ショウジョウバエ胚上皮におけるコアプリーツセプテート接合タンパク質の定義を目的とした免疫染色および染料浸透実験

サマリー

これらのプロトコルは、制御および変異型ショウジョウバエ胚上皮におけるプリーツ状隔断接合部の組織および閉塞機能を特徴づける方法を示しています。

要約

これらのプロトコルの目的は、ショウジョウバエ胚の外胚層由来上皮組織におけるプリーツ状中隔接合部(pSJs)の組織およびバリア機能を評価することです。pSJは、表皮、唾液腺、気管、後腸を含む外胚葉組織の側膜に閉塞障壁を形成し、これは脊椎動物組織のタイトジャンクションに機能的に類似しています。ショウジョウバエでは、pSJの形成に必要な30種類のタンパク質が同定されています。コアpSJタンパク質は最初、側膜の長さに沿って局在しますが、胚発生の第16段階で接合部の頂端側側、すなわち接着接合部の基部で強く濃縮されます。胚発生の後期段階15までに、これらの組織は完全に機能する閉塞接合部を持つ。本論文では、制御および変異胚におけるpSJの組織と機能を検証するために用いられる免疫染色および染料透過性プロトコルについて説明します。これらのプロトコルの成功裏の適用により、pSJの閉塞機能の実証や、未知の遺伝子が接合部のコア成分をコードしているかどうかの検証に利用されます。

概要

上皮組織の重要な機能の一つは、生物体内の異なる領域を区画化することです。これらの異なる環境の創出は、臓器の機能と外部からの脅威からの生物保護に不可欠です。上皮の細胞間で形成される閉塞接合部は、その上皮の頂端側と基底側間の溶質の細胞外流動を防ぐことで、これらの環境を確立・維持する役割を担っています^1,2。脊椎動物では、閉塞接合部はタイトジャンクションと呼ばれ、無脊椎動物ではセプテート接合部(SJ)と呼ばれます。^例えばショウジョウバエ^1,3。節足動物には組織分布と^超微細構造によって区別される2種類のSJがあります。プリーツセプテート接合部(pSJs)は、表皮、唾液腺、気管、後腸などの外胚葉由来組織に見られます。これらは細胞外空間に電子密度の高い梯子状の配列が存在し、接着接合^部3,5のすぐ基部に位置することで超構造的に特徴づけられます。これに対し、滑らかな中隔接合部(sSJ)は中腸管やマルピギ管などの内胚葉由来組織に見られ^、細胞間で電子密度の高い隔隔は見られません。

ショウジョウバエの遺伝学的研究では、pSJの構造と機能に必要な30のタンパク質が特定され、接合部に存在するもののその確立や維持に機能しない他のタンパク質も同定されています(⁷でレビュー)。これらの解析から、科学者たちはSJタンパク質を3つのクラスに分類しました。コアSJタンパク質は接合部に存在し、接合部の確立と維持に必要です。コアpSJタンパク質として同定されたタンパク質は17種で、Coracle(Cora)、Neurexin IV、マクログロブリン補体関連(Mcr)、クネクネ、ATPaseα 8,9,10,11,12が含まれます。接合部の確立および/または維持に必要な補助pSJタンパク質として9つのタンパク質が特定されていますが、必ずしも接合部内に存在するわけではありません。このクラスにはRab5、Rab11、Coiled^13,14などのタンパク質が含まれます。最後に、pSJレジデントタンパク質はpSJに局在しますが、接合部の確立と維持には不可欠です。このグループの4つのメンバーの例には、ディスク・ラージやファシクリンIII^15,16があります。

