ショウジョウバエ卵母細胞におけるアセントロソーム微小管ネットワークのライブイメージングおよび定量解析のワークフロー

Summary

ここでは、ライブイメージングと自動解析ツールを組み合わせてショ ウジョウバエ 卵母細胞内の微小管動態を解析するプロトコルを紹介します。このワークフローにより、成長、向き、速度、空間的組織を含む微小管の挙動を効率的かつ再現可能に測定でき、最適化により他の細胞タイプにも適応可能です。

Abstract

微小管(MT)細胞骨格は、細胞の形状、極性、移動、分裂など多くの細胞機能に不可欠です。中心体は分裂する動物細胞における主要なMT組織化中心(MTOC)として機能しますが、 ショウジョウバエ の卵母細胞を含む多くの分化細胞は、MTネットワークを構築するためにアセントロソーム経路に依存しています。増殖細胞におけるMT組織に関する広範な知識とは対照的に、中心体なしでMTネットワークがどのように組み立てられるかについてはほとんど知られていません。 ショウジョウバエ の卵母細胞は、アセントロソームMT(中心体)の組織構造と動態を研究する強力なモデルを提供します。しかし、彼らの密なMTネットワークは従来のイメージングに挑戦しています。ライブイメージングはMTの成長と姿勢をリアルタイムで可視化することを可能にしますが、標準化された解析手法は依然として限界があります。ここでは、エンド結合タンパク質1(EB1)-グリーン蛍光タンパク質(GFP)を用いてショ ウジョウバエ の卵母細胞におけるMT成長動態を解析するライブイメージングベースのプロトコルを提示します。GFPは活性MT重合部位を標識するプラスエンドトラッキングタンパク質です。高解像度のAiryscan共焦点顕微鏡によりEB1彗星の検出が可能となり、カスタムのフィジーマクロやPythonスクリプトは彗星の密度、速度、長さ、方位を効率的かつ再現性のある定量化を提供します。この方法を検証したのは、対照卵母細胞と冷静誘導MT脱重合を受けた卵母細胞、さらには保存されたMTマイナスエンド安定剤であり非中心体微小管組織化センター(ncMTOC)のコア成分であるパトローニン変異体(ヒトではCAMSAP)を、MT動態障害の正のコントロールとして比較したものである。分析では、EB1彗星の前方富集や特徴的な向きバイアスを含む領域特異的なMT動態が明らかになり、MT成長における微細な摂動を検出するワークフローの感度も確認されました。このアプローチは、卵母細胞におけるMTの挙動を研究するための信頼性が高く使いやすいフレームワークを提供します。この段階的なプロトコルは、この文脈でMT調節因子の調査を可能にし、適切な最適化を用いればニューロンや上皮細胞など他の分化した細胞タイプにも適応可能である可能性があります。より広くは、多様なMT構造が特殊な細胞機能の基盤となるメカニズム的研究や遺伝的スクリーニングを支援しています。

Introduction

微小管(MT)細胞骨格は真核細胞の重要な構成要素であり、細胞の形状、極性、分裂の確立と維持に重要な役割を果たします。MTポリマーの動的挙動は成長と収縮を特徴とし、多くのMT^{ベースのプロセスにおいて}極めて重要です^1,2。異なるMTアレイの組み立ては、MTが核化される微小管組織中心(MTOC)の複合的な働きと、MTの安定性、向き、動態を制御する多様なMT調節タンパク質の活性に依存しています(^1,2,3)。最も研究されているMTOCは中心体であり、細胞間期の細胞形状や極性の調節、そして有糸分裂における有糸分裂紡錘体の組み立てに重要な放射状のMTアレイを生成^します。しかし、有糸分裂の出口や分化時、例えばニューロンや上皮細胞と同様に、中心体MTOC活性はしばしば減弱され、極端な場合、例えば卵母細胞では^6,7が排除されることもあります。これはしばしば、MTOC機能が他の^{細胞部位2,3,8}に割り当てられ、非中心体MTOC(ncMTOCs)と呼ばれる他の細胞部位に割り当てられることで、MT細胞骨格の細胞型特異的再構築と関連しています。有糸分裂細胞におけるMTの組織構造の解明には大きな進展がありますが、有糸分裂を終えた動物細胞や分化中の動物細胞におけるMTがどのように核生成され、安定化され、空間的に配置されるかについては比較的ほとんど知られていません^。特に、生物のほとんどの細胞は分裂しません。細胞周期を抜けたり分化したりしています。したがって、MT細胞骨格がどのように組み立てられ、制御されているかを理解することが重要です。この知識は、特殊な細胞機能を支えるために異なるMTアーキテクチャがどのように確立されるかを明らかにする上で不可欠です。

ショウジョウバエメラノガスター卵母細胞は、アセントロソームMTの組織と機能を研究するための強力なシステムを提供します。卵形成の中期段階では中心体活性が^9段階減弱され、卵母細胞前外側皮質に局在するncMTOCsからMTが生成されます(図1B)。このMTネットワークは母体mRNA、タンパク質、小器官の局在化に不可欠であり、これらは将来の胚軸の確立や発生に不可欠です(^10,11)。以前の研究では、卵母細胞のncMTOCsはMTマイナス末端タンパク質のパトロニンで構成されており、これはスペクトラプラキンタンパク質のショットと複合体を形成し、皮質アクチン細胞骨格に固定していることが示されました。MTはカタニンなどの切断酵素によって生成された短いMT断片から成長し、これがさらなるMT重合の種子として機能すると提案されました¹²。同様のメカニズムは、中心体活性が低下するニューロン¹³のような他の分化細胞でも提案されています。しかし、卵母細胞のような複雑なMTネットワークを切断することで生成されるメカニズムは、依然として十分に解明されていません。これらの文脈におけるMTが主に切断に基づく転位によって形成されるのか、それとも切断と新たなMT核生成の組み合わせなのかは依然として明確ではありません。卵母細胞MTネットワークの複雑さは、よく知られた中心体文脈の外でMTがどのように生成・組織されるかを研究するのに理想的なシステムです。特に、これは画像診断や解析にも課題をもたらします。卵母細胞内の密なMTネットワークにより、従来の免疫染色や静的イメージング手法では個々のMTを分離することが困難です(^2,14)。

