外傷性軟部組織欠損の再建のためのSVF濃縮微小脂肪の機械的処理

Summary

このプロトコルは、自家脂肪組織から機械的に処理されたSVF濃縮マイクロ脂肪を製造し、それを空洞型外傷性軟部組織欠損に注入して臨床再建を行う再現可能な方法を説明しています。

Abstract

外傷性軟部組織欠損は、組織の喪失、血管の障害、持続的な被覆の困難さにより再建に大きな課題をもたらします。脂肪組織は実用的な自己組織源を提供し、酵素消化なしで機械的に処理された間質血管分数(SVF)濃縮微量脂肪を術内で調製できます。
本研究は、自己脂肪組織を採取し、それをSVF強化マイクロ脂肪として処理し、空洞型外傷性軟部組織欠損に注入するための標準化された臨床プロトコルを提示します。脂肪は太ももまたは腹部から低陰圧で手動で採取され、切断および注射器から注射器への乳化によって機械的に断片化され、均一な微量脂肪濃度を得るためにろ過され、遠心分離でSVF含有分画を分離します。加工された微量脂肪は多層状に傷口腔全体に注入されます。術後評価には、連続的な臨床評価、写真記録、上皮化までの創傷面積縮小の測定が含まれます。
小規模なコホートでは、この方法は約4〜8週間以内に創傷の進行性収縮と完全な上皮化と関連があり、重大な合併症はありませんでした。細胞組成や生存可能性は定量化されませんでしたが、この技術は酵素処理や実験施設が利用できない環境に適した術中アプローチを提供しました。このプロトコルは、SVF濃縮マイクロファットを最小限に操作で投与する実用的な方法を提供し、外傷性空洞型欠損の管理に用いられ、今後の管理研究の基盤となる可能性があります。

Introduction

外傷性腔洞型軟部組織欠損は、組織の喪失、局所灌流の障害、感染および死空間形成の高いリスクが組み合わさるため、依然として大きな再建上の課題となっています。従来のカバー技術、例えばスプリット厚皮膚移植やフラップ移植は、多くの場合耐久性のあるカバーを提供します。しかし、特に汚染または瘢痕のあるベッドでは、ドナー部位の入院率、技術的複雑さ、長期的な転帰の変動により制限される^{ことが多いです。}

脂肪組織は、間質血管分画(SVF)と呼ばれる異質な細胞集団の豊富で容易にアクセスできる供給源です。SVFには間葉間質細胞、内皮前体細胞、周囲細胞、および支持する間質素が含まれています。脂肪組織粒子内に保持されると、SVFの本来の細胞外環境は取り扱いや臨床投与の過程で保持されます⁴.臨床的には、SVFに濃縮された脂肪移植片(SVF強化微小脂肪)は移植片保持を改善し、さまざまな適応症で創傷上皮化の加速と関連していることが報告されています^5,6,7。

リポスピレートからSVFを得る主な戦略は2つあります。酵素的消化は通常、単位体積あたりの核細胞数が増加しますが、専用試薬、実験室インフラ、処理時間の延長が必要であり、多くの法域で規制制限の対象^{となります。}これに対し、機械的処理方法には切断、注射器間乳化、ろ過、閉鎖系機械装置の使用が含まれます。これらのアプローチにより、最小限の操作で迅速な術中準備を可能にし、6^、9、10、¹¹の短いターンア^{ラウンド時間が}短縮されます。最近の機械システムでは処理時間<15分、一部のシリーズでは酵素法に近い収率が報告されていますが、測定された細胞数や生存率は装置やオペレーター^{によって異なります。}

機械的に処理されたSVFや慢性潰瘍や糖尿病性足疾患に対する脂肪移植に関する文献が増えているにもかかわらず、虫歯型外傷性軟部組織欠損に特化した標準化され再現可能なプロトコルは稀です^7,12。発表された臨床報告では、慢性潰瘍、糖尿病創、または美的脂肪移植について一般的に扱われています。しかし、収穫パラメータ、乳化エンドポイント、ろ過孔径、遠心分離力(×g)、創傷面積あたりの投与量、外^{傷環境での}注射準備基準を指定した術中段階プロトコルを提供するものはごくわずかです^7,13。

