マイクロ流体システムを用いて、栄養培地が緑 膿菌 バイオフィルムの発生に与える影響をリアルタイムで可視化

サマリー

本プロトコルは、マイクロチャネル内の定常流環境下で、 Pseudomonas aeruginosa PAO1およびPA14バイオフィルムの発生に与えるリッチ(TSB)および最小(FAB)栄養培地組成の影響を評価します。

要約

病原性細菌である Pseudomonas aeruginosa は、多くの院内感染の主な原因であり、その抗菌耐性の高まりにより、重大な公衆衛生上の脅威となっています。本記事では、P . aeruginosa の2つの主要な菌株、PAO1とPA14におけるバイオフィルム発生のリアルタイム可視化と定量化のためにマイクロ流体システムを用いる包括的なプロトコルを提示します。この方法は、光学的に透明な多チャネルマイクロチャネルプレートを用いて、細菌培養液を連続的かつ安定した培地にさらすもので、トリプティック大豆ブロス(TSB)や炭素源濃度を変える修正最小限の嫌気性ブロス(FAB)を含む培地を連続的かつ一定の流れにさらし、臨床環境で見られる条件を模倣します。24時間にわたる自動リアルタイムイメージングにより、バイオフィルムの表面積、厚さ、表面粗さの成長と成熟を高度に再現性が高く捉えられます。実験目的は、両株のバイオフィルム形成が栄養培地組成の変化によって有意に影響を受けることを示すことです。この可視化プロトコルの目的は、定常層流条件下でバイオフィルムの動態を研究者が研究する方法を提供することであり、得られた知見を活用して院内環境での初期段階の P. aeruginosa バイオフィルムを根絶するための代替的・非抗菌的戦略の開発に活用できると考えています。

概要

この手法の目的は、トリプティック大豆ブロス(TSB)と改変最小限の精細嫌気性ブロス(FAB)という2種類の培養培地が、2つの Pseudomonas aeruginosa 株、すなわちPAO1株とPA14のバイオフィルム成長に与える影響を観察することです。 P. aeruginosa PAO1とPA14は一般的な実験室の参照株ですが、PA14株は植物から無脊椎動物に至るまで、より多くの宿主に感染します^1。TSB栄養ブロスは、2.5 g/Lのグルコースを炭素源とした汎用培養培地であり、有機窒素と自然糖供給のためのカゼインおよび大豆ペプトンの組成により、浸透圧平衡を維持する塩化ナトリウムを含むため、幅広い細菌を培養^{できます。}対照的に、最小FAB培地は、嫌気性細菌の成長要件を探るために、単一の炭素源を50倍に還元した濃度(50倍)で調合されます。PAO1およびPA14ひずみは一方向の層流にさらされ、壁せん断応力は0.01 Paと低かった。このせん断応力値は、嚢胞性線維症患者の気管支や消化管など、P . aeruginosaに定着した部位にしばしば存在します。バイオフィルムの成長は、リアルタイムのバイオフィルムパーセンテージ、表面積、厚さ、表面粗さの算術平均を評価することで24時間にわたって測定されました。

P. aeruginosaのバイオフィルムは院内感染のかなりの割合を占めており、嚢胞性線維症の患者の主要な死因の一つ^です。これまでの炭素源レベルが細菌バイオフィルム発生に与える影響に関する研究では、バイオフィルム発生における流体力学的流動性の重要な役割が無視され、P. aeruginosa感染部位を代表しないせん断応力値を用いていたり、実験後にバイオフィルムの動態的および形態学的解析のみを行ってきました。.これらの制限は、嚢胞性線維症患者の生理的環境をほぼ再現した定常状態のマイクロ流体チャネル内でのバイオフィルム発生のリアルタイムイメージングを用いることで解決されます。

この方法は、バイオフィルム形成の研究に用いられる他の技術に比べて大きな利点を提供します。24時間のバイオフィルム成長期間中のリアルタイムイメージングの適用により、乾燥や化学的改変が不要で、形成中のバイオフィルムが乱されることなく組成の変化を避け、サンプル操作を必要とする方法よりも代表的な結果^{が得られます。}さらに、一定の流体力学的流れ条件を適用し、炭素源濃度を大きく変化させることで、この手法によりP. aeruginosaの院内感染部位で見られる生理的環境をより正確に再現できます。これにより、96ウェルマイクロタイタープレートやクーポンのような静的アッセイを用いた方法よりも、流体フローがバイオ^{フィルム形成に}与える重要な影響を捉えきれない方法に比べて、より代表的な手法^{となっています。}