ライブイメージングはMTネットワークの研究能力を大幅に向上させ、MT重合イベントをリアルタイムで可視化し、MT成長の動態や方向性に関する重要な洞察を提供しています。過去の研究では、プラスエンド^{マーカー14、15、16}のライブイメージングを用いて卵母細胞におけるMT成長動態を解析することに成功しています。しかし、多くの場合、MTダイナミクスを定量化するために用いられる画像解析手法は簡潔にしか説明されず、カスタムや実験室固有の実装に依存していたり、公開されていないため、再現性や広範な普及が制限されています。本手法はこれらの先行手法を基に、完全に文書化された公開されたユーザーフレンドリーな分析パイプラインを提供し、データセットや実験条件を超えたMT成長パラメータの標準化された定量化を可能にします。このプロトコルでは、MTの動態は中期卵形成段階で画像化され、MT細胞骨格がアセントロソームのMTネットワークによって組織化されます。成長中のMTは、MTプラスエンドトラッキングタンパク質であるEB1-GFPを用いて可視化され^、高速モードでアレイ検出器を用いたレーザー走査共焦点顕微鏡で取得されます。私たちのアプローチの新規性は画像解析にあります。完全に文書化されたユーザーフレンドリーなステップバイステップのパイプラインで、ユーザーは関心のある地域のみを選択する必要があります。画像処理と定量化はカスタムのフィジーマクロとPythonスクリプトによって促進され、EB1彗星の効率的かつ再現性のある検出や成長方向、速度、空間的組織化などのパラメータ抽出が可能となっています。このフレームワークは、実験条件下でのMT動態を比較するための標準化され、アクセスしやすいツールを提供します。

本論文では、この手法を用いて対照卵母細胞と冷処理で脱重合した卵母細胞におけるMT増殖を比較します。これはプロトコルの検証と、MT調節における候補タンパク質の役割を解明する将来の研究を支援する役割を果たす役割を果たす。

Protocol

1. ハエの遺伝学

注:卵母細胞内のMTを可視化するために、このプロトコルは公開されているトランスジーン(Table of Materials)を使用しており、これはGFP(グリーン蛍光タンパク質)タグ¹⁹でマークされたMTプラスエンドトラッキングタンパク質EB1を発現しています。EB1-GFPは成長中のMTとその末端に特異的に結合し、重合方向に沿って動く蛍光の「彗星」として現れます^17,18。これにより、卵母細胞内の成長方向、速度、空間分布を含むMT成長動態の可視化と定量化^{が可能になります。}

1. すべてのハエ株は標準的なトウモロコシ粉寒天培地で25°Cの標準ショ ウジョウバエ 飼育技術を用いて維持してください。
2. UAS-RNAiトランスジーンを持つ未婚8–12匹の雌バエを、matα4-Gal4-VP16遺伝子型のオス5匹に交配;EB1-GFPです。
   注:遺伝交配を簡素化するために、V32-Gal4系統(第2染色体への挿入)とEB1-GFP系統(第3染色体への挿入)を交差してハエストックを生成します。EB1-GFPはUASpプロモーターの制御下にあるため、V32-Gal4ドライバーはEB1-GFPの発現および必要に応じて後続交配で導入されるUAS-RNAiトランスジーンの発現を誘導します。
3. F1の子孫(子孫)が孵化した後、希望の遺伝子型(生後1週間未満)のメスを10〜15羽選びます。
4. メスと2〜3匹のオスを、少量の酵母ペーストが入った新鮮なバイアルに移します。酵母ペーストは卵形成を刺激し、卵室の進行を促進します。オスの存在は交尾を確実にし、卵母細胞の成熟や産卵も促進します。フライは2日間25°Cに保ちます。
   注:MT動態における特定の遺伝子の役割を調査するために、UAS/GAL4システム²¹を用いてタンパク質ノックダウンを実現できます。これは、公開されている母体ドライバーであるmatα4-Gal4-VP16(V32-Gal4とも呼ばれる)です。これは卵形成の第3〜4段階から生殖細胞内でGal4発現を開始します。前述の通り、このドライバーはEB1-GFPおよびUAS-RNAi構成要素の発現を誘導し、ゲルマリウム期以降にのみ目的タンパク質の枯渇を可能にします。この戦略は、初期の有糸分裂および卵母細胞の指定時に標的タンパク質の初期機能をバイパスします。このような実験を行う際は、前述の通りにフライを準備する必要があります。

2. 卵巣剥離

1. F1メスは標準的なフライパッドでCO₂を用いて麻酔し、1匹のメスを選んで解剖します。
2. 選んだメスを直接35mmのガラス底皿(厚さ0.13〜0.15mm)に移し、フライの上にイメージングオイルを滴します。
3. ハエは腹側が上(翼は下向き)に位置をつけます。1組のピンセットで下胸部を優しく押さえ、もう1組のピンセットで腹部の後端から少しキューティクルをつまみます。
4. 慎重に開口部から引き抜き、生殖器を優しく取り出します。
5. 卵巣を分離し、その後ピンセットで優しく油に滑らせて卵巣を一つずつ取り出します。卵巣を操作する際は、より脆弱な中期期(第6〜9段階)を損傷しないように、古い卵室(第13〜14段階)に必ず持ち寄せてください。中間段階は画像診断で注目されるものです(図1A,B)。
6. 卵巣の前端を掴み、そこにはジャーマリウムと初期段階の卵室があります(図1A,B)。個々の卵巣にゆっくりと一定の緊張をかけてください。引っ張ると、さまざまな発達段階の卵室が現れます。このプロセスは、1つの卵巣ごとに複数回繰り返すことで追加の卵巣を分離^{することができます(デ}モンストレーションはビデオ参照)。
   注:MT脱重合のために冷処理を受けた卵母細胞については、前述通りの解剖を行いましたが、イメージングオイルの代わりにBRB-80バッファーを使用していました。剥離された卵巣はBRB-80を含むマイクロチューブに移され、氷上で15分²³秒培養されました。培養後、卵巣をイメージングオイルを塗ったガラス底皿に移し、手順はステップ3.1から再開されました。

3. ライブイメージング

1. ガラス底皿を適切なスライドホルダーを使って顕微鏡ステージに置きます。
2. 画像検査のためにステージ7または8の卵室を選択してください。
   注:これらの段階での卵室は卵母細胞の大きさと核位置から特定できます。卵母細胞は個々の看護細胞よりも明らかに大きく、卵室の約3分の1(ステージ7)から半分(ステージ8)を占めています。卵母細胞核は卵母細胞の前部皮質に位置し、看護細胞^に隣接しています。
3. 外側濾胞細胞層の不連続性や、鉗子による機械的損傷を示す可能性のある損傷の兆候がある卵子腔の画像検査は避けてください。最適な画質を得るためには、63倍対物レンズ(1.40 NA、油浸)を持つ高速共焦点イメージングシステムを使用し、高い信号対雑音比(SNR)を備えてください。ナイキスト・シャノンのサンプリング基準に従っていることを確認してください。
4. 焦点を調整し、適切な露出を決定してください。これは使用されるEB1構成要素(例:異なるプロモーターや蛍光タグ)や顕微鏡システムによって異なる場合があります。信号は彗星の動態を追跡できるほど明るく、背景蛍光で飽和や隠れてはいけません。
5. 488 nmレーザーをGFP蛍光層励起に設定します(レーザー出力10%;検出器利得=750V)。GFP蛍光色素の適切な発光ウィンドウ(500–550 nm)または同等のフィルターセットを選択します。
6. 500ms(2フレーム/秒)のフレーム間隔を用いて、少なくとも4分間のタイムラプス動画を取得し、個々のMTと終了を追跡するのに十分なデータを得ます。(補足動画1は、後のMT追跡解析に適した代表的なタイムラプス取得を示しています。)
7. 取得画像は、顕微鏡取得ソフトウェアのアレイ検出器処理で、デフォルトの処理フィルター強度で処理します。
   注:画像油に浸すと、剥離された卵巣は最大90分間生存可能です。この期間中、卵室は顕著な変性の兆候なしに画像化できます。この期間終了後、新しいメスを解剖し、新しい卵室を準備^{して画像検査}を行います。