機能的に完全なpSJの確立は、胚発生の途中ですべてのコアpSJタンパク質が完全に発現する段階から始まります。一部のコアpSJ遺伝子は母体で発現しますが、すべてステージ12¹⁷までに強い接合発現を示します。ステージ12では、コアpSJタンパク質が側膜の長さに沿って局在します。第13〜16段階で、コアpSJタンパク質はエンドサイトーシスされ、pSJ領域の側膜に再循環されます。この過程には、Rab5やRab11を含むpSJ補助タンパク質^{が必要です。}ステージ16までに、コアpSJタンパク質は側膜に沿ってpSJの領域に厳密に局在します。これらの観察と一致して、接合部の完全な閉塞機能は胚発生¹²期の後期ステージ15で現れます。これは染料透過性アッセイを用いて最もよく示されます。接合部が形成される前には、蛍光マーカー(例えばロダミン)で標識された10 kDaのデキストランビーズが細胞間の細胞間隙を通過できます。標識されたデキストランを血筋に注入すると、気管、唾液腺、後腸などの管状上皮の腔内に急速に蓄積します。pSJが生理学的に15の終わりに収束すると、注射されたデキストランは上皮の基底側に限定され、これらの臓器の内腔(頂端領域)に蓄積できません。

コアpSJタンパク質は、各コアpSJタンパク質が正しい細胞内局在のために他のすべてのコアpSJタンパク質の存在を必要とするという特徴を共有しています^18,19。このpSJ形成における相互依存性は、コアpSJタンパク質の特徴であり、本記事で提示するプロトコルの基盤となっています。コア遺伝子や補助的なpSJ遺伝子の変異は胚致死を引き起こし、ステージ16胚では他のコアpSJタンパク質が側膜に沿って誤定位するのが特徴で、正常な頂端側側領域に厳密に局在しません。対照的に、pSJ常在遺伝子の変異はコアpSJタンパク質の誤局在を招きません¹⁵。コアおよび副次的なpSJ遺伝子変異におけるpSJの機能的障害は、ステージ16または17の変異胚における気管腔、唾液腺、後腸に標識された10 kDaデキストランが蓄積することで明らかになります。最後に、コアpSJタンパク質と補助pSJタンパク質の区別点は、その細胞内局在です。コアpSJタンパク質は形成後はpSJと密接に結びついていますが、補助的なpSJタンパク質は接合部の組み立てに不可欠ですが、必ずしも接合部に存在するわけではありません。補助的なpSJタンパク質の最良の例はRab5とRab11です。どちらも細胞質タンパク質であり、細胞膜から早期およびリサイクル中のエンドソームへ貨物を運び、さらに細胞膜に戻すのを助け^ます。新たなpSJタンパク質がコア成分か補助タンパク質かを区別するためには、通常、特定の抗体を作るか蛍光タグ付き組換えタンパク質を発現し、これらのタンパク質がpSJ成熟過程の各段階でどこに局在するかを特定することが有効です。

これらのプロトコルの目的は、潜在的なコアおよび補助的pSJタンパク質とpSJ常駐タンパク質を明確に区別することです。いくつかの研究により、発生中のpSJタンパク質には形態形成や頂端-基底極性など、閉塞しない追加の役割が明らかになっています(^17,20,21,22)。pSJ生物学への関心が高まり、より多くのpSJタンパク質が特定される中、ここで提示する簡単で解釈しやすいプロトコルは、これらのタンパク質のpSJ組織および閉鎖機能を正しく特徴付ける研究者の助けとなるでしょう。文献では、光漂白後の蛍光回復(FRAP)や透過式電子顕^微鏡法など、pSJタンパク質の特徴付けに関する多くの実験的手法が記載^{されています。}これらの手法は非常に有用ですが、ここで紹介する免疫染色アッセイは高価かつ時間のかかる超微構造的手法を用いず、pSJタンパク質の局在を迅速に可視化できるのに対し、染料透過性アッセイは画像だけでは達成できないpSJ完全性の機能的読み取りを提供します。さらに、これらのアッセイは高品質な蛍光顕微鏡や簡易的な微小注射装置などの標準的な実験機器を用いて実施可能です。これらのアッセイはショウジョウバエのステージ16胚の解析に最適化されており、sSJsの組織や機能の評価には適していません。