使用されたマイクロ流体装置は、その寸法が細気管支や気管支¹²など肺の一部と似ているため、特に選ばれました。さらに、P. aeruginosa感染症は重度の火傷傷患者にとって大きな懸念事項であり、血糖値が患者の正常範囲から大きく変動することがあります^13,14。

このプロトコルは特にP . aeruginosaの2株を用いていますが、同様の条件下で感染を引き起こしたり、領域に定着したりする他の細菌の初期発生の研究にも応用可能です。さらに、他の栄養媒体組成や流れ条件(例:パルサタイル流や振動流、より高い壁せん断値)も同じ方法論で調査可能です。

プロトコル

1. ガラス製品の洗浄

1. 培地と寒天用の200mLのガラス瓶を2本、1リットルのガラス瓶3本を10%塩酸(HCl)浴に室温で約5分間浸します。
   注意:塩酸は腐食性があります。すべての酸の取り扱いは、化学煙幕フード内で適切な個人用防護具(白衣、手袋、目の保護具)を着用して行ってください。
2. その後、HCl浴からグラスを取り出し、水道水で2回、蒸留水(dH_2O)で1回すすぎます。

2. トリプティック大豆ブロス培地の調製

1. TSB溶液を準備し、清潔な計量船を使ってTSB粉末6g/200mLを計量し、精密な天秤を使います。
   注:使用されるTSB粉末の組成は以下の通りです:デキストロース(2.5 g∙^L-1)、リン酸二カリウム(2.5 g∙^L-1)、膵臓のカゼイン消化(17 g∙^L-1)、大豆粉のパパイック消化(3.0 g∙^L-1)、および塩化ナトリウム(5.0 g∙^L-1)。
2. 計量シリンダーを使ってdH₂Oを200mL測定し、洗浄したガラス瓶の一つに注ぎます。
3. 6gのTSBを200mLのdH_2Oを含むきれいなガラス瓶に加え、瓶をしっかり密封して約2分間混ぜて粉末を溶かし、TSB溶液培地を作ります。
4. オートクレーブTSB媒体溶液を15〜20分間、121°C、圧力1.5気圧で溶液を滅菌します。
   注:(一時停止点)TSB溶液は使用間に室温(約20°C)で保存でき、将来の実験に利用可能です。

3. 厳密な嫌気性ブロス培地の調製

1. FABメディアのトレースメタル溶液を準備します。
   1. 0.5〜210gの質量を測る場合は、別々の清潔な計量船とヘラを使用し、0.001〜0.5gの質量を計量するときは解析天秤を使いましょう。以下の成分とその量を測定します:CaSO_{4.2H 2}O (200 mg∙^L-1)、FeSO_{4.7H 2}O (200 mg∙^L-1)、MnSO₄。H₂O(20 mg・^L-1)、CuSO_{4.5H 2}O(20 mg・^L-1)、ZnSO_{4.7H 2}O(20 mg・^L-1)、CoSO_{4.7H 2}O(10 mg・^L-1)、NaMoO₄.H₂O(10 mg∙^L-1)、および H₃BO₃(5 mg∙^L-1)^7,9。
   2. 各成分を1Lの洗浄済みガラス瓶に1LのdH_2Oを入れ、dH_2Oとよく混ぜます。
   3. 残りの2本の1リットル滅菌ガラス瓶にそれぞれ1mLずつ、1LのdH_2Oを加えて十分に混ぜます。
2. 20 mMのナトリウムシエン酸塩補給FABを一晩培養用に準備します
   1. 以下の成分とその量を、別々のクリーンな計量船とヘラを用いて測定し、0.5〜200gの質量を計量するときは精密な秤、0.001〜0.5gの質量を計量するときは解析用秤を使います。クエン酸ナトリウム(20 mM)、(NH₄)₂SO₄ (2 g∙^L-1)、Na₂HPO_{4.2H 2}O (6 g・^L-1)、 KH₂PO₄(3 g∙^L-1)、NaCl(3 g∙^L-1)、MgCl₂(93 mg∙^L-1)、CaCl₂(11 mg∙^L-1)^7,9.
   2. 残りの1リットルの滅菌済みガラス瓶に、1リットルのdH、₂オー、1mLの微量金属溶液を入ったものにすべての成分を加えます。
   3. よく混ぜてください。
3. バイオフィルム成長用に0.3 mMグルコース補給FABを準備します。
   1. 20 mMのクエン酸ナトリウムを0.3 mMのグルコースに置き換えます。ステップ3.2.1に記載された成分と質量を使いましょう。
   2. 残りの洗浄済み1リットルのガラス瓶に、0.3 mMのグルコースFAB成分を1 mLのdH₂Oに加え、1 mLの微量金属溶液を加えてよく混ぜます。
4. 蒸気温度121°C、圧力1.5気圧で15〜20分間オートクレーブ処理を行い、メディアを滅菌します。
   注:(一時停止点)ファブ培地溶液は使用間に室温(約20°C)で保存でき、今後の実験に利用可能です。