4. 画像処理

以下のワークフローを実行し、MTダイナミクスに関連するさまざまなパラメータを定量化するためのプロットや統計量を生成します。すべてのステップはマクロやスクリプトで自動的に実行するか、プロトコルに従って手動で実行してください(図2)。このワークフローで使用されるすべてのフィジーマクロ、トラッキングスクリプト、Python解析コードは 補助コーディングファイル1–7として提供されています。

1. 画像前処理 - ステップ1
   以下の手順では、光漂白を補正し、背景雑音を低減することで、トラッキングのための信号安定性を確保することで、生のタイムラプス画像を準備します。まず、EB1の可視性はガウス差分(DoG)フィルターを用いて強化されます。これは空間的バンドパスフィルターとして機能します。このプロセスは、軽くぼやけた画像から強くぼやけた画像を差し引くことで、低周波の細胞質ヘイズや高周波のピクセルノイズを抑制しつつ、EB1彗星の回折制限信号を分離します。次に、成長するMTチップを特に強調するために時間勾配フィルターを適用します。画像スタックは時間的次元を空間Y軸にマッピングするために再スライスされます。次に、[-1 0 1]の核を持つ1次元畳み込みを適用し、各ピクセルの時間的微分を計算し、移動彗星の前縁が最も急速に増加する場所を強調します。スタックは元の寸法に再スライスされ、合成画像に統合され、解析のためにエクスポートされます。
   注意:このステップは、マクロファイル File1.Step1_MTs_macro.ijm (補足コーディングファイル1フィジーに入り、マクロを運用しています。
   1. 必要なプラグインインストール(ワンタイムセットアップ)
      1. フィジーを発射する。メニューバーの 「プラグイン>インストール 」へ移動します。
      2. ファイルブラウザで、このプロトコルに付属する File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (補足コーディングファイル7)ファイルを選択します。
      3. プラグインの保存を促されたら、目的地がフィジーのインストールディレクトリ内のデフォルトのpluginsフォルダであることを確認し、「 保存」をクリックします。
      4. フィジーを再起動 してインストールを完了してください。
         注意:このコンパイル版プラグインはFijiの内蔵版と同一ですが、別途Java Development Kit(JDK)をインストールする必要がなくなり、セットアッププロセスが簡素化されています。
   2. 漂白補正とノイズ除去:
      1. Fijiを開いてから、Bio-Formatsインポータープラグインで各ファイルを開きます
      2. Bleach Correctionプラグインを実行し、Simple-Ratio bleach補正(背景=0)を使って時間経過による蛍光崩壊を補正します。
      3. カルマンスタックフィルターコンパイルド(acquisition_noise = 0.1; バイアス=0.7)を実行し、ランダムな光子ノイズを抑制しつつ、時間経過に伴う真の信号ダイナミクスを保持します
      4. 必要に応じて、処理時間を短縮するために生成された画像の時間次元をトリミングしてください。
         注意:これらのステップはノイズ除去画像を生成し、後にステップ1の終わり(4.1.5)でチャンネル1として表示されます(図3A)。カルマンフィルターのローリングウィンドウはこれらの初期フレームを部分的にフィルタリングするため、最初の5〜10フレーム(タイムポイント)は除外することが推奨されます。
   3. ガウス(DoG)の特徴強化の違い:
      1. 4.1.2.4の画像を2回複製します(画像を右クリックして複製をクリックします)。
      2. 低シグマ(σ=1)を使って1つのコピーにGaussian Blur Pluginを適用します。
      3. もう一方のコピーには高シグマ(σ = 8)を使ってガウスブラープラグインを適用します。
      4. プラグイン「Image Calculator」を開き、ローシグマ画像からハイシグマ画像を差し引く(=ロー – ハイ)して細かいディテールを分離します。
      5. 背景を除去するには、FijiのMath > Detractを使って、必要なら真の信号だけを保持する値(DoG閾値=100)を選択します。
         注意:これらのステップはガウス差分画像を生成し、後にステップ1の終わり(4.1.5)でチャネル2として現れます(図3B)。
   4. EB1-GFP信号強化:
      1. 4.1.2.4から画像を選択し、Resliceプラグインのtop、No interpolationの設定を使ってください。
      2. カーネル[–1 0 1]のConvolve 2Dプラグインを使ってMTのポイントを強化しましょう。
      3. 同じ設定で再びResliceプラグインを使って元の画像の寸法を復元してください。
      4. 注意:これらのステップでは、強化されたEB1-GFP信号を持つ画像が生成されます。この画像は後にステップ1の終わり(4.1.5)でチャンネル3として表示されます(図3C)。
      5. チャンネルをマージし、画像をエクスポートする:
         1. Merge Channelsプラグインを使って、MT EB1-GFPイメージ(4.1.2.4)をDifference of Gauss画像(4.1.3.5)、およびEB1-GFP信号強化画像(4.1.4.3)とマージします。統合作業中は、さらなる分析に使用する画像をチャンネル3に配置してください。
         2. 得られたファイルを「filename」という命名形式で保存し、.tifファイルとして保存します。_processed.tif。下流解析に使う画像が_processed.tifで終わるようにしてください。
2. 関心領域(ROI) - ステップ2
   このステップでは、卵母細胞の前後軸に沿って3つのROI(前方(ROI1)、中央(ROI2)、後方(ROI3)を定義します。この空間的分割を行うことで、卵母細胞の異なる領域にわたるMT動態の解析が可能になります。
   注意:このステップ2は_processed.tifマクロファイルFile_2_Step2_MTs_macro.ijm(補足コーディングファイル2)をフィジーにドラッグし実行することで実行できます。マクロはユーザーに卵母細胞内で手動で長方形を描くよう促します。多角形の開始点に最も近い領域(最初のクリック)が最初のROIに対応します。選ばれた長方形領域は自動的に等しい長方形のROIに分割されます。ROIが保存されない場合は、次のステップは画像全体で実行されます。
   1. ROIの定義:
      1. プラグイン → Bio-Formats → Bio-Formats インポーターでターゲットファイルを開きます。
      2. ポリゴンツールを使って、目的の領域にまたがる興味のある領域を描いてください。
      3. 選択した地域をROIマネージャーに追加してください(Tキーを押します)。
      4. 必要なROI数を4.2.1の手順で繰り返します。
   2. 測定および輸出面積:
      1. 最初のROIを選択してください
      2. Analyze → Measureを実行し、Areaの値を「filename」というファイルとして保存してください_processed_RoiArea.csv
         注意:ファイル名は元の画像名と一致し、最後には以下の_processed_RoiArea.csv
      3. ROIマネージャーを使ってROIを保存してください。同じファイル名を使ったら、単一のROIに対するROI延長、または複数ROIに対する.zip延長です。
3. EB1-GFP彗星の検出と追跡 - ステップ3