プロトコル

1. 胚の段階化

1. 適切な遺伝子型の健康なオスとメスのバエを交配し(例は 「材料表 」を参照)、胚採取ケージに入れ、酵母ペーストを塗った新鮮なリンゴジュースの皿を置きます。胚採取を始める前に、ハエが卵の採取ケージに1〜2日慣れるのを待ちましょう。
2. 胚をリンゴジュース皿に集め、産卵後~13時間(AEL)から25°Cで16時間AELまで)まで発育させます。成虫がリンゴジュースの皿に受精卵を1〜2時間産み、その後卵の採卵ケージからプレートを取り出し、25°Cで13〜16 AELまで熟成させます。 あるいは、25°Cで一晩胚を採取し、固定前または固定・免疫染色後の画像検査中にステージ16胚を選択します。
   注:胚の病期は腸の形態によって評価でき、これは紫外線スペクトル(すなわちDAPIチャネル)における自己蛍光で最も容易に可視化されます。第16期の胚では、腸は体の長軸に対して垂直な3つの平行な長い楕円形として現れます(図1H)。

2. 胚の固定および免疫染色

1. ナイロンメッシュ(120mmメッシュ)で胚収集バスケットを組み立てます。開口部とバスケットのネジ山をナイロンメッシュで覆い、キャップをねじ込みます。
2. 絵筆と胚洗浄液でリンゴジュースプレートから胚を優しく取り除きます。胚の混合物を胚収集バスケットに注ぎ、蒸留水で胚をすすいでください。
   注意:水は胚採取バスケットの内側に流し、接着による胚の喪失を防ぐために、卵がバスケットの側面に飛び散るのを避けるように注意してください。
3. 胚採取バスケットと胚を50%市販漂白剤(最終濃度3.75%次亜塩素酸塩)を入ったトレイに浸して胚を脱毛化します。胚を漂白剤でくるくると回し、室温で3〜5分間浸けておきます。バスケットを漂白剤から取り出し、蒸留水で胚をすすいでください。再びバスケットの内側に水の流れを導きます。
4. フレクセーションバイアルとして、フレッシュ4%パラホルマルデヒド溶液とヘプタンを等量加えて20 mLのシンチレーションバイアルを準備します。化学フュームフード内の高温(~90°C)1xリン酸塩緩衝生塩水(PBS)に適切な量のパラホルマルデヒドを溶かしてパラホルマルデヒド溶液を製造します。溶解プロセスを速めるために、10μLの14N水酸化ナトリウム(PBS10mLあたり)を加えてホルムアルデヒドが溶解するまで加え、その後14N塩酸10μLを加えてpHを中性に戻します。
   注意:パラホルマルデヒドやヘプタンを扱う際は、必ず白衣、ゴーグル、手袋を着用し、化学用煙フードの下でのみ使用してください。パラホルムアルデヒドは発がん性があり腐食性がありますが、ヘプタンは非常に可燃性で皮膚や目の刺激物です。
5. 胚採取バスケットを分解し、脱胆膜胚と共にナイロンメッシュをヘプタンに浸します。胚はナイロンから外れ、ヘプタン(上層)と固定(下層)の界面に沈降します。固定バイアルをプラットフォームシェーカーで240回転毎分(RPM)で20分間振って固定します。
6. 固定バイアルから固定剤を化学煙幕の中でパスツールピペットで除去します。修正液は承認された有害化学廃棄物容器に処分してください。同量のメタノールを加え、固定室を閉じて5〜10秒激しく振る。固定された胚はビテリン外皮から剥がれ、メタノールの底(下層)に沈みます。ビテリン包絡とビテリン包絡から剥がれなかった胚は界面に残り、ステップ2.7で除去されます。
   注意:メタノールを扱う際は必ず白衣、ゴーグル、手袋を着用してください。メタノールは有毒で可燃性が高いためです。
7. ヘプタンはパスツールピペットで除去し、承認された有害化学廃棄物容器に捨ててください。その後、ほとんどのメタノールを除去し、胚を小さなメタノールプールに残し、メタノールを有害な化学廃棄物として廃棄します。メタノール5mLを加え、胚をくるくると回して落ち着かせます。メタノールの大部分を再度除去し、このプロセスをさらに2回繰り返します。
8. 胚をメタノールに浸して0.8mLのガラス培養チューブに移します。メタノールを除去し、ブロック溶液750mL(PBSに加え1%の通常のロバ血清、0.1%のTriton X-100)を加えます。胚をPBSで3回洗い、その後室温のブロック溶液で30分間孵化させ、プラットフォームロッカーで優しく混ぜます。
9. 胚をもう一度PBSで洗い流し、その後ブロックと一次抗体を加えます。コアpSJタンパク質(例:Coracle)と接着接合タンパク質(例:Eカデリン)に対する抗体を用います。胚を一次抗体で4°Cで一晩または室温で3〜4時間、プラットフォームロッカーで優しく混ぜながら培養します。
10. 一次抗体でブロックを除去し、胚をPBSで3回洗い流します。胚をブロックを加え、室温のプラットフォームロッカーで30分間洗います。
11. 胚をもう一度PBSで洗浄し、その後ブロッキング溶液とステップ2.9で使用した一次抗体に特異的な蛍光標識された二次抗体を加えます。胚は室温で3〜4時間、または4°Cで一晩培養します。
12. 二次抗体でブロックを除去し、胚をPBSで3回洗い流します。胚をブロックを加え、室温のプラットフォームロッカーで30分間洗います。
13. 胚をPBSで再度すすいで後、パスツールピペットを使って顕微鏡スライドに移します。余分なPBSは、小さなワットマン紙の細い帯で除去し、胚に触れないように注意してください。胚を盛付け培地(市販または90%グリセロール、10% 1 M Tris、pH 8.0、アンチフェーディング剤として0.5% n-プロピルガレートから作る)で覆います。適切なサイズの1.5番カバーガラスで覆い、縁はネイルポリッシュで密閉します。

