使い捨て結紮クリップを用いたマウスのスリーブ胃切除術

サマリー

ここでは、使い捨ての結紮クリップを使ってマウススリーブ胃切除モデルを作成するプロトコルを紹介します。このモデルは、術後死亡率の低さ、手術時間の短縮、そして従来の縫合技術と同等の治療効果を示しています。

要約

現在のマウスモデルのスリーブ胃切除術(SG)は、技術的に要求が高く、手術期間が長く、周手術期死亡率が高く、学習曲線も急な手技です。これにより、非外科的な研究者へのアクセスが制限されます。このボトルネックに対処するため、臨床消化器外科で一般的に用いられる使い捨てのリガチャークリップを用いた簡易SGプロトコルを開発しました。食事誘導の肥満C57BL/6Jマウスでは、クリップベースのアプローチは平均手術時間を>50%短縮(20.9±3.2 vs. 43.9 ± 3.0分)短縮し、従来の縫合と比較して12週間生存率を有意に改善しました。この方法は、持続的な減量、許容糖量の改善、インスリン感受性の向上、肝脂肪症の減少など、同等の代謝アウトカムを達成しました。特筆すべきは、このモデルにはマウス用途ではしばしば利用できない顕微外科の専門知識やホチキス装置を必要としないことです。このクリップベースの方法は、特に高度な外科訓練を受けていない研究者に推奨します。特に、肥満手術の機序的研究において手技効率と再現性を重視する方々です。直接的な臨床的翻訳性を求める外科医にとっては、より厳格な周術期管理を伴うものの、縫合技術が依然として好まれます。

概要

肥満手術は、極度の肥満およびそれに伴う合併症に対する最も効果的な介入として広く認められ^{ています。}マウススリーブ胃切除術(SG)モデルは、肥満手術に関連する病態生理学的変化や潜在的なメカニズムを研究する上で貴重なツールです。このモデルは、遺伝子ノックアウトや過剰発現を持つ遺伝子組み換えマウス株の使用を可能にするため有利です。再現が容易で、実験条件の厳密な制御が可能で、実験操作を容易にするマウスモデルは臨床翻訳に不可欠です^。

従来のマウスSGモデルは、縫合技術を用いて管状胃袋を製作します。この方法論は複数の精密な手術ステップを含み、通常は高度な技術力を要します。代表的な技術にはSG-単層^3,4およびSG-Lembert ^5,6があり、平均手術時間は約30〜45分7分^です。したがって、10匹のマウスコホートでSGを行うには、一般的に5〜7.5時間の手術時間が必要です。複数の実験コホートを含む研究では、累積手術セッションが2〜3日連続に及ぶことがあります。長期にわたる手技期間は、周術期の状況に物流上の制約や変動をもたらし、実験の一貫性や術後のモニタリングに影響を及ぼす可能性があります。研究者たちは、よりアクセスしやすいマウス-SGモデルの開発のための代替アプローチを模索しています。ホチキス支援(SG-stapler)^7,8およびクリップベース(SG-クリップ)^9,10,11のアプローチは顕著な改良を示しています。これらの方法は胃袋形成の特定の側面を効率化し、手縫合に伴う技術的負担を軽減することで、さまざまな手術経験を持つ研究現場でのより広範な採用を支援します。SGホチキス技術は、適切なサイズのホチキス止め装置の入手が限られているため、マウス用途では実用的な制約があり、その結果、ラットモデルでの使用がより頻繁に行われています。SGクリップアプローチに関しては、従来の研究では1〜2本のチタンクリップに補助縫合糸9^、10、11が一般的に用いられていました。標準的なチタンクリップの滑らかな内側は組織の配置に最適とは言えず、処置の信頼性と胃の完全性を確保するために補助的な固定が必要です。

SGホチキスおよびSGクリップモデルの特徴を活かし、このプロトコルは使い捨ての結紮クリップを用いて開発されたマウスSGモデルを提示します。これらのクリップは、胆嚢摘出術、虫垂切除術、その他の消化管手術で一般的に使用されています。これらの処置では、残存嚢胞管、虫垂根、血管などの組織をしっかりとクランプし、追加の縫合補強を必要としません。マウスの胃の長さに合ったサイズも用意されています。この新しいSGクリップモデルはシンプルで信頼性が高く、従来の縫合モデルに匹敵する治療効果を示しています。