   TrackMateプラグイン²⁵ を使ってEB1-GFP彗星を検出し、その移動を時間経過で追跡できます。
   注意:各「ファイル名」にステップ3を適用するには_processed.tifマクロファイルFile_3_Step3_MTs_macro_tracking.py(補足コーディングファイル3)をフィジーにドラッグし、RUNボタンを押すことができます。次に処理するフォルダを選択します。ROIは自動的に読み込まれ、各ファイルごとに分析が行われ、対応するスポットおよびトラック出力が生成されます。バッチ処理の前に、2〜3枚の代表的な画像を分析し、デフォルトの検出器およびトラッカー設定が彗星のサイズや動態に適しているかを視覚的に検証することが推奨されます。設定が適切であれば、ユーザーは関連するパラメータを調整してEB1チップを正確に追跡でき、偽陰性や誤陽性を最小限に抑えることができます。
   1. Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importerを使ってターゲットファイルを開きます
   2. TrackMateプラグインを開いてください。TとZを入れ替えるよう求められたら「YES」を選びます。
   3. ログ検出器を選択します。粒子径を0.5μmに設定(必要に応じて調整)
   4. 品質閾値を30に設定してください(必要に応じて調整してください)。サブピクセルローカライゼーションとプリプロセッシングの両方を中央値フィルターで有効化します。
   5. 追加のスポットフィルターは除去してください。カルマン追跡法を選択してください
   6. 初期探索半径を0.5、探索半径を0.7、最大フレームギャップを2に設定します(必要に応じて調整してください。 初期探索半径 はトラッカーのシード、 探索半径 はフレーム間の移動距離を制御し、 最大フレームギャップ は軌道上の短い消失を可能にします)。
   7. 表示されるトラックのフィルタリングは省略してください。トラックが完成したら、「Spots → CSV にエクスポート」からファイル名を「filename」と名付けてください_ROI01_spots.csv
   8. 注意:ファイル名は分析したROIの数を反映すべきです。複数のROIを使用する場合は、_ROI01、_ROI02などの対応する識別子で各出力ファイルを保存します。
4. データ可視化と定量分析 - ステップ4
   Pythonスクリプトを使って追跡データを処理し、彗星の数、速度、寿命、角度の一貫性、方位などの主要パラメータを計算します。これらのスクリプトは、MTダイナミクスの定量解析を支援するために、要約表(CSVファイル)、プロット、統計解析を生成します(図4).
   1. ソフトウェア環境の設定:
      1. Python (3.12) ディストリビューションをインストールしてください。以下の外部Pythonライブラリがインストールされていることを確認してください( pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodelsノートブックを通じて): Pandas と NumPy (データ構造処理および数値計算用)、 SciPy と Statsmodels (特にscipy.stats、循環統計および仮説検定用)、 Matplotlib と Seaborn (バラグラフや統計棒グラフ生成用)、 IPython (ノートブック内の表示ツール用)、 Jupyter Notebook (ノートブック使用用)。
      2. カスタム解析モジュール(File_5_MTModule1.pyおよびFile_6_MTModule2.py – 補足コーディングファイル5および6)を解析ノートブック(ファイル4_Step4_MTs_results.ipynb – 補足コーディングファイル4)の隣にルートディレクトリに入れます。
      3. Python端末で「jupyter notebook」というコマンドを実行してJupyterノートブックを開き、ファイル4_Step4_MTs_results.ipynb – 補足コーディングファイル4ノートブックを読み込みます。
   2. 入力データとパラメータ定義:
      1. データベースを埋めて、生物学的複製を実験メタデータにマッピングします。
      2. 各実験ごとに以下の条件を提供します: ベース名: ファイル名に含まれる固有の識別子文字列、 状態: 実験グループ(例:「対照群」、「処理済み」)、 補正角度: ROIを生物学的軸に合わせるために必要な角度(例:前方=0°)。
      3. パラメータを調整してください:画像フォーマットとdpiのエクスポート、色のプロット、角度計算用のデフォルトビンサイズ
      4. データフィルタリングパラメータを短いトラックを除外する設定: 最小トラック長: この長さより短いトラックは破棄します
   3. 分析パイプラインの実行:
      1. すべてのコードセルを読み取り実行して、生の追跡データを処理します。スクリプトはデータベースリストを繰り返し、以下の手続き手順を実行します。
         1. 各Base Nameに関連付けられたROI固有のCSVファイルをすべて特定してください。
         2. 最小長に基づくフィルタートラック(3フレーム以上持続する軌道のみを保持)、瞬時速度の計算、総変位の計算、そしてすべての軌道に基準角度補正を適用します。
         3. 彗星の個数をROI面積(メタデータから読み込み)で正規化して彗星密度を計算します。
      2. 処理されたデータを集約してマスターデータセット(df_all)を作成し、各ROIごとに平均速度、トラック持続時間、角度一貫性ベクトル長などの一般的な要約統計を計算します。
      3. make_combined_rose_panel関数を実行して、バラの区画をグループ化します。これにより、各実験条件内のすべてのROIの角度分布を並べてパネル比較できます。スカラー指標用の棒グラフを作成するためにcreate_comprehensive_analysis_plots_enhancedを実行してください。
      4. 特定の方位解析を行うためにrun_angle_analysis_pipeline関数を実行します:
         1. トラックを2つの戦略で方向ビンに分類します:カーディナルビンニング(幅90°の4つのビン:北/前方、東/右、南/後方、西/左)と前方/後方ビニング(180°前方2つのビン vs 後方)。
         2. 卵母細胞ごとに定義された各向きで動くトラックの割合を計算します。
   4. 統計分析と成果生成:
      1. 定義されたスカラー指標を繰り返します:平均彗星数、平均彗星の軌道時間、平均彗星速度。各指標に対して、以下の機能を実行します。
         1. 実験条件間で独立した比較のために Kruskal-Wallis または Mann-Whitney U 検定を実施します。
         2. ROI全体の一貫性を評価するためにフリードマンテストやウィルコクソンテストを実施しましょう。
         3. 各ROI内の指向性の好み(例:北対南)を評価するために、フリードマンおよびウィルコクソン署名順位検定(プラット法を用い)を実施します。
         4. 以下の結果を結果ディレクトリにエクスポートしてください:まとめCSV(metrics_table.csv、track_table.csv、roi_metrics.csv)、統計レポート(例:平均彗星velocity_mwu.csv)、およびプロット(高解像度PNGファイル)。
            注意:ステップ4はPythonでのみ実行可能です。File_4_Step4_MTs_results.ipynbを開き、すべてのセルを読み込んで実行してください。各セルには実行命令と期待される結果が記載されています。