4. TSB寒天製製

1. 精密バランスと洗浄済みの計量船、ヘラを使って8g/200mLのTS寒天を測定します。
2. 同じ精密な秤を使って、別の計量船で細菌学用グレードの寒天1g/200 mLを測定します。
3. 計量シリンダーを使って200mLのdH_2Oを測定し、最後に洗浄されたガラス瓶に注ぎます。
4. 両方の寒天成分を200mLのdH_2Oに注ぎ、よく混ざります。
5. 121°Cの温度、1.5気圧の圧力で15〜20分間のオートクレーブで培地を滅菌します。
   注:(一時停止点)TSB寒天は使用間に室温(約20°C)で保存でき、今後の実験で使用する前に再加熱が必要です。

5. ペトリ皿( Pseudomonas Aeruginosa )の培養

1. 寒天を電子レンジで約5分間溶かし、溶液が液体になるまで加熱します。
2. クラスII安全キャビネットの表面を70%エタノール溶液で開封・消毒し、使用準備を整えてください。このクラスII安全キャビネット内で、このセクションのすべての手順を実行してください。
3. 寒天溶液25mLを50mLのバイアルに計り、90mmのペトリ皿に注ぎ、寒天が固まるのを待ちます。
4. P . aeruginosa PAO1およびPA14の凍結ストックを-80°Cの冷凍庫から回収してください。ストックをインキュベーターに37°Cで約5分間、または内容物が完全に解凍されるまで置きます。
5. 接種ループを解凍した P. aeruginosa のストックのいずれかに浸し、サンプルを寒天に広げます。
6. 他の P. aeruginosa 株についてもステップ5.5を繰り返し、PAO1株とPA14株の2つの別々の P. aeruginosa ペトリ皿培養を作ります。
7. 各ペトリ皿にP . aeruginosa の株、復活日、イニシャルをラベル付けし、37°Cで16〜18時間インキュベーターに入れます。
   注:(一時停止点) P. aeruginosa PAO1およびPA14ペトリ皿は、4°Cで最大4週間の保存期間を保有し、今後の実験に利用可能です。

6. 緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa )PAO1およびPA14グリセロールストック

