御されたモジュール式で導入されるため、このアッセイは設計ルールを検証するための体系的な実験的枠組みを提供します。この原理は、調節効率が向上した人工sRNAの今後の構築を導く可能性があります。
このアプローチはRNA-RNA相互作用の定量的かつ再現性のある解析を可能にしますが、限界もあります。このアッセイは完全に補完的な領域を調査しますが、ほとんどの生理学的sRNA-mRNA相互作用には認識や調節に影響を与える不一致や膨らみがあります。この方法はsRNA-mRNA結合寿命を測定しますが、翻訳阻害やmRNA崩壊などの下流の調節結果には直接的には対応しません。今後の適応として、ミスマッチされた種子領域、異なるGC含有量、リボソームと分解体の組み合わせを取り入れ、これらの因子が結合速度論をどのように形成するかを体系的に探ることが考えられます。
開示事項
著者たちには利益相反はありません。
謝辞
単一分子計器へのアクセスを円滑にしてくださったサラ・ウッドソン教授に感謝します。本研究はポーランド国立科学センター(2022/46/E/NZ1/00462からEMM)およびEMBO設置助成金(IG 5730-2024からEMM)によって資金提供されました。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.45 & mu;Mフィルター | ミリポール | HABG04700 | |
| 5 mL ハイトラップカラム | シチバ | GE17-0408-01 | |
| アセトン | メルク | 270725 | HPLCグレード |
| アクリルアミド:ビスアクリルアミド溶液 | メルク | A2792-100ML | |
| ALEXA555 NHSスクシニミジルエステル | サーモ・フィッシャー | A20009 | |
| アミコン ウルトラ遠心フィルター(NMWL、3 kDa) | メルク | UFC900308 | |
| 塩化アンモニウム | メルク | 1330-500G | |
| アンピシリン | メルク | A9518-5G | |
| ATP | リネガル・ケミカルズ | K054.1 | |
| ベータメルカプトエタノール | メルク | M3148-500ML | |
| バイオBSA | メルク | A8549-10MG | |
| バイオジェルP-30を用いたバイオスピンカラム | バイオ・ラッド | 7326231 | 標識RNAの精製のために |
| カタラーゼ | メルク | C9322 | |
| CTP | リネガル・ケミカルズ | K057.4 | |
| Cy3 HNS エステル | シチバ | PA13105 | |
| Cy5 NHSスクシニミジルエステル | シチバ | PA15101 | |
| DDT | サーモ・フィッシャー | R0861 | |
| ジクロロジメチルシラン | メルク | 440272 | |
| DNAオリゴマー(テザー)は5′-アミノリンクカーC6 | 熱力学 | 該当なし | |
| ドナーゼI | サーモ・サイエンティフィック | 18047019 | |
| EDC | 熱力学 | PG82079 | |
| EDTA | メルク | ED2SS-1KG | |
| EMCCDカメラ | アンドール | ||
| エタノール | メルク | 1085430250 | |
| グルコース | メルク | D9434-1KG | |
| グルコース酸化酵素 | メルク | G2133-50KU | |
| グリセロール | メルク | G5516-1L | |
| GMP | メルク | G8377 | |
| GTP | リネガル・ケミカルズ | K056.4 | |
| HCL | メルク | 1.00318 | |
| ヘキサン | サーモ・フィッシャー | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200サイズ除外カラム | シチバ | GE28-9893-35 | |
| IPTG | メルク | 420322-1GM | |
| KCl | メルク | P9541-1KG | |
| コー | メルク | 484016-1KG | |
| 塩化マゲンシウム | メルク | M8266-1KG | |
| メタノール | メルク | 34885-M | HPLCグレード |
| ニュートラビジン | サーモ・フィッシャー | 31000 | |
| 硫酸ニッケル | メルク | 1067261000 | |
| ニッコール | メルク | P8925-1G | |
| Q5ポリメラーゼ | NEB | M0491S | in vitro転写テンプレートの作成に使用 |
| RNase A | 熱力学 | EN0531 | |
| RNasin Plus | プロメガ | N2611 | |
| 酢酸ナトリウム | メルク | S7545-100G | |
| 塩化ナトリウム | シグマ・オルドリッチ | S3014-1KG | |
| スペルミジン | メルク・ライフサイエンス | S2626 | |
| トリス・ベース | サーモ・サイエンティフィック | 17926 | |
| トロロックス | メルク | 238813-1G | |
| 尿素 | メルク | U1250-5KG | |
| UTP | リネガル・ケミカルズ | K055.3 |
参考文献
- Alquethamy, S., Lalaouna, D., Tree, J. J. What makes a small RNA work. Nucleic Acids Res. 53 (12), 563(2025).