5. 統計分析:

注:追跡データの非ガウス分布のため、すべての比較に非パラメトリック統計検定が用いられました。

1. 実験条件間の独立差異(例:対照群と処理組)を用いて、Mann-Whitney U検定(2群)またはKruskal-Wallis検定を用いて評価し、その後に事後的なMann-Whitneyペアワイズ比較(>2群)を用います。
2. 同じROI内での指向的嗜好をフリードマン検定(グローバル差分)とウィルコクソン署名順位検定(ペアワイズ)を用いて評価します。
3. 差ゼロのタイはプラット法で処理します。
4. 統計的検出力を保つために、ペアワイズ比較は補正されていないp値として報告してください。提供されたスクリプトを使って生のp値と調整済みの両方を報告し、有意度は0.05に設定されます。特に注記がない限り、すべての要約統計は平均±標準誤差(SEM)として報告してください。

Results

このプロトコルは、活性MT重合部位を示すプラスエンドトラッキングタンパク質EB1-GFPを用いて、卵形成中期におけるショウジョウバエメラメラノガスター卵母細胞のMT成長動態と極性解析に成功裏に用いられました^17,18。レーザー走査共焦点顕微鏡で画像化すると、EB1-GFPは^MT成長の方向に沿って動く明るく点状の「彗星」として現れ^ます(図3A;補足映像1)。これらの彗星を追跡・定量化することで、MTの核生成、伸長、卵母細胞内の組織化を正確に評価できます。このワークフロープロトコルを用いて、対照卵母細胞およびMTネットワークの実験的摂動を受けた卵母細胞のMT動態を評価しました。具体的には、EB1コメットの挙動は、未処理対照卵母細胞、冷処理対照卵母細胞、冷処理ヘテロ接合体pアトロニン変異卵母細胞の3つの条件で比較されました^12,26。冷却処理はMTの脱重合を誘導し、回復中のMT再生の評価を可能にします。ヘルテロ接合型pアトロニン変異体(+/patr⁰⁵²⁵²)卵母細胞をMT動態障害の正の対照群として含めました。パトロニンは保存されたMTマイナス端安定剤²⁷であり、卵母細胞^{12およびその他の組織における}ncMTOCsのコア成分です。以前の研究では、MT脱重合を受けたパトロン変異体は再生後にEB1彗星の数が有意に減少することが示^{されました。}したがって、ヘテロ接合型パトロニン変異体を含めることで、既知のMT再成長異常背景に対してこの手法の検証が可能となりました。ステージ7〜8の卵母細胞は、中心体が減弱され、アセントロソーム経路を介してMTが生成される状態で画像化されました。

前回の観測と一致し、EB1彗星の最も密度が高いのは卵母細胞の前方領域で検出され、後方に向かって徐々に減少してい^った(図5B;表1;補足表1および表2)。正真正銘のMT重合イベントと定常または面外信号を区別するために、このプロトコルは検出されたEB1-GFP焦点の総数と運動性のある焦点のサブセットを区別します。不動の部分は、主に軸面を移動する静止彗星や彗星を表していると考えられます(図5A,B)。MTの走査長と成長速度の解析は、移動中のEB1-GFP彗星のみで行われ、軌道長や速度の推定を妨げる静止信号や軸方向の動きの含み込みを避けるため行われました。EB1-GFPの総焦点と運動率は別々のプロットで示され、全体の検出と動的挙動を直接比較できるようにしています(図5A,B)。対照卵母細胞では、前方領域で0.189±0.02 SEM EB1運動性コメット/^μm²(18.9 EB1コメット/100 μm²)が測定され、続いて中央および後方^領域で0.064 ± 0.02 SEMおよび0.043 ±0.01 SEM EB1運動性コメット/μm²(6.4および4.3 EB1 comets/100 μm²)が測定されました(図5B;表1;補足表1および表2)。同じ発生段階のEB1彗星を測定した²⁸個の研究では、100μm^²あたり48.54個のEB1彗星を検出しており、これは運動性のあるEB1-GFP彗星で検出された数値よりも高い数値です。しかし、測定値は検出されたEB1-GFP彗星の総数を考慮すると一貫しています(図5A;表1;補足表1および表2)。その研究の材料と方法のセクションでは、卵母細胞の画像化に使われたzスタックの数は明記されていません。したがって、分析に複数のzスタックが含まれていた可能性があり、これがEB1-GFP彗星の検出数増加に寄与した可能性があります。報告値に影響を与えるもう一つの要因は、彗星定量化のために選ばれた卵母細胞の領域です。もし関心のある領域がEB1彗星密度が最も高い最も前方の極に近い場所を選んでいれば、ここで示した測定値と比べて平均的な彗星密度が増加した可能性があります。それでも、ここで得られた結果は同じ桁違いであり、以前に報告された^14,15と同様にEB1彗星密度が後方領域に向かって減少していることを一貫して反映しています。

寒冷誘発性MT再成長後、対照卵母細胞は未処理対照群と同等のEB1彗星数を示し、MT回復が強力であることを示しました。これに対し、前述報告¹²と一致し、パトローニン変異体は両対照群と比較して前方領域(ROI1)における運動性EB1彗星の数が有意に減少しました(図5B;表1;補足表1および表2)。中央および後方領域(ROI2および3)の彗星数も減少傾向を示しましたが、これらの差は統計的に有意ではありませんでした(図5B)。ここで観察された減少は、ノコダゾール系アッセイ¹²で報告されたものよりも顕著ではありませんでした。これは、1つの対立遺伝子のみが変異するヘテロ接合型パトロニン変異体の使用を反映していると考えられます。さらに、冷却誘導脱重合プロトコルはすべてのMTを完全に脱重合できない可能性があり、氷からの除去と画像取得までの5〜15分の間隔は、データ取得前にMTの核生成と再成長をある程度可能にしている可能性があります。これに対し、ノコダゾール系アッセイは、コルセミド不活化直後に顕微鏡UV^{レーザー12}を用いて実施されます。それにもかかわらず、これらの結果は、このプロトコルがMT組織における生物学的に関連性のある領域特異的変化を検出できることを示しています。また、卵母細胞前方のncMTOCsおよび中心的なncMTOC成分であるパトロニンの濃縮とも一致します。中部および後部領域における彗星数の減少が弱いのは、これらの段階でncMTOCsとパトローニンが後皮質から発達的に除外されていることを反映している可能性^{もあります。}