特に、臨床外科技術の再現、縫合糸特異的な生体力学的または生物学的影響の研究、または最大限の解剖学的精度を求める研究においては、縫合糸ベースのSGが依然として好ましいです。高度な顕微外科技術を持つ研究者にとって、手縫い方法は人間の手技を反映しており、翻訳精度により適しています。これに対し、結紮クリップモデルは、実験的な厳密さを維持しつつ、特に外科的専門知識が限られている場合に、多様な研究現場でのマウスSGの適用範囲を広げる、効率的で効率的かつアクセスしやすい代替手段を提供します。

プロトコル

このプロトコルは国際動物福祉倫理ガイドラインに準拠しており、済南大学実験動物福祉倫理委員会(承認番号:20240227-0073)によって承認されています。

注:生後8週間のC57BL/6J野生型オスマウス30匹、体重22〜25gで、室温20〜26°C、昼夜交互に12〜12時間の無病原体(SPF)環境で飼育されました。高脂肪食に4週間慣れた後、マウスはSC(クリップ付き)、SS(縫合付きSG)、SH(偽)グループにランダムに割り当てられ、各グループに10匹ずつ割り当てられました。

1. 術前準備

1. 2日間は液体食に切り替え、手術前は断食しないでください。
   注意:術前から液体食への移行は、マウスの胃から固形物を排出しやすくし、術中の汚染を減らすことができます。さらに、術後の液体栄養への適応を促進し、十分なエネルギー摂取を確保します。
2. 麻酔マスクを装着した手術台に温熱パッドを固定し、温度を~37°Cに調整します。
3. テーブルは75%アルコールで洗いましょう。
4. 100mLの生理食塩水から1mLを抽出してペニシリン粉末を溶かします。次に、残りの99 mLの生理食塩水に溶けたペニシリン溶液全体を注射し、800,000 IU/100 mLの濃度でペニシリン溶液を準備します。
5. マウスに3%のイソフルランと0.5 l/min酸素で約30秒間麻酔し、その後頭部を麻酔マスクに装着し、イソフルラン濃度を1.5%に保ちます。
6. 胸部と腹部の皮膚をアナーディアン溶液で消毒し、無菌タオルで覆います。

2. 外科的手技

1. 正中開腹術:歯突起から約2cm下に皮膚を持ち上げ、正中線に沿って1.5cmの切開を入れます。白線に沿って筋のない部分を、リトラクターが入る程度(約1.5cm)切り開きます。
2. 胃の外出:濡れた綿棒を使って、大腸と小腸の一部を骨盤腔の方へ押し当てます。鈍いピンセットで腹部の切開部まで優しく持ち上げ、濡れたガーゼで切り出した新しい穴のタオルで覆います。肝胃靭帯、胃脾臓靭帯、胃洞と膵臓の部分的な血管接続部を慎重に解離し、電気凝固器で切開します。
   注:胃の外出や切開時に新しいドレープや湿らせた綿球を適時に設置することで、胃内容物からの汚染を効果的に減らせます。
3. 胃の大きな湾曲に沿って切除の範囲を決定し、胃底は食道の遠位3mm、門門は幽門近位3mmに位置します。
4. SCグループについて:
   1. 使い捨ての結紮クリップを、所定の切除範囲に沿ってアプリケーターを装着します。クランプの位置と食道および幽門からの距離を慎重に再測定し、その後クランプします。
      注意:切断前に、正確な切断マージンを確保するために、アシスタントとオペレーターの双方が協力して切断ラインを確認する必要があります。
   2. 胃の周りに湿らせた綿球をあらかじめ置き、胃の内容物が腹腔に汚染されるのを防ぎます。その後、結紮クリップの大きく湾曲した側の胃組織の約80%を素早く切断しました。
   3. 切開部をAnerdian綿棒で3回消毒し、生理食塩水綿棒で1回拭きます(図1)。
5. SSグループについて:
   1. 切除範囲に沿って胃体をクランプします。
   2. 胃の周りに湿らせた綿球をあらかじめ置き、胃の内容物が腹腔に汚染されるのを防ぎます。次に眼科用ハサミで、大きな湾曲側の胃組織の約80%を素早く切り取ります。
   3. 鉗子を開けて、生理食塩水の綿棒で胃内容物を洗浄してください。
   4. 切開部を6-0吸収性外科用縫合糸で2回、単層連続縫合法で行います。最初の連続縫合は、切開の縁に垂直に、2〜3 mmの距離で挿入し、胃壁の全厚を貫き、対側の等距離から抜けます。最初の縫合目は外科用結び目で固定し、組織のしわや裂け目を防ぐために均一な張力のもとで交互に2mmのバイトを続け、スクエアノット(3〜4回のスロー)で締めくくります。
   5. 2回目の連続縫合は、オフセットパターンで1回目と平行に行い、カバー範囲を強化し、噛み合わせ間隔と張力を均一に保ちつつ、重なりやねじれを避けます。
      注:綿球やガーゼの赤みは、特に胃切開部での著しい出血を示します。縫合前に切開部の適切な電気凝固が行われ、止血を得る必要があります。
   6. 切開部をAnerdian綿棒で3回消毒し、生理食塩水綿棒で1回拭きます(図2)。
6. SHグループについて:
   1. 胃のクランプだけを行い、10分後に解放してください。
   2. 胃を正しい位置で腹腔に戻し、固有筋と皮膚を5-0の外科的縫合糸で縫合し、滅菌して処置を終了します。
      注:すべてのマウスは術後の体重と食事摂取の効果的なモニタリングを促進するため、1週間以内に手術を受けました。