3. 免疫染色胚の画像診断およびデータ解析

1. 最良の結果を得るためには、40倍の油浸け物レンズを備えた共焦点顕微鏡で胚を画像化します。コントロール胚を使って共焦点のレーザー強度とゲインを設定し、ピクセルを過飽和させることなく強い蛍光信号を得ます。中腸形態学を用いて、選択されるステージ16胚(すなわち、バランサーコードされたGFPを発現して変異胚を識別しない胚)を特定します。これらの臓器は分極しており、長い側膜を持つ唾液腺や後腸にスキャンを集中させてください。これらは付着接合部、pSJ、残る側表面を識別するのに理想的です。唾液腺または後腸の腔径を最大に含むZポジションで、上皮細胞の外側膜全体を観察します。
   注: 図1C の例は、共焦点顕微鏡で撮影されたもので、HC PL APO 40x/1.3 CS2オイル浸漬レンズを使用し、561 nmレーザーのレーザー強度1.59、利得3.3、638 nmレーザーのレーザー強度2.0、利得21.7(材料 表参照)を搭載しています。
2. 少なくとも20個の対照群および変異したステージ16胚の分極組織を画像化してください。胚のデータのみを記録し、粘着接合マーカーが膜の頂端側側に厳密に局在し、胚が適切に固定され染色されていることを確認します。次に、側膜に沿ったpSJマーカーの分布を記録します。野生型ステージ16胚では、付着接合部のすぐ基部に位置する側膜の約10〜15%に沿ったpSJタンパク質の強い濃縮を観察してください。
   注:側膜の長さに沿ってpSJタンパク質の10〜20%の誤局所が見られると、pSj組織欠損の診断となります。pSJ組織の欠陥は、すべてのコアおよび付属のpSJ変異胚に強く浸透するため、変異胚の75〜100%で明確に誤局在するpSJタンパク質が見られると予想されます。