したがって、このアプローチを検討する外科チームにとって、実践的な適用性の指針が重要です。利用可能な文献と手術経験に基づくと、単一空洞の典型的な術中吸引量は~20〜40 mLです。この量は一般的に、小から中程度の虫歯を満たすのに十分な加工済み微小脂肪を得られます。一方、大量の再建はポイント・オブ・ケアの機械的処理の範囲外であり、段階的な処置や代替戦略が必要になる場合があります(^9,12)。また、感染が制御されるまでは重度に汚染された創傷には機械的SVFアプローチが適していません。このような場合、結合前に補助的なデブリードメントおよび感染管理(標的抗生物質および適切な場合は陰圧創傷治療を含む)を行うべき^です。

本研究は、SVF濃縮マイクロ脂肪を機械的処理で調製し、この製品を空洞型外傷性軟部組織欠損に注入するための詳細かつ再現可能な術中プロトコルを提供することを目的としています。プロトコルは明確な運用パラメータ(収穫、機械的断片化および乳化、ろ過、遠心分離(× gで表される)、注射技術、客観的な創傷面積測定)を強調しており、他の外科チームが自社の環境でこの方法を採用し検証できるようにしています。

Protocol

すべての手続きは機関倫理委員会(承認番号)によって承認されました。KL-2025062)およびヘルシンキ宣言に従って実施されました。参加前にすべての患者から書面によるインフォームド・コンセントが取得されました。

1. 患者選択および術前評価

1. 十分な外科的デブリードメント終了後に再建介入が必要な虫歯型外傷性軟部組織欠損を呈する成人患者を対象とします。
   注意:欠損は周囲に生存可能な組織があるはっきりとした空洞を示し、再建時に壊死が進行していない必要があります。
2. 活動性全身感染または制御不能な局所創傷感染、不十分にコントロールされた糖尿病(治療にもかかわらず持続的にHbA1c>8%)、関与肢に影響を及ぼす重大な末梢血管疾患、既知の凝固障害または安全に中断できない現在の抗凝固療法、欠損部位に関わる悪性腫瘍、術前評価で判断された脂肪吸引や麻酔の禁忌症患者は除外します。
3. ベースラインデータ収集および創傷評価を行う
   1. 年齢、性別、創傷の位置、損傷のメカニズム、損傷から再建までの期間などの基礎的な患者特性を記録します。
   2. 標準的な創傷準備の後に創傷評価を行います。無菌定規を使って、最も広い部分で傷の長さと幅を測ってください。一定の距離と向きを持つ標準的なデジタル写真を取得します。校正済み写真に基づくプラニメトリック解析(ステップ6.6参照)を用いて創傷面積(cm²)を計算します。
4. 術前カウンセリングを提供しましょう。手順、期待される利益、潜在的リスク(感染、脂肪吸収、追加処置の必要性など)、術後のケア要件、フォローアップスケジュールを患者に説明してください。
5. 手術前に理解を確認し、書面によるインフォームドコンセントを取得してください

2. 術前準備

1. 無菌機器の準備
   1. 必要な滅菌機器を準備します。これには、脂肪吸引カニューレ(直径2-3mm、鈍先端)、ルアーロック注射器(容量10〜20mL)、注射器間移送用の滅菌ルアーロックコネクター、外科用ハサミ、鈍先端注射カニューレ(22G×50mm)が含まれます。
   2. 使用前にすべての機器の完全性と無菌性を確認してください。
2. 膨潤液の調製と浸透
   1. 0.9%の生理食塩水を1,000mLを滅菌容器に抽出します
   2. 1:1,000エピネフリンを2mL加えて、最終濃度1:500,000にします。無菌環境で十分に混ぜてください。
   3. 溶液をルアーロック注射器に2〜3メートルの鈍い浸透カニューレで接続します
      注:リドカインは意図的に省略されており、別々の用量管理麻酔を可能にしています。
   4. 溶液を皮下ドナー部位(例:腹部や太もも)に、深い面から浅い面へゆっくりと扇形のパスで注入します。
   5. ドナー部位の表面積と予想される脂肪吸引液の量に応じて総体積を調整してください。
   6. 組織が均一な膨大と血管収縮を示すまで浸潤します。
   7. 浸潤後10〜15分待って最大限の血管収縮を経てから収穫してください。注:エピネフリンは術中の出血を減少させ、脂肪の収穫を促進します。リドカインを省略することで安全な麻酔用量の超過を防ぎ、局所麻酔または局所麻酔を別途行うことができます。
3. 麻酔の投与
   注意:麻酔は腫起液とは別に投与され、欠損の大きさ、ドナー部位、患者耐性に基づいて選択されます。欠損の大きさ、ドナー部位、患者寛容度に基づいて、以下の麻酔アプローチのいずれかが選択されます。
   1. 局所浸潤(フィールドブロック):鈍い先端(22G×50mm)カニューレを用いて、0.5〜1%リドカインをエピネフリン1:200,000で浸潤させます。ドナー部位に供給する感覚神経の周囲に放射状に広がっています。ドナー部位操作や膨潤浸潤の前に、完全な麻酔効果を得るために5〜10分の間隔を空けてください。
      注:最大用量:エピネフリンを併用したリドカイン7 mg/kg、患者体重および併存疾患に合わせて調整済み。
   2. 局所麻酔(任意):ドナー部位に基づく超音波誘導末梢神経ブロックを使用します。標準ガイドラインに従って投与されたブピバカイン(0.25-0.5%)またはロピバカイン(0.5%)を使用してください。収穫前にブロックの開始(10〜20分)を確認してください。
   3. 全身麻酔:大きな欠損や複合手術に限定されます。施設プロトコルに従い、標準的なモニタリングを行いましょう。
      注意:浸潤したすべての溶液からの全身エピネフリン総量が臨床的安全基準内に収まっていることを確認してください。