1. クラスIIの安全キャビネットを開けて消毒し、夜間培養液を収めるために50mLバイアルを8個選びます。
2. 事前に製造したTSBおよびクエン酸ナトリウムFAB培地(セクション3)を用いて、8本のうち4本に5mLのTSB培地を注ぎ、残りの4本にクエン酸ナトリウム最小限のFAB培地を注ぎます。
3. 以前に培養したペトリ皿と接種ループを使い、 P. aeruginosa PAO1ペトリ皿内の5つの別々のコロニーに触れ、TSBバイアルのいずれかに移します。これをシトウム酸ファブ培地と P. aeruginosa PA14株のペトリ皿についても繰り返します。
4. クリーンな接種ループを残りの4つのTSBおよびナトリウムシトレートFABメディアバイアルに直接浸し、コントロールを形成します。
5. 8本すべてのバイアルを振動インキュベーターで200 RPM、37°Cで16〜18時間培養し、明確にラベルを付けます。
6. 培養バイアルを回収し、P . aeruginosa で接種されたものが濁っているか、対照群として使われているものが透明であることを確認してください。
7. 4つの P. aeruginosa接種バイアルを4000× g で20°Cで5分間遠心分離し、P . aeruginosa を培養培地から分離します。遠心分離機のバランスを保ちましょう。
8. 上清液は無視し、遠心分離後にP. aeruginosaのペレットを15%グリセロールを含む溶液1mL、グリセロール150μL、新鮮TSBまたはシトウム酸ナトリウムFAB培地850μLで再懸濁します。
9. 再懸濁培養液を1 mLのバイアルに移し、-80°Cの冷凍庫に入れます。
   注:(間)グリセロールストックは長期保存のために-80°Cで保存でき、将来の実験に利用可能です。

7. 夜間培養の光学密度測定

1. ステップ6.1–6.5を繰り返し、TSB中型バイアルを2本、1本を対照、もう1本をPAO1 P. aeruginosa 株で使用します。
2. クラスII安全キャビネット内の1 mL分光光度計バイアルにTSB培地1 mLをピペットし、2つ目のバイアルに0.9 mLのTSB培地を移し、夜間培養液0.1 mLを補足します。
3. 分光光度計を600 nmの光波長に設定し、1 mL TSB分光光度計バイアルを使って機器を校正し、0.1 mLの懸濁バイアル¹⁵の光学密度を測定します。
   1. 測定された吸収度が0.1でない場合は、必要なサスペンション容積を再計算してください。
      注:吸光度0.1(V₁)を得るために必要な懸浮液の体積は、初期0.1 mLの懸濁バイアル吸光測定値C ₁、調整される望ましい吸収量C ₂、そして一晩中集中する集中懸濁液の体積_V2を用いて計算できます。
      C₁V₁ = C₂V₂
      上記の例では、 C₁ = 3.59、 C₂ = 0.1、 V₂ = 10 mLの場合、10 mL溶液中に必要な一晩懸濁液の体積は0.279 mLとなります。
4. TSB培地10mLを50mLのバイアルに計測し、10 mL 0.1 OD 600 nm懸濁液を作るために必要な浮遊量と同じ量のTSB培地を除去します。一晩培養液を使い、懸濁液の計算量を加え、約5秒間渦を流して混合します。
5. 調整された10 mL懸濁液のうち1 mLを分光光度計バイアルに移し、吸収を0.1にして再測定します。
6. PA14およびTSB培地、P . aeruginosa 株とシエン酸ナトリウムのFAB培地について、上記の7.1–7.5を繰り返します。

8. 生存可能な細胞数

1. dH₂OをクラスII安全キャビネット内の四角いペトリ皿に移し、マルチチャンネルピペットを使って透明な96ウェルポリスチレンプレート¹⁶の2〜9列に180μLを移します。
2. 10 mL 0.1 OD 600懸濁液を別の正方形ペトリ皿に移し、マルチチャネルピペットを用いて200 μLの懸濁液を96井戸ポリスチレン板の1列に移します。
3. 96ウェルのポリスチレン板の1列からマルチチャネルピペットを使ってチャネル2に20μL以上の懸濁液を移し、その後チャネル2の希釈懸濁液20μLをチャネル3に移し、チャンネル9に繰り返し、^10-1 から^10-8へと懸濁を希釈します。
4. TS寒天50mL(セクション4およびステップ5.1)を、バイアルを使ってクラスIIの安全キャビネットに移し、四角いペトリ皿に移し、寒天が濁るまで放置します。
5. 各ウェルから2〜9列に10μLを多チャネルピペットを用いてTS寒天ペトリ皿にカラム状に移し、カラム同士が接触しないようにします。
6. TS寒天を37°Cで24時間培養し、移された希釈液が落ち着くまで待ちます。
7. ペトリ皿が可算かどうか(30〜300コロニーの間)を判定することで、コロニー形成単位(CFU)を1ミリリットル(mL)で計算します。
8. 使用された10 mL懸濁液の希釈係数を決定します。この場合、サスペンションは1/10(0.1 OD 600)に希釈されました。
9. 各メッキカラムの希釈係数を計算します。これは、各カラムに加えられた希釈された懸濁液の量を、サスペンションを加えた後のカラム全体の体積で割ったものです。96ウェルプレートの第2列(ペトリ皿の第1列)の場合、20 μL/200 μL = 1/10です。
10. 各列の希釈係数を掛け合わせて計算します。
    注:この場合、各カラムから次のカラムへ20μLが移され、各カラム井の総体積は200μLとなり、各シリーズの希釈は1/10となりました。これにより、全体の系列の希釈は10^{×8となります}。
11. 96ウェル板からペトリ皿へ希釈される際の希釈係数を決定します。CFU/mLを求めるには、各カラム(10μL)の体積を1mLで割ります。この場合、 。
12. 最終的な希釈係数は、元の懸濁希釈係数(0.1)に全系列希釈係数(1×^10-8)、および板金希釈係数()を掛けて算出します。
13. 元の試料のCFU∙^mL-1 を計算し、プレート上のCFUに最終希釈係数の逆数を掛けます。
    注:この場合、200 CFUと数えた場合、200 × 1/1 × ^10-8を実施することになり、CFU/mLは2 ×^{10 10} CFU∙^mL-17となります。