3. 術後ケア

1. マウスを純酸素の誘導箱に入れます。約2分で覚醒させることができます。ネズミを取り出して、温熱パッドの上に置いてください。意識状態や呼吸の状態を注意深く観察し、動けるようになったらケージに戻してください。
2. グルコース生理食塩水溶液(5%グルコース、4.5%塩化ナトリウム)を20 mL/kgの用量で皮下注射を1回投与します。
3. 手術後に意識を取り戻す直前に、4 mg/kg(濃度:0.4 mg/mL)の皮下注射を投与します。この注射は24時間ごとに3日間連続で繰り返します。
4. 手術後最初の3日間はアボットの栄養溶液と高脂肪食を提供し、手術後4日目には栄養液を水に置き換えます。
5. 感染を防ぐため、術後3日間連続してペニシリン(30,000 U/kg)を筋内投与してください。
6. マウスの一般的な状態を毎日観察し、必要に応じて迅速に症状治療を行います。

4. 検知指標

注:マウスで4週間の重大な術後合併症なしの生存率は手術の成功とみなされます。

1. 手術時の重量と手術期間を記録し、各グループの体重、食事摂取量、死亡率、重篤合併症の発生を術後12週間毎週監視します。
2. 12週目には腹腔内ブドウ糖負荷試験(ipGTT)、インスリン負荷試験(ITT)、小腸トランジット検査などの代謝および腸内トランジット評価を行います。
   1. ipGTTの場合:12時間のFastマウス。尾端から1mmのセグメントを切り取り、空腹時血糖値を測定します(時間0)。体重2g/kgの量で20%のグルコース溶液を腹腔内に投与します。投与後15分、30分、60分、90分、120分に血糖値を測定してください。
   2. ITTでは6時間の速いマウスを使います。空腹時血糖値を測定してください。腹膜内注射でインスリン溶液(0.075 U/mL)を、体重0.5 U/kgの用量で投与します。注射後15分、30分、60分、90分、120分の血糖値を測定してください。
   3. 小腸の移動には、12時間の速食マウスを使います。10%の炭素粉末懸濁液を経口ガベージで、体重10mL/kgの用量で投与します。30分後にネズミを安楽死させます。清門から盲腸近位端まで、完全な小腸を切除します。腸通過比を、幽門から炭素懸濁液の前縁までの距離を小腸全長で割ったものとして測定します。
3. マウスを犠牲にしてスリーブ胃の解剖構造や小腸の形態を観察します。
4. 肝臓サンプルをヘマトキシリン・エオシン(HE)染色法とオイルレッドO染色法で染色し、血清総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、遊離脂肪酸(FFA)の検出のために血液サンプルを採取します。