3. 脂肪収穫

1. 以下の基準に基づいてドナー部位(腹部および/または外側太もも)を選択してください
   1. 輪郭変形なしに十分な採取を可能にする十分な皮下脂肪組織の確保
   2. 局所的な瘢痕、感染、または組織の質を損なう可能性のある過去の手術がないこと。
   3. 患者のアクセス性と手術台上の位置が無菌浸潤と吸引を可能にすること。
      注:十分な組織と最小限の既往外傷のある部位を選ぶことで、脂肪の収穫が安定し、手技上の合併症が軽減されます。
2. No.11メスを無菌環境で使い、2〜3mmの皮膚切開を行います。表皮と真皮を切開し、筋膜や筋肉の深層を貫かずに皮下層まで切開します。
3. 瘢痕を最小限に抑えるために、小さくコントロールされた切開を行ってください。
4. 2-3mmの脂肪吸引カニューレを10-20 mLのルアーロック注射器に取り付けます。
5. カニューレは皮膚切開部から皮下脂肪層に挿入し、下部筋膜の浅い位置に置きます。
6. カニューレを対象の皮下面全体に均等に分散させるために、優しく多方向に動かしてください。
7. シリンジプランジャーを優しく引き抜いて、脂肪組織を吸引するために手動で低圧の負圧をかけます。
8. 脂肪由来細胞への機械的外傷を最小限に抑えるために、強い吸引は避けてください。
9. 小さく制御されたアリコットで吸引を続け、カニューレを皮下層内で再配置して収穫効率を最大化します。
   注意:細胞の生存を維持するためにシリンジは室温(20〜25°C)に保ってください。
10. 欠損の大きさに合わせて約20〜40 mLのリポアスプレーートを採取します。
11. 吸引後はカニューレを外し、皮膚切開部を3-0または4-0ナイロン縫合糸で閉じるか、小さな刺し傷には滅菌接着ストリップを使用します。ドナー部位に滅菌ドレッシングを塗布します。
12. 吸引されたリポアスピレートは、最初に採取用のルアーロック注射器に入っています。採取カニューレを優しく外し、脂肪吸引液を新しい無菌10-20 mLのルアーロック注射器に移してさらなる処理を行います。
13. 空気、高温、過度な機械的力への曝露を避けてください。吸引液は常温(20〜25°C)で処理(例:精製、遠心分離、注入)まで維持してください。
    注:新鮮な滅菌注射器を使用することで汚染を防ぎ、標準化された処理が可能になります。優しい取り扱いにより、脂肪細胞および間質血管分数の生存率が維持されます