対照卵母細胞におけるEB1トラック長の解析により、卵母細胞前方領域の彗星軌道が長く(0.613 μm ± 0.04 SEM)、中部および後部領域では彗星が短い(それぞれ0.463 μm ±0.04 SEM、0.488 μm ±0.05 SEM)が明らかになりました(図5C;表1;補足表1および表2)。この発見は、MTが前極よりも後極で短く持続するという従来のデータと一致しており、後極のMTは¹⁴より短いことを示唆しています。冷処理ヘテロ接合パトローニン変異卵母細胞では、EB1彗星長は冷処理対照群と比較して前方および後方領域で有意に減少しました。中央領域でも同様の統計的に有意でない傾向が観察されました(図5C;表1;補足表1および表2)は、MT安定性の部分的な低下を示唆しています。これらの結果を総合すると、パトロニンがマイナスエンドMT安定剤として既知の役割を果たすことを支持し、パトロニンの喪失によりMT紡錘が短くなるというショウジョウバエ培養細胞での過去の観察とも一致しています^12,27。これらの発見はまた、MTダイナミクスにおける微妙ながら生物学的に意味のある摂動を検出するこのプロトコルの感度も浮き彫りにしています。

対照卵母細胞でEB1彗星速度を測定した際、前方、中部、後方領域で平均速度は0.208±0.01μm/sec、0.207±0.01μm/sec、0.202±0.01μm/secを記録しました(図5D;表1;補足表1および表2)と一致し、これは前の研究^14,15と整合しています。対照卵母細胞では、前方から後方にかけてMTの成長速度がわずかに低下しました。これは、前外側領域におけるncMTOCsおよび他の未同定微小管関連タンパク質(MAPs)の濃縮を反映しており、MTの成長と伸張を促進し、観察される後方減少に寄与している可能性があります。冷処理された卵母細胞において、パトロニンヘテロ接合変異体は対照群と比較してMTの成長速度がわずかに低下する傾向を示しましたが、この差は統計的有意には達しませんでした(図5D;表1;補足表1および表2)。この発見は、パトロニン変^異体を発現するショウジョウバエの神経幹細胞での以前の観察と一致しています。

ncMTOCsが卵母細胞の前外側領域に局在し、後方から除外されることで、ほとんどのMTはマイナス端が前外側皮質に固定された状態で成長します。その結果、卵母細胞内でMTの前後勾配が確立され、わずかな方向バイアスが見られます。例えば、60%が後方に、40%が前方に成長^します。私たちのプロトコルは、卵母細胞のすべての領域にわたるコントロール卵母細胞におけるこのバイアスを成功裏に検出しました(図5E)。MTの向きの偏りは後方領域でより顕著で、以前に報告された¹⁴です。特筆すべきは、この後方の方向バイアス強化は、対照群およびヘテロ接合パトロニン変異卵母細胞の冷処理後に失われたことです(図5E,F)。冷処理された対照卵母細胞では、MTの配向が全領域で前方方向にシフトしました。この変化は前方および中央領域で傾向として現れ、後方領域では統計的に有意なものとなりました(図5F)。後方側へのバイアス喪失の一つの可能な説明は、冷処理条件下で新たに重合したMTがMTの安定化や架橋を促進するモータータンパク質などのMAPと結合するのに時間が必要になる可能性があることです。これらの因子のリクルートが遅れると、後方指向型MTの強化が損なわれる可能性があります。まとめると、このプロトコルは卵母細胞内のMTの成長、長さ、速度、向きを感度かつ定量的に解析することを可能にします。従来の研究と同様に、MT動態の領域特異的かつ生物学的に意味のある変化を確実に検出し、ヘテロ接合pアトロニン変異体での観察に見られるように、MT挙動の微妙な違いを解消する感度を示しています。

図1: ショウジョウバエの 卵形成 (A)ショ ウジョウバエ 卵巣における卵形成の概要。 各子巣には12〜16個の卵巣があり、卵子の生産ラインとして機能します。卵形成は生殖器内で始まり、2〜3個の生殖細胞細胞が非対称に分裂し、幹細胞と分化を始める娘細胞を作り出します。これらの細胞は4回の有糸分裂を経て、環状管でつながれた16細胞の嚢胞を形成します。これらの細胞から1つが卵母細胞となり、他の細胞はナース細胞として機能し、卵母細胞の成長と発達を支え、後方のステージ14卵母細胞に至ります。 (B) ステージ9ショ ウジョウバエ 卵室のスキーム。MTは前外側皮質に局在するncMTOCsから生成され、卵母細胞¹²の後方側から除外されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:プロトコルワークフロー図。 卵巣剥離やライブイメージングから彗星追跡および定量解析までの主要なステップの概要。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:ステージ7–8の卵母細胞処理によって生成された代表的な画像。 (A-E)ステップ1での画像処理ワークフローを示す代表的な画像。対照群、冷処理された対照群、ヘテロ接合 パトロン⁰⁵²⁵² のステージ7–8卵母細胞に適用。チャンネルは、1フレームあたり0.5秒で取得された150フレームのタイムラプス映画から最大2フレームの投影から代表的な画像です。 (A) チャネル1は、対応する画像化された卵母細胞からノイズ除去画像を生成するものです。(B) チャネル2はガウス像の差分生成に対応します。(C) チャンネル3は、EB1-GFP彗星の信号が強化され、彗星の先端が見える画像生成に対応します。(D) チャンネル2とチャンネル3の統合。これにより、チャネル2の処理による彗星の先端を可視化するのに役立つ。(E) フィジーのタイムラプスCから生成された時間経過Cから生成されたEB1-GFP彗星の軌道を、Temporal Colorコードプラグインを用いてMTの動態を示す。色コードは20フレーム(フレーム間0.50秒)の時間投影を示します。スケールバー=10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4:STEP 4 Jupyter Notebookのセクションのスクリーンショット。 ノートブックはMarkdownセルで構成されており、説明不要の指示を提供し、その後にリアルタイムの結果やログを出力するコードセルが続きます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図5:制御および冷処理されたステージ7-8卵母細胞におけるEB1-GFP彗星動態の解析。 データは対照、対照、冷処理済み、パトロンニン⁰⁵²⁵²の冷処理卵母細胞の±平均SEM1/ROI(ROI1–ROI3)を表しています。EB1-GFP彗星の測定は、フィジーで処理されたタイムラプス画像から得られました。特に明記がない限り、解析はチャンネル3で処理された画像に対して行われました。チャンネル2画像(DoG画像)からEB1-GFP彗星数の総数が解析されました。統計的有意性は、必要に応じてKruskal–Wallis検定の後にMann–Whitneyの事後比較、またはFriedman検定の後にWilcoxonマッチペア検定を用いて評価されました(p < 0.05; p < 0.001;p < 0.0001)。(A) EB1-GFP彗星の平均数を示す散点図。(B) 運動性EB1-GFP彗星の平均数を示す散布点図。(C) EB1-GFP彗星の平均軌道長を示す散乱点図。(D) 平均的なEB1-GFP彗星速度を示す散乱点図。(E) ROI1–ROI3におけるEB1-GFPトラックの配向を示すローズプロット(対照群 n = 14)、対照冷処理(n = 12)、およびパトロンニン05252 冷処理(n = 11)卵母細胞内の方向を示す。 各疾患とROIは、前方(A)または後方(P)方向に向けた各卵母細胞あたりの平均割合を示しています。(F) EB1-GFP彗星の軌道角度の平均パーセンテージを示す棒グラフ。卵母細胞の前端および後方側に向かっての角度。パーセンテージは卵母細胞ごとに計算され、各ROI内で彗星の方位の相対的分布を表しています。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