5. 統計分析

1. すべての連続変数(体重、食事摂取量、小腸通過比率、血糖値、血清学的パラメータ)を平均±標準偏差として表します。
2. 二方向繰り返し指標(要因:グループと時間)を用いて縦断的な体重および食事摂取データを解析します。
3. 一方向ANOVAを用いて小腸トランジット比率と血清学的パラメータを解析します。
4. 腹膜内耐糖耐性検査(ipGTT)およびインスリン耐性検査(ITT)のデータでは、各被験者の曲線下面積(AUC)を計算し、一方向ANOVAを用いてグループAUC値を比較します。
5. 有意なANOVA結果が出た後、ボンフェローニ補正と事後ペアワイズ比較を行います。
6. 統計的有意性を p < 0.05と定義します。すべての統計解析はGraphPad Prism 9(GraphPadソフトウェア、サンディエゴ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国)を使用して実施してください。

結果

手術成功の基準は、マウスが手術後4週間以上重篤な合併症を経験せずに生存したことと定義されました。術後4週目以降に発生した死亡は合併症に起因します。術後12週間連続観察中、SC群では術後24日目に縫合による創傷および腹部感染による死亡が1例記録され、残りの9匹は12週まで生存しました。SS群では合計5頭のマウスが死亡し、死亡時刻は術後5日目、7日目、12日目および術後7週目と12週目に発生しました。最初の2人の死亡は過度の筋力低下に起因し、3人は袖状胃閉塞と感染、最後の2人は重度の腹部粘着性腸閉塞による死亡が原因でした。SH群のマウスは全て術後12週まで生存しました(図3)。術後生存率はSC群でSS群に比べて有意に高かったことが明らかでした。

SC群のマウスの高い術後生存率は、主にこの手技の簡便さに起因していると考えられます。使い捨ての結紮クリップの使用により、スカウンセル群の平均手術時間はSS群よりも有意に短くなっていました(20.9±3.18分対43.9...

ディスカッション

使い捨ての結紮クリップを用いたマウスSGモデルが確立され、シンプルで効率的かつ再現性の高い手術が実現しました。クリップベースの技術は、従来の縫合を基盤としたSGモデルと同等の治療効果を一貫して示し、手術時間を大幅に短縮し、術後の生存率を向上させました。

マウスSG縫合モデルの手術技術は本質的に複雑ではなく、血管縫合に詳しい多くの外科医がこの手術を成功裏に行うことができます。82件の研究を対象としたレビューでは、マウスSGモデル¹²の術後死亡率平均が17%であると報告されています。不安定または再現が難しい動物モデルは研究ツールとしては適していません。従来のマウスSG縫合モデルは、複雑で時間のかかる操作、急な学習曲線、そして複雑な解剖学に大きく影響されています。まず、マウスの胃内の小さな血管の密集ネットワークが、切断および縫合の際に大量の出血を引き起こします。第二に、胃内容物は汚染の原因となり、術後感染のリスクを高め^ます。最...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アナーディアン解	プロスペリッチ	HC-3566	胸部と腹部の皮膚を滅菌してください
アルコール度数75%	マックリン	E885996-500ml	手術台を掃除しろ
動物麻酔装置	YuyanBio	Yuyan-ABS	マウス麻酔機器
アプリケーター	杭州康吉	& Phi;10mmと時間;330mm	使い捨てリガチャークリップアプリケーター
使い捨てのリガチャークリップ	杭州康吉	KJ-JZJ02XL	胃スリーブを作る
電気外科用鉛筆	YuyanBio	ジェミニ(バッテリー駆動)	手術中の電気凝固止血。
確実に	アボット研究所	H20181147	液体食
血糖値とテストストリップ	アクチュ・チェック	案内して	血糖値モニタリング
GraphPadソフトウェア	アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ	GraphPad プリズム9	データ統計と分析
ヒートパッド	RTtech(RTtech)	RT-jr01	手術中はマウスの体温を温かく保ちましょう
高脂肪食	リサーチ・ダイエッツ社	D12492	脂肪60kcal%です
イソフルラン	後輪駆動	R510-22	麻酔薬
メロキシカム	アラジン	M129228-25g	術後鎮痛薬
顕微外科器具	ビヨタイム	FS500	動物手術を行う
マウスリトラクター	チウポック	CP-ckq	マウスにおける腹部外科的後退
外科的縫合	金環医療	CR537/KCR631	外科的縫合