4. SVF濃縮マイクロ脂肪の機械的処理

1. 採取したリポアスプレー液を、無菌の10-20 mLルアーロック注射器で室温(20-25°C)で5分間直立させ、重力による分離を可能にします。
2. 立っていると、3つの明確な層(上部油脂層[遊離脂質分率]、中間脂肪層、下部水層/血液層)が見えます。
3. 滅菌技術を用いて、注射器を垂直に持ち、ノズルを上に向けて、プランジャーを優しく進めて上部の油層を排出し、脂肪分だけが残るまで続けます。注射器を逆さまにし、滅菌シリンジでゆっくりとプランジャーを進めたり吸引したりして、下部水膜や血液層を慎重に除去します。さらなる処理のために中間脂肪分だけを保持してください。
   注:遊離油分および水性成分の除去は炎症副産物を減らし、移植片の一貫性と細胞の生存率を向上させます。
4. 残留された脂肪分を無菌のステンレスまたはガラス製皿に移します。無菌の外科用ハサミを使い、脂肪組織を約1〜2mmの大きさの断片に優しく細かく刻み、過度な圧縮やせん断力を避けます。
5. 挽いた脂肪組織を10mLのルアーロック注射器に注入します。この注射器を、無菌のメス同士ルアーロックコネクターで2つ目の10mLルアーロック注射器に接続します。
6. 2本の注射器間で脂肪組織を20〜30回、一定かつ中程度の速度で移動させて機械的に乳化します。均一で注射可能な微量脂肪の粘度が得られるまで続けます。
   注:加工脂肪は均一に乳化されており、目に見える油分分離は最小限であるべきです。
7. ルーアロックコネクタを外し、乳化マイクロファットをシリンジから遠心分離ローターと互換性のある無菌遠心分離機管に移します。遠心分離前にチューブの体積バランスを必ず確認してください。
8. 乳化脂肪を約400×gで室温で3分間遠心分離します。
9. 遠心分離後、3つの層が見えます:上部油層、中央SVF濃縮微量脂肪分画、下部水層/血液層(図1)。
10. 滅菌注射器を使い、隣接層からの汚染を防ぎ、中央のSVF濃縮微量脂肪層のみを慎重に吸引します。
11. 収集した成分を500〜1,000μmの無菌ステンレスメッシュフィルターに通し、繊維状の破片や大きな粒子を除去します。この工程により、スムーズな注入が可能になり、移植片移植時のカニューレ詰まりを最小限に抑えます。
12. ろ過したSVF強化マイクロファットを1〜5mLの滅菌シリンジに注入し、即時注射します。

5. 欠陥部位への注入

1. 最終的な創傷のデブリードメントを行い、その後無菌生理食塩水で徹底的に洗浄し、すべての壊死組織を除去します。
2. 健康な肉芽組織や点点出血の有無により創傷準備を確認し、適切な灌流と組織の生存可能性を示します。
3. 滅菌技術を用い、鈍先カニューレ(直径1.2〜2.0mm)を傷の縁や隣接する無傷の皮膚から欠損部に挿入し、可能な限り中央の創傷基部からの直接侵入を避けます。
   1. 深さと組織面:カニューレを創傷床のすぐ表層の皮下組織面に前進させます。欠損深度で特に示されない限り、筋内挿入は避けられます。
   2. 挿入角度:カニューレを傷面に対して低い斜め(約10〜30°)で挿入し、制御された層状の沈着を促進します。
   3. カニューレの位置:血管が豊富に発達した組織面内にカニューレ先端を保ち、移植片の生存率を最適化し、押し出を最小限に抑えましょう。
4. SVF強化マイクロファットを多層逆行扇動法で注入し、ゆっくりとしたカニューレ抜き時に小さなアリコートを沈着させます。
5. 移植片を傷口の基部、マージン、周囲の皮下組織に均等に分散させ、均一な充填と血管化した受容組織との接触を最大化します。
6. 空洞の大きさと深さに応じて注入量を調整し、通常は5〜12 mLの範囲です。
7. 欠損が十分に充填され、組織の輪郭が回復し、過剰な矯正や過度な組織の緊張がないようにしたら注射は中止されます。
   注意:脂肪壊死、灌流障害、移植片の押し出のリスクを減らすために詰めすぎは避けてください。
8. 傷口をワセリン(ペトロラタム)ガーゼで覆い、傷口表面に非圧縮的に接触させてください。
9. 二次ドレッシングを施し、受動的な排水を確保し、注入された微量脂肪へのせん断力を最小限に抑えつつ、部位を保護します。