メートル法	ROI	制御(n=14)	制御の冷処理(n=12)	パトロニン05252 冷処理(N=11)
EB1-GFP彗星の総数(#/μm²)	ROI 1(前方)	0.667 ± 0.18	0.691 ± 0.20	0.570 ± 0.17
	ROI 2(中間)	0.394 ± 0.11	0.532 ± 0.15	0.400 ± 0.12
	ROI 3(後方)	0.353 ± 0.09	0.561 ± 0.16	0.378 ± 0.11
モタイルEB1-GFP彗星番号(#/μm²)	ROI 1(前方)	0.189 ± 0.02	0.175 ± 0.03	0.099 ± 0.03
	ROI 2(中間)	0.064 ± 0.02	0.091 ± 0.02	0.056 ± 0.02
	ROI 3(後方)	0.043 ± 0.01	0.104 ± 0.03	0.047 ± 0.02
EB1-GFPコメットのトラック長(μm)	ROI 1(前方)	0.613 ± 0.04	0.621 ± 0.03	0.478 ± 0.07
	ROI 2(中間)	0.463 ± 0.04	0.535 ± 0.03	0.410 ± 0.05
	ROI 3(後方)	0.488± 0.05	0.543 ± 0.04	0.393 ± 0.05
EB1-GFP彗星速度(μm/sec)	ROI 1(前方)	0.208 ± 0.01	0.198 ± 0.01	0.188 ± 0.01
	ROI 2(中間)	0.207 ± 0.01	0.199 ± 0.01	0.186 ± 0.01
	ROI 3(後方)	0.202 ± 0.01	0.194 ± 0.01	0.177 ± 0.01

表1。 解析した卵母細胞における前方-後方領域におけるEB1-GFP彗星測定の要要。 測定値は対照群、対照冷処理済み、ヘテロ接合 パトロン⁰⁵²⁵² 冷処理卵母細胞から得られた。関心領域はROI1(前方)、ROI2(中央)、ROI3(後方)と定義されました。

補足表1。実験条件間のEB1-GFP彗星測定の統計的解析。 P値は、対照群、対照冷処理済み、ヘテロ接合パ トロンニン⁰⁵²⁵² の各ROI(ROI1-ROI3)の違いを示します。3つの条件間のグローバル比較はKruskal–Wallis検定を用いて行われ、その後ペアワイズのMann–Whitneyの事後比較が行われました。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足表2。各実験条件内のROI間のEB1-GFP彗星測定の統計比較。P値は 、対照群、冷処理された対照群、ヘテロ接合 パトロン⁰⁵²⁵² の冷処理卵母細胞内で、ROI1(前方)、ROI2(中間)、ROI3(後方)の差異を示します。各条件内のROI間の全体的な差はフリードマン検定を用いて評価されました。その後、ウィルコクソンマッチペア符号付きランク検定を用いてROI間のペアワイズ比較を行いました。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足映像1。 コントロールステージ7–8の卵母細胞におけるプラスエンドトラッキングタンパク質EB1-GFPのタイムラプス画像で、後のMTトラッキング解析に適した代表的な獲得を示しました(図3参照)。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル1: File_1_Step1_MTs_macro.ijm。画像前処理用のFiji/ImageJマクロ。これは、ガウス差分(DoG)フィルターを用いて、光漂白補正、カルマンフィルタリング、背景減算を自動化します。また、時間的グラデーション(リスライシングや1次元畳み込み)を施し、MTチップの先端をシャープ化し、トラッキングの忠実度を向上させます。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル2: File_2_Step2_MTs_macro。ijm。Fiji/ImageJのマクロで、半自動化された関心領域(ROI)定義のためのものです。ユーザーに卵母細胞境界の定義を促し、選択を自動的に等距離ゾーン(例では前部、中央部、後部の3つのゾーン)に分割して解析の地域的層化を可能にします。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル3: File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py。Fiji/ImageJ内で実行されるPythonスクリプトで、Trackmateを使ってEB1彗星の自動追跡を行います。前処理画像をバッチ処理し、定められた品質パラメータで彗星を検出し、軌道にリンクさせ、生の座標データをCSVファイルとしてエクスポートします。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル4: File_4_Step4_MTs_results.ipynb。定量分析の主要なインターフェースとして機能するJupyterノートブック。生の追跡データを読み込み、分析パイプラインを実行し、バラプロット、統計要約表、彗星の密度、速度、寿命の比較チャートを含むすべての最終出力を生成します。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル5: File_5_MTModule1.py。データ抽出や基本的な幾何学計算に使われる基礎的なユーティリティ関数を含むカスタムPythonモジュールです。ROIファイルの検索、瞬時速度の計算、基本的な角度変位の計算などの機能が含まれています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル6: File_6_MTModule2.py。高度な分析および可視化機能を備えたカスタムPythonモジュール。このデータベースには、方向分析パイプライン(基数対軸方向のビニング)、ロバスト統計的検定(Friedman/WilcoxonによるPratt法)、そして論文品質の極座標(バラ)プロットの生成アルゴリズムが収められています。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

補足コーディングファイル7: File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar。前処理マクロのノイズ低減ステップには、Fiji/ImageJ用のコンパイル済みJava Kalman Filterプラグインが必要です。このスタンドアロン版は、別途Java開発キット(JDK)を不要にし、ユーザーのソフトウェア設定を簡素化します。 このファイルをダウンロードするには、こちらをクリックしてください。