4. 染料注入の準備

1. ローダミン標識された10 kDaデクトロンを0.5 Mリン酸ナトリウム、pH 7.5、5 mM塩化カリウムに溶かして新鮮な染料溶液を作ります。
2. 毛細管(外径1.0mm、内径0.5mm、ファイバー付き)を針引きでガラス針に引き込みます。
   注意:針抜きは個性的で、理想的な針の設定は日によって異なることが多いです。良い針は徐々に尖った先端にテーパーし、 図2Aの形状の間に収まるはずです。左側の針は長く、胚に押し込まれる際に曲がることがあります。これは針を先端からさらに離して折り直すことで修正できます。右側の針は良いですが、最初に折るとボアが大きくなり、胚に過剰な液体を押し込む可能性があります。もしそうなら、より細い先端の新しい針に交換してください。針引き手の条件が適切な形の針を作る場合は、複数の針を同時に引き抜くのが最適です。余った針は、泡やテープで固定した密閉容器に保管して、針を独立して固定できます。
3. マイクロマニピュレーターの針ホルダーに針を詰めます。マイクロマニピュレーターを逆さま顕微鏡の隣に配置します(図2F)。針を顕微鏡スライドにできるだけ平行に向け、スライドの側面と同じZ面に下げてください。
4. 顕微鏡スライドの側面を叩いて針の先端を折ります。針をスライドの高さより上に上げて、装填のために取り出します。
5. 毛細管管に染料を充填するには、利用可能な最小のピペット先端(P2またはP10先端)を使うか、針の後端を1.5mLのマイクロ遠心分離機管に植染料を入れて毛細管作用で染料を充填します。
6. 充填した針を針ホルダーに再装填し、顕微鏡スライドの表面にあるハロカーボン油の滴に少し注入してデキストランの流れを試します。
   注意:よく折れた針は圧力をかけなければ漏れません。流れの速度は注射器のプランジャーに加える圧力で調整可能です。

5. 胚のマウントと造影剤注入

1. ステージ16または17の胚(コントロールおよびミュータント)を選択し、中腸形態を段階標識として選択します。
2. 22 x 22 #2の厚さのカバースリップを使って、リンゴジュースプレートにへこみ線を作ってください。約25個の段階胚をリンゴジュース皿に並べ、後端がラインに触れ、腹面が上向きになるように配置します。
3. 22 x 22 #2のカバースリップに両面テープを貼ります。テープを胚のラインに触れ、カバースリップを軽くこすって胚をプレートからカバースリップの両面テープに移動させます(図2B)。
4. カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けるには、スライドにハロカーボン油を一滴加え、毛細管作用で結合を作って取り付けます。カバースリップは、滑りの側面、すりガラス部分とは反対側に近づけてください。胚を乾燥剤の容器で3〜5分間乾燥させるか、実験台の上で10〜15分間乾燥させます(図2C-E参照)。胚をハロカーボンオイルで完全に覆います。
   注意:乾燥後胚はやや柔らかくなりますが、強い弛緩ではありません。 図2E に示された胚は、相対湿度42%、21.2°Cの部屋で15分間自然乾燥させられました。
5. 胚が入ったスライドを逆さま顕微鏡に取り付け、胚は対物レンズから離れた位置で上向きに取り付けます。マイクロマニピュレーターを、針が胚の後端に向かい、胚にできるだけ平行な角度で向くように整列します(図2G)。マイクロマニピュレーターのz軸を調整し、針の先端が胚の中央点(背側-腹側軸に沿って)に合わせるようにします。
6. 胚を注射するには、段階を素早く針に移動させ、針の先端が胚の血筋に入るようにします。10、25、50 mLのシリンジで少量の染料(~0.2〜0.5 nL)を注射します。素早く針を抜き、段階を次の胚に移し、同じことを繰り返します。10分以内にできるだけ多くの胚を注入してください。
   注意:針は胚の約25%の位置まで挿入することが重要です。これにより、造影剤が前腸および後腸の内腔と連続したペリビテリン腔に直接注入されないように注意が必要です。注入された染料は胚を「膨らませ」、より濃厚に見えるように見せるべきです。過剰注射は注射部位から造影剤とヘモリンパの泡が出るため避けるべきです。
7. さらにハロカーボンオイルを加え、胚を22 x 22 #2のカバースリップで覆います。追加のハロカーボン油は2つのカバースリップの間により均一な層を形成し、胚が潰されるのを防ぎます。

6. イメージングおよびデータ解析

1. 蛍光複合顕微鏡または共焦点顕微鏡(10倍または20倍の空気対物レンズで十分)で画像診断を行い、明確な結果が得られます。共焦点、Zスタック画像では、胚の深さの約4分の1(背側腹側軸に沿って)を通過することで、標識されたデキストランが気管および後腸の内腔に入ったかどうかが明らかになります(唾液腺を見るには、より深い切片や腹側面の胚の再配置が必要です)。
   注: 図3 に示された例は、561 nmレーザーの共焦点顕微鏡で撮影したもので、HC PL APO 10x/0.4 CS2ドライレンズ、レーザー強度2.0、利得13.6です。24枚のzスライスが、zステップサイズ2.4 nmで得られました( 材料表参照)。
2. 注入された胚を10分間老化させた後、気管、唾液腺、後腸の腔内を検査し、標識されたデキストランの蓄積を観察します。各胚の遺伝子型と段階、そして標識されたデキストランが管状器官に蓄積しているかどうかを記録します。周囲の周囲空間が強い染料で染められている胚は、誤ってその空間に注入された胚を表している場合があります。