6. 術後ケアおよびフォローアップ

1. 創傷の大きさ、汚染状況、患者特有のリスク要因を考慮し、施設のプロトコルに従って予防的抗生物質を投与します。
2. 手術後1〜2週間、ドナー部位と移植部位の両方で圧力、せん断、摩擦を避けるよう指示し、移植片の置換を最小限に抑え、統合を最適化します。
3. フォローアップのたびに創傷の包帯を確認し、必要に応じてワセリン(ペトロラタム)ガーゼを交換してください。無理やり接着したガーゼを外さないでください。上皮化時に自然剥離を許し、再生組織の破壊を防ぎます。
4. フォローアップは手術後1週、2週、4週、12週に予定してください。
5. 各受診時に、固定カメラを傷口の距離で撮影し、一定の照明条件と、同じ平面に置いたスケール基準(例:滅菌定規)を用いてください。これにより縦断的評価の一貫性が保証されます。
6. ImageJソフトウェア(米国国立衛生研究所(NIH))を用いて平面測定を用いて創傷面積を測定します。
   1. 標準化された創傷写真をImageJにインポートしてください
   2. 基準定規を使った画像スケールのキャリブレーション
   3. ポリゴン選択ツールを使って傷のマージンを手動でトレースしてください。
   4. ソフトウェアの測定機能を使って自動的に創傷面積を計算します。
7. アウトカム評価のために、完全な上皮化とは、滲出物、ドレッシングの必要性、または二次介入の必要性のない完全な創傷表面被覆と定義します。
8. 感染、脂肪壊死、血腫、漿液腫、創傷治癒遅延など、術後合併症をすべて記録してください。
   注意:すべての生物廃棄物は、機関のバイオセーフティ規則に従って処分してください。

Results

合計8名の虫歯型外傷性軟部組織欠損患者がこのプロトコルを用いて治療されました。

コホートの特徴

コホートは男性5名、女性3名で構成され、平均年齢は51.5歳±11.7歳(38〜74歳の範囲)でした。欠損は下肢(n = 5)、上肢(n = 2)、胴体(n = 1)に位置していました。平均最大創傷直径は4.3±1.0cmで、空洞の深さは3〜6cmの範囲でした。傷害の原因には交通事故(n=4)、圧死(n=3)、転倒(n=1)が含まれます。術前創傷培養では複数の症例で陽性が見られ、最も一般的には緑 膿菌、 黄色ブドウ球菌、または 肺炎球菌 が認められました(表1

Discussion

本研究は、外傷性空洞型軟部組織欠損の管理におけるSVF濃縮マイクロ脂肪の機械的処理および移植に関する臨床的に適用可能かつ再現可能なプロトコルを説明しています。このプロトコルは標準的な手術室環境でのポイントオブケアの実施を目的としており、生物学的特徴付けよりも手技の簡易さ、安全性、実現可能性を優先しています。この小規模な臨床シリーズでは、治療中の全欠損が進行性の創傷閉合を示し、12週間以内に重大な手技関連合併症なく完全な上皮化を達成し、このアプローチの臨床実践における実現可能性を支持しました。したがって、この臨床コホートでは細胞表現型解析および生存可能性アッセイが実施されなかったため、機構的解釈は既存の文献によって支持される関連に意図的に限定されています。

SVFを含む微量脂肪を得るための脂肪組織の機械的処理は、以前に再建および再生の場面で説明され応用されています。間質血管画分の酵素的分離は核細胞および前駆細胞集団の数を増加させます¹⁶が、専門的な試薬、処理時間の延長、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 生理食塩水	バクスター・ヘルスケア(または同等の機関)	様々な	膨潤液のベース溶液として使用
鈍先端注射カニューレ(22G&50mm)	CONPUVON(;)、中国	DZ 22回以上;50-C5	SVF強化マイクロファットの多層注入に使用されます
遠心分離機およびnbsp;	長年バイオテクノロジー()、中国	LTA-1600	約400回以上を生産可能な臨床用遠心分離機;g
デジタルカメラ/スマートフォン	どんな人でも	該当なし	追跡時の標準化された創傷写真撮影
エピネフリン	地元の病院薬局	様々な	生理食塩水に加え、最終濃度1:500,000にします
ImageJソフトウェア(バージョン1.53以降)	米国国立衛生研究所(NIH)	フリーソフトウェア	プラニメトリック創傷面積測定に使用
脂肪吸引カニューレ(2–3 mm)	標準医療供給者	該当なし	ドナー部位から脂肪組織を採取するために使用
ルアーロックコネクター(女性から女性へ)	ベクトン・ディキンソン(または同等の役職)	様々な	シリンジからシリンジへの機械的乳化に使用
ルアーロックシリンジ(1、5、10、20 mL)	ホンダ医療機器()、中国	特定されていません(機関向け供給)	吸引、機械加工、射出に使用
滅菌包帯	病院薬局	該当なし	術後の創傷補償のために
外科用はさみ(無菌)	広州百塘医療機器有限公司	BT00301(または類似の代表モデル)	脂肪組織の機械的断片化に使用
ワセリンガーゼ(10cm× 10cm)	華西医療包紮有限公司()、中国	特定されていません(機関向け供給)	術後創傷ケアに使用される非粘着ドレッシング