9. マイクロ流体システムのセットアップと実験運転

1. P . aeruginosa の各株に培地5mLブロスを接種し、37°Cで16〜18時間培養します。
2. マイクロ流体システムと関連ソフトウェアをセットアップします。
   1. マイクロフルイドシステムのコンポーネントを次の順に起動します:電源、マイクロフルイドシステムコントローラ、CMOSカメラ、エンクロージャーヒーター、顕微鏡、コンピュータ、および関連モニター。
   2. マイクロ流体ソフトウェアを起動し、マルチチャネルプレートの側面にある48ウェル0–2Paマルチチャネルプレート関連バーコードを入力することで、制御モジュールインターフェースを起動します。
3. P. aeruginosaのマルチチャネルプレートウェル接種手順を設定してください。
   1. 一晩培養の光学密度を0.1 OD₆₀₀に調整してください。
   2. クラスII安全キャビネット内の6つのチャンネルそれぞれの出口ウェルに、0.1 OD 600サスペンション50 μLを並列に移します。
      注:異常結果の特定可能性を最大化するために、6つのチャネルが同時に並列に実行されました。
   3. 48ウェルのマルチチャネルプレートカバーを交換し、システムインキュベーター内の可動ステージに移して固定します。
4. P . Aeruginosa の多チャネルプレートチャネル接種手順をセット。
   1. マイクロ流体チャネルを選定し、マイクロ流体制御モジュールで以下を選択します:手動>カラム1–4 >流体:TSB、37°C>最大せん断(Pa):0.1(1ダイネ∙^cm-2 = 0.1 Pa)および48ウェル0–2 Pa多チャネルプレート図の出口井戸を選択してください。
   2. 中 止 ボタンを選択して2〜4秒後にフローを停止し、プレートを30分間放置して、セルがチャネル基板に確実に付着しているかを確認してから連続フローを開始します。
      注:30分間の持続時間は、重力によってプランクトン性 P. aeruginosa 菌がチャネルの底壁に付着するのを助けます。この期間は細菌の種類や栄養培地によって異なります。
   3. 可動式インキュベーターステージからマルチチャネルプレートを取り外し、クラスII安全キャビネットの6つのチャネルそれぞれの入口に新鮮なTSB1mLを移します。
   4. マルチチャンネルプレートをインキュベーター内の可動ステージに移し、固定します。
5. AutoRunを設定してください。
   1. 24時間の実験で使用された流量が、P . aeruginosa が自然界でどこに存在するかを把握し、 手動 の> せん断応力0.01 Paに切り替え、表示された体積流量(μL⋅^h-1)を記録します。この値を48ウェルマイクロチャネルプレートで8.2μL⋅^h-1と確認してください。
   2. 体積流量を^m3∙^s-1に換算し、チャネル断面積(^m2)を計算し、0.01Paの流体力学的せん断応力時の流速を算出します。
      注:流体体積流量の方程式を用いて再配置することで、チャネルを通過する流体速度を計算できます。
      