結果

ここで提示するプロトコルは、ステージ16ショウジョウバエ胚における外胚葉組織におけるpSJの組織と機能を調査するために用いられます。これらのプロトコルはpSJにのみ適用でき、sSJの問い合わせには使用できません。ステージ16胚で他のpSJタンパク質をpSJ領域に局在できず、ステージ16で閉塞接合部を形成しない遺伝子変異は、コアpSJ遺伝子か補助pSJ遺伝子のいずれかに存在します。両者の主な違いは、機能的接合部が野生型胚で形成された際に、コードされたタンパク質が細胞内に局在するかどうかにあります。その場合、そのタンパク質はコアpSJタンパク質に分類されます。この原理を示すために、まず野生型胚において、胚発生の段階13から段階16にかけてコアpSJタンパク質の局在がどのように成熟するかを示します(図1A-D)。ここでは唾液腺に焦点を当てます。唾液腺は、腺の内腔に面した頂端の上皮管です。胚発生の第13〜16段階では、唾液腺が背の高い柱状細胞で構成されており、胚の共焦点光学断片で側膜を...

ディスカッション

ここでは、蛍光顕微鏡技術を持つ控えめな規模の研究所でも実現可能な、比較的単純な2つのアッセイを用いてコアおよび補助pSJタンパク質を同定するプロトコルを紹介します。最初のアッセイは、固定変異胚の共焦点イメージングを用いて成熟した分極上皮におけるpSJの分子組織を調べるものです。2つ目のアッセイでは、pSJの閉塞機能の完全性を、16段階の生胚に染料標識された10 kDaデキストラン分子を注入することで検証します。これらのプロトコルの単純さと、pSJの組織および機能の欠陥がコアおよび付属pSJs変異の完全な診断となるという事実は、FRAPや電子顕微鏡のようなより労働集約的で技術的に難しいアプローチよりも有利です。これらのプロトコルはショウジョウバエの胚発生におけるpSJの組織と機能に特有であり、sSJや後の発生段階には適用されません。