- Prévost, K., Desnoyers, G., Jacques, J. F., Lavoie, F., Massé, E. Small RNA-induced mRNA degradation achieved through both translation block and activated cleavage. Genes Dev. 25 (4), 385-394 (2011).
- Massé, E., Escorcia, F. E., Gottesman, S. Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17 (19), 2374-2383 (2003).
- Panja, S., Woodson, S. A. Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J Mol Biol. 417 (5), 406-412 (2012).
- Sauter, C., Basquin, J., Suck, D. Sm-like proteins in eubacteria:the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31 (14), 4091-4098 (2003).
- Andrade, J. M., Pobre, V., Matos, A. M., Arraiano, C. M. The crucial role of PNPase in the degradation of small RNAs that are not associated with Hfq. RNA. 18 (4), 844-856 (2012).
- Panja, S., Schu, D. J., Woodson, S. A. Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41 (15), 7536-7546 (2013).
- Soper, T. J., Woodson, S. A. The rpoS mRNA leader recruits Hfq to facilitate annealing with DsrA sRNA. RNA. 14 (9), 1907-1917 (2008).
- Updegrove, T. B., Zhang, A., Storz, G. Hfq:the flexible RNA matchmaker. Curr Opin Microbiol. 30, 133-138 (2016).
- Moon, K., Gottesman, S. Competition among Hfq-binding small RNAs in Escherichia coli. Mol Microbiol. 82 (6), 1545-1562 (2011).
- Hussein, R., Lim, H. N. Disruption of small RNA signaling caused by competition for Hfq. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (3), 1110-1115 (2011).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol Microbiol. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Wagner, E. G. H. Cycling of RNAs on Hfq. RNA Biol. 10 (4), 619-626 (2013).
- Roca, J., Santiago-Frangos, A., Woodson, S. A. Diversity of bacterial small RNAs drives competitive strategies for a mutual chaperone. Nat Commun. 13, 2449(2022).
- Tree, J. J., et al. Identification of bacteriophage-encoded anti-sRNAs in pathogenic Escherichia coli. Mol Cell. 55 (2), 199-213 (2014).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. RNA compaction and iterative scanning for small RNA targets by the Hfq chaperone. Nat Commun. 15, 2069(2024).
- Małecka, E. M., Woodson, S. A. Stepwise sRNA targeting of structured bacterial mRNAs leads to abortive annealing. Mol Cell. 81 (9), 1988-1999.e4 (2021).
- Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nat Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nat Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., Aiba, H. Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol Microbiol. 61 (4), 1013-1022 (2006).
- Bandyra, K. J., et al. The seed region of a small RNA drives the controlled destruction of the target mRNA by the endoribonuclease RNase E. Mol Cell. 47 (6), 943-953 (2012).
- Brück, M., et al. A library-based approach allows systematic and rapid evaluation of seed region length and reveals design rules for synthetic bacterial small RNAs. iScience. 27 (9), (2024).
- Han, K., Kim, K. S., Bak, G., Park, H., Lee, Y. Recognition and discrimination of target mRNAs by Sib RNAs, a cis-encoded sRNA family. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5851-5866 (2010).
- Sharma, V., Yamamura, A., Yokobayashi, Y. Engineering artificial small RNAs for conditional gene silencing in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 1 (1), 6-13 (2012).