      ここでUは流体速度(m∙^s-1)、Aはマルチチャネルプレート内のチャネルのマイクロチャネル断面積(^m2)です。
   3. TSB培地の密度ρおよび動粘度μを用いて流れレイノルズ数を計算し、 P. aeruginosa バイオフィルムが検出される流体流量の範囲内であることを確認します。流体力学的せん断応力が0.01Paの場合、TSBとFAB媒体でそれぞれレイノルズ数が0.0117と0.0165であることを確認してください。この範囲外の場合は、流体の状態がTSBに設定されているか確認してください。
      
      ここで D_h は使用されるマイクロチャネルの水圧直径で、次のように得られます:
      
      ここで、w、hは使用されるマイクロチャネルの幅(m)と高さ(m)を表します。
   4. 画像取得領域内の流体の流れが完全に発達していることを確認するために、流体現像長を計算します。
      注:チャネルを通る層流の展開長は、レイノルズ数Reとチャネルの水圧直径Dhを用いて計算できます。
      L_dev = 0.06ReD_h
   5. 自動実行を設定してください: 自動実行 > プロトコル設定 >時間: 24時間、繰り返し1回、せん断応力0.01Pa。 プロトコルを保存します。
   6. シーケンス セットアップ タブで、新しく作成したプロトコルを1回繰り返し適用してチャネル1–6に新しいシーケンスを作成し、流体( TSB)を37°Cで選択します。このシークエンスを保存してください。
6. 多次元取得ウィンドウを使って画像取得を設定してください。
   1. システムソフトウェアで「 多次元取得 」を選択し、その後「 ライブ 」ボタン( 多次元取得 ウィンドウの左下)を押してください。顕微鏡ステージを操作し、 ライブビュー ボタンとカメラの倍率5×から40×を操作してチャンネル1から6を操作し、カメラの視野に1チャンネルずつ表示します。
   2. カメラの画像取得準備:多次元取得>保存:保存する画像のディレクトリを選択してください > タイムラプス:持続時間:24時間、流体力学的な流れと同じ時間 > 時間間隔:各取得画像間の時間、10分に設定。
   3. カメラ設定を入力してください。 波長 > 照明: 明るさ:50%カメラ 50%:白黒 > 自動露出:すべての撮影 > 取得:すべての時間点 > オートフォーカス:なし。
   4. 倍率を20×に設定して、665.6 μm×665.6 μmの視野角を作り、チャンネル視聴領域の中央にチャンネル番号を刻み込むために、バイオフィルム画像をキャプチャするカメラの位置を決定します。
   5. ステージの位置をカメラに記録するように追加し、 ステージ ラベルに位置を付け、追加ボタンを選択してディレクトリに追加します。
      1. チャンネルの観測領域の入口から0.9984 mmの上流点と3.0016 mmの下流点についても繰り返します。ここで位置はカメラの視野の中央点を表します。
         注:これらの画像位置は、観察領域に沿ったバイオフィルムの成長を表現しつつ、内部の流れが完全に発達することを確実にするために選ばれました。これにより、各マイクロチャネルごとに3枚の画像が取得され、この場合は10分ごとに18枚の画像が撮影されます。
7. 実験的実行
   1. システム 制御モジュール のウィンドウで、 AutoRun を選択し> Run Setup > Sequence:0.01 Paのシーケンスを選択し、 その後「start」を選択してください。
   2. すぐに、 多次元取得 ウィンドウ> 取得に移動します。これにより、24時間の実験手順で10分ごとに18枚の画像を取得し、実験終了時には2610枚の画像が生成されます。
      注:上記のセクションは、最初の実験から約48時間後に同じ条件下でさらに6マイクロチャネルで再現されたものです。