コアおよび補助的なpSJ変異後期胚におけるすべてのコアpSJタンパク質の誤局所は、完全に診断的です。したがって、段階16の変異胚をコアpSJタンパク質に対して抗体で免疫染色することで、任...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
針用の毛細管(Boro 1 X 0.5/線維)	FHC	30-30-1
共焦点顕微鏡	ライカ	Stellaris5
注射用ガラスのカバーガラス 22 x 22 厚さ	フィッシャー・サイエンティフィック	12-540-B
イメージング用カバーガラス 22 x 30 厚さ1.5	コーニング	2980-233
免疫染色用の培養チューブ(6×50mm)	フィッシャー・サイエンティフィック	14-958-A
胚採取ケージ	ジェネシー・サイエンティフィック	59-100
蛍光立体顕微鏡	ライカ	MZ10 F
ハロカーボン油(700)	ジェネシー・サイエンティフィック	59-131
ヘプタン	フィッシャー・サイエンティフィック	H350-4
逆転蛍光顕微鏡	ライカ	DMi8
脱毛膜胚用のメッシュバスケット	ジェネシー・サイエンティフィック	46-101
メタノール	フィッシャー・サイエンティフィック	A412-4
マイクロマニピュレーター	成重	MN151
顕微鏡スライド	フィッシャー・サイエンティフィック	12-544-2
ニードルプラー	デイヴィッド・コップ楽器	モデル720
ノーマル・ドンキー血清	ジャクソン免疫研究	017-000-121
ナイロンメッシュ(120 um)	ジェネシー・サイエンティフィック	57-102
対物レンズ HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1	ライカ	11506537
対物レンズ HC PL APO 10倍/0.40 CS2	ライカ	15506407
対物レンズ HC PL APO 40倍/1.30 CS2	ライカ	15506358
ペトリプレート 60 x 15 mm	コーニング	351007
プラットフォームロッカー	グローブ・サイエンティフィック	GTR-FS
一次抗体(コラクル抗体)	DSHB	C566.9
一次抗体(コラクル抗体)	DSHB	C615.16
一次抗体(Eカデリン)	DSHB	DCAD2
一次抗体(Mcr)	ウォード実験室、CWRU	モルモット多クローン
ロダミンは10 kDaのデキストランとラベル付けされています	分子プローブ	D1824
二次抗体(ロバの抗モルモットCy3)	ジャクソン免疫研究	706-165-148
二次抗体(ロバ抗マウスCy2)	ジャクソン免疫研究	715-225-151
二次抗体(ロバ抗ラットCy5)	ジャクソン免疫研究	712-175-150
卓上シェーカー	ニューブランズウィック・サイエンティフィック	C2プラットフォームシェーカー
テゴセプト(メチル4-ヒドロキシベンゾエート)	TCI	H0216
トライトン X-100	フィッシャー・サイエンティフィック	BP151500
固定用のバイアル(20mlのウィートン液体シンチレーションバイアル)	フィッシャー・サイエンティフィック	03-341-73C
ワットマン 3MM クロマトグラフィー用紙	フィッシャー・サイエンティフィック	05-716-6H
<ストロング>フライストック	<ストロング>フルジェノタイプ	<ストロング>ストックナンバー<ストロング>	Source
cor4	w*;P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Solution	<ストロング>レシピ<ストロング>
10倍PBS	NaCl 90g、Na2HPO4 20g、NaH2PO4 8.3gを混ぜて1Lにかけます。フィルターで滅菌します。免疫染色の洗浄工程のためにdH2Oで1倍に希釈してください。
10%トライトンX-100溶液	トライトンX-1001mlとdH2Oを9mlのプラットフォームロッカーで溶かすまで混ぜます。常温で保存してください。
漂白剤50%	脱毛胚の前に市販漂白剤10ml(次亜塩素酸塩酸ナトリウム7.5%)と10mlの水を混ぜます。
アップルジュースプレート	15gのショウジョウバエ寒天を725mlのdH2Oに煮沸します。砂糖25gとリンゴジュース250mlを加え、混ざるまで混まらせます。溶液を55°Cまで冷まし、その後1.3gのテゴセプトを加えて優しく混ぜます。60×15インチのペトリプレートに注ぎ、冷まします。4°Cで保存してください。
ブロッキング解法	15円錐形のチューブに100μulの10%トライトンX-100と100μulのNormal Donkey Serumを混ぜます。
胚洗浄液	70gのNaClと2mlのトリトンX-100を1LのdH2Oに混ぜて、10X胚洗浄液を作ります。dH2Oで1倍に薄めて効果を発揮します。
修正	10mlの1XPBSを電子レンジで予熱します。0.4 g  を加えます。パラホルマルデヒドとピペットを混ぜる。溶けを加速させるために14N NaOHを10ul加えます。90°Cのヒートブロックの上に置き、溶かすまで置きます。固体のパラホルムアルデヒドが残らなくなったら、14N HCLを10 μl加えてpHを中性に調整します。パラホルマルデヒドを使用する際は、必ず白衣、手袋、ゴーグルを着用してください。
マウンティングメディア	グリセロール9mlと1Mのトリス塩基pH8.0を1ml混ぜます。n-プロピル-ガレートを0.05g加え、nbsp;混ぜて加熱して溶かします。エッペンドルフ管に0.5mlを挿入します。
ロダミンデキストラ溶液	新鮮な染料溶液として、ローダミン標識の10 kDaデクトロンを0.5Mリン酸ナトリウム、pH 7.5および5 mM塩化カリウムに溶かして1 mg/mlに溶かします。
酵母ペースト	市販の酵母(レッドスター)50gにショ糖をひとつまみ、濃厚なペースト状にする水を混ぜます。4°Cで保存してください。