Discussion

卵母細胞におけるMT動態のライブイメージングは、高品質なデータセットと定量解析が意味のある情報を抽出するために必要とされるため、独自の課題を伴います。過去の研究ではライブイメージングアプローチ^14、15、16が報告されていますが、画像解析の手順はしばしば高度にカスタマイズされており、プロトコルは再現性に十分な詳細を提供していません。そのため、広範な画像診断や計算技術の専門知識がない研究者は、これらの解析を再現する際に障壁に直面する可能性があります。これらの課題に対処するため、高解像度のAiryscanライブイメージングとユーザーフレンドリーな自動マクロやスクリプトを組み合わせた効率的なワークフローが開発されました。このパイプラインにより、EB1彗星の効率的な検出と追跡が可能となり、その後MTの向き、速度、空間的組織の定量的解析が可能となります。手動介入を最小限に抑え、明確で段階的な指示を提供することで、このワークフローは卵母細胞におけるMT動態解析のアクセス性と再現性を促進します。

卵巣の解離とサンプル準備は重要な第一歩です。卵母細胞は機械的損傷を避けるために慎重に解剖し、画像診断時間は^{生存率を維持する}ために90分に制限すべきです。ステージ選択は重要で、卵形成の途中以降、卵母はサイズが大きくなり、細胞質に卵黄が蓄積されるため、ステージ9以降はEB1シグナルの可視化がますます困難になります。したがって、ステージ9以降の画像検査^{は推奨されません}。また、再現可能な定量化のためには、可能であれば同等の大きさの卵母細胞が望ましい。これにより、定義された関心領域がサンプル間の前後位置が同等であることが保証される。

温度管理は再現性に不可欠です。フライストックは標準培養条件(25°C)で維持し、正常な発育とEB1-GFP発現の一貫性を支持するべきであり、特に温度変動に敏感なGAL4/UASシステムを使用する場合はそうです。画像撮影中の温度安定性も同様に重要で、変動はMTのダイナミクスに影響を与えることがあります。温度制御チャンバーは必須ではありませんが、取得時の温度変動を避けることが推奨されます。

画像取得には、高感度と向上したSNRを持つアレイ検出器共焦点イメージングが選ばれ、取得後のノイズ除去の必要性を最小限に抑えました。高開口レンズ(可能な限り高)と適切な屈折率のマッチングを組み合わせることで、横方向および軸方向の分解能を最大化し、密なネットワーク内の個々の彗星を解像する上で重要です。さらに、彗星追跡の精度低下を避けるために、XYZおよび時間でナイキスト・シャノン³⁰ のサンプリング基準に従うべきです。同様に重要なのは、z軸に沿ったイメージング面の慎重な選択です。深すぎる撮影は光散乱による蛍光損失を引き起こし、皮質表面に限定するとEB1彗星の完全な動態を捉えられません。最も有益なデータは中間のz位置で得られます。核が選択した平面内にある卵母細胞は避けるべきです。なぜなら、核区画は細胞質の大部分を置き換え、EB1トラックを欠いているため、検出可能な彗星の数が減少するためです。

アレイ検出器ベースの共焦点イメージングに最適化されていますが、この解析パイプラインはハードウェアに依存しず、スピニングディスク共焦点顕微鏡など他のモダリティとも互換性があります。ただし、NAやSNRが低いシステムは、マクロの前処理パラメータ(例:ノイズ耐性/DoGシグマ)の調整が必要となり、本研究で示された値と比べて彗星検出密度が低下する可能性があることに注意が必要です。それでも、絶対値はシステム間で異なる場合がありますが、実験条件とROIとの間で観察される相対的な傾向は、予想通り堅牢なまま維持されます。

卵母細胞の大きな3D構造を考慮すると、2DイメージングはMTネットワークの光学的断片のみを捉えます。その結果、z軸に沿って急激に動く彗星は焦点面を離れることがあり、速度ベクトルのxy成分のみが測定されるため、軌道寿命や絶対速度が過小評価される可能性があります。しかし、卵母細胞全体の高速3Dボリューメトリックイメージングは、視野角(FOV)を小さく、露光時間を短縮し、検出器の応答速度を短縮するため、SNRを低減し、複数のzスライスに取得時間を分散させることになり、急速なEB1彗星の追跡に必要な時間的解像度が損なわれます。動かない彗星やピントの合わないアーティファクトを軽減するために、焦点面を通過する過渡的なスポットを除去するために畳み込みフィルターと最小トラック持続時間フィルター(3フレーム<のトラックを除く)が適用されました。さらに、この幾何学的制限は実験条件全体で一様に適用されるため、彗星の密度、速度、方位の相対的な差は依然として堅牢です。光場顕微鏡のような新興技術は理想的には完全な3D構造を同時に捉えるべきですが、まだ広く利用できていません。それでも、すべてのMT動態パラメータで測定された値は以前の報告と整合しており、このプロトコルが異なる実験環境でのMT動態の調査に適していることを示しています。

このプロトコルのマクロを使用する前に、ソフトウェアパラメータが正しく最適化されていることを確認するために、最初の数枚の画像を手動で処理することが推奨されます。画像解像度、倍率、信号対雑音比、フレームレート、データが単一平面かzスタックかなどの要因がトラッキング精度に影響を与えます。パラメータを反復的に調整しながら、結果のトラックを視覚的に確認し、偽陽性や偽陰性を最小限に抑える。最適化が完了したら、再現性を確保するためにデータセット間でパラメータを一貫して適用します。

最後に、生物学的解釈に関するいくつかの制限に注意すべきです。EB1-GFPは成長中のMTプラス末端を選択的に標識するため、MT全体ではなく活性なMT重合部位を報告します。画像期間中に存在する安定で非重合性のMTは、この方法では検出されません。この制限は、MTの大多数が非常に動的である中卵形成卵母細胞では制限が緩やかですが、^{ニューロンのように}MT集団が安定している他の細胞タイプにプロトコルを適用する際には考慮すべきです。

結論として、このワークフローによりショ ウジョウバエ 卵母細胞のMT動態の高解像度定量解析が可能になります。最適化された解剖、アレイ検出器の共焦点ライブイメージング、自動解析ツールを統合することで、アセントソームの文脈でMT調節因子を研究するための厳密かつアクセスしやすい方法を提供します。主に卵母細胞で検証されていますが、このアプローチの原理は最適化によりニューロンや上皮細胞のような非分裂細胞など他の細胞タイプにも応用可能であり、遺伝子スクリーニングやMT組織の機構的メカニズム研究のためのスケーラブルなプラットフォームを提供します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンスツール	11252-20
EB1::GFP	フランス、CNRS、ジャック・モノー研究所、アントワーヌ・ギシェ博士より		遺伝子型:w;+/CyO;UASp-EB1::GFP/TM3
ガラス底ペトリ皿	マットテック	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	7062	遺伝子型:w[*];P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
オイル10S、VOLTALEF	VWRケミカルズ	24627.188
パトローニンミュータント	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	16647	遺伝子型:y[1] w[67c23];P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
W1118	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター	3605
ツァイスLSM 980(エアリスカン2搭載)	ツァイス