10. Zスタック蓄積

1. 各実験実行の最後に3つのチャンネルを選択し、40×倍率で3つのセクションからなるzスタックを取得します。これは「>Zシリーズ」以外のすべてのオプションをオフにして40倍率で行われます。
2. 多次元取得でチャネルのセクションを選択した後、Zシリーズに移動し、インタラクティブ設定>インクリメント:0.5、両方のチェックボックスを解除します。
3. 顕微鏡のフォーカシングノブを使い、バイオフィルムがピントが合わないまで回転させ、Z距離を「 Set Top To Current」を選択して入力します。この手順を繰り返しますが、フォーカシングノブを逆方向に回し、「 Set Bottom To Current(最下位に)」を選択します。これにより、顕微鏡はzスタックを捉えるための射程が得られます。
4. 保存ウィンドウ内のフォルダを選択してzスタックを保存し、ウィンドウ右下の「取得」を選択して取得を開始します。

11. 実験後の画像およびデータ解析

1. バイオフィルムの割合表面積の被覆データを取得します。
   1. 取得した画像をシステムソフトウェアに読み込むには、以下を選択してください:分析ツール > 多次元データをレビュー > ベースファイルを選択し > ディレクトリを選択してください。保存済み画像があるフォルダ> 「波長1>表示」、中央の横スクエアセクションで取得した画像数を横に表示し、上部の小さなグレーのボックスを右クリックします。 左隅。
   2. 各チャンネルセクションの画像を一つずつ読み込み、 ステージ位置を選択し、表示>画像 を読み込む位置を選択します。画像シリーズをTIFFファイルとして保存してください。
   3. 画像の閾値設定は、バイオフィルムをハイライトした暗い物体の自動閾値>選択し、その後長方形領域ツールで画像を囲みます。
      注意:しきい値画像の左側にあるスライダーは上下に動かせ、しきい値の強度を変化させ、バイオフィルムと背景を区別しやすくします。画像に影がある場合は、影のない部分を囲んでください。影はデフォルトで強調されている可能性があり、測定値が変わっている可能性があります。
   4. システムソフトウェアウィンドウでMM 標準 > 測定 > 領域測定を選択し 、長方形枠内のハイライトされたバイオフィルムのデータ表(し きい値面積%を含む)を生成することで、画像中の24時間実験におけるバイオフィルムの表面積の割合を取得できます。ログファイルを開いて保存するには「 Open Log 」を選択し、データをログファイルに入力するには F9: log Data を選択します。
   5. スプレッドシートを開き、各チャネルセクションの24時間バイオフィルムデータを用いて、24時間のバイオフィルムの表面積被覆率を示すグラフを作成します。
2. バイオフィルム厚さと算術的平均表面粗さを取得します。
   1. 保存済みファイルをFijiコントロールバーにドラッグして8ビット画像に変換し、ZスタックをFiji(ImageJ)に保存しました。画像>タイプ>8ビットに変換します。
   2. バイオフィルムとチャネル表面のコントラストを上げて不要なノイズを除去します:画像>明>コントラストを調整。
   3. 画像のしきい値を設定し、バイオフィルムのピクセル値を255(白)、背景のピクセル値を0(黒)に設定します。画像>しきい値を調整>。
   4. 画像のスケールを設定し、解析>スケール設定 >ピクセル単位:2048 > 既知距離:332.8 >ピクセルアスペクト比:1.0 > 長さの単位:μm。
      注:既知の距離は332.8μmで、使用された浜松カメラは2048 × 2048ピクセルの画角を持ち、各ピクセルのサイズは6.5 μm、画像は40×倍率で撮影されました。
   5. カスタムマクロ¹⁸ (補足ファイル1)を用いてZスタックを解析し、各zスタックスライス上のバイオフィルムの表面積を計算・合計し、入力スケール値を使って系列の厚さを計算し、体積を特定できるようにします。あるいは、計算された体積を表面積で割ってバイオフィルム厚を求める方法もあります。
   6. 各zシリーズのバイオフィルムの算術平均表面粗さ値は、ImageJ(Fijiではない)プラグイン SurfCharJ をダウンロードしてプラグイン フォルダ に保存することで取得できます。
   7. 保存したスタックをコントロールバーにドラッグして32ビット画像に変換して、ZスタックをImageJにアップロードします: 画像 > タイプ:32ビット。
   8. 表面プロットを作成し、スタックの表面全体にわたるグレー値の変動を示します:プロットプロファイル>解析 > 詳細:高解像度プロット。高解像度プロットを32ビットに変換してください。
   9. SurfCharJプラグインを起動して算術平均表面粗さ値を得ます:SurfCharJ >> Roughness 計算:平均サンプリング長(): 10)。
      注意:SurfCharJプラグインは、zスタックの表面に沿った様々なグレー値を使って算術平均表面粗さを計算します。表面粗さパラメータを含む表が作成されます。唯一重要なパラメータは算術的意味の表面粗さRa_です。表の値はピクセル単位からマイクロメートルに変換する必要があります。

結果

このセクションでは、上記のプロトコル手順を適用した場合の代表的な結果を示します。すべての実験は少なくとも3つの独立した生物学的複製体で行われ、それぞれ6つの平行チャネルで構成され、データは平均±標準偏差として提示されています。すべてのグラフの誤差バーは、図の凡例で定義された標準偏差を表しています。

PAO1およびPA14ひずみの37°C、TSB媒体、0.01Pa流体力学的壁せん断応力下での成長は、図1に示されています。図は、実験初期段階でPAO1株がPA14よりも基質表面の大部分に定着していることを示しています。PAO1株の初期付着率が高いことは現在の文献と一致しており、この株は^{比較的早く}表面付着を形成する表現型であることを示唆している。しかし、PA14が植株する表面積は実験開始から約11時間後にPAO1株を上回り、PAO1株が植え付ける基質面積は減少し始めました。PAO1による基質コロニシ...

ディスカッション

このプロトコルを構成するいくつかの重要なステップにより、従来の代替手法よりもバイオフィルム形成のより包括的かつ正確な解析が可能になります。重要な要素は、48ウェルのマイクロチャネルプレートの使用で、350μm×70μm×4mm(W×H×L)のマイクロスケールチャネルが採用されています。これらの寸法は、尿路カテーテルや嚢胞性線維症患者の肺細管支など、病院環境で見られる流れ条件や微小環境を特有に再現しています(^12,21,22,23)。実験的な実行ごとに6つの並列チャネルが使用され、各実行は少なくとも3回繰り返されました。この繰り返しは、細菌の本質的な確率的性質からデータの整合性を確保するために極めて^{重要です。}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
(NH<サブ>4)2SO<サブ>4	アクロス・オーガニクス	7783-20-2	改造されたFABメディア用
48ウェル0-2 Paマイクロチャネルプレート - ガラスカバースリップ	セルマイクロシステム	910-0047-5パック	メディアフローおよびバイオフィルム 成長のためのマイクロチャネル、リアルタイムイメージング
-80 & deg;C冷凍庫	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	1.16057E+15	グリセロールストックを保管し、使用まで待つため
寒天、細菌学グレード	アクロス・オーガニクス	443570010	寒天培地用 - 細菌の培養
分析的均衡	VWR	VWRI611-2297	使用されるメディアの構成要素を測定するために
オートクレーブ	プライオルクレイブ	4304	ガラス製品の滅菌
バイオフラックス1000HT	I&L バイオシステムズ	https://il-biosystems.com/cell- マイクロシステム/デバイス/バイオフラックス-1000ht- せん断流システム/	マイクロチャネルフローおよびバイオフィルム成長実験のために
バイオフラックス制御モジュール	I&L バイオシステムズ	https://il-biosystems.com/cell- マイクロシステム/デバイス/バイオフラックス-1000HT-せん断流-システム/&NBSP;	マイクロチャネル内の培地の流れとバイオフィルムの成長を設置・監視すること
BioFlux モンタージュソフトウェア	I&L バイオシステムズ	https://il biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf	マイクロチャネル内の培地の流れとバイオフィルムの成長を設置・監視すること
CaCl2	フィッシャー・サイエンティフィック	10043-52-4	改造されたFABメディア用
CaSO4.2H2O	ケムクルーズ	A1719	1Lの最小金属溶液の場合
クリアポリスチレン96ウェルプレート	コーニング、コスター	CLS7007	生存可能な細胞数の場合
CoSO4.7H2O	シグマ・オルドリッチ	10026-24-1	1Lの最小金属溶液の場合
CuSO4.5H2O	ハネウェル	209198-100G	1Lの最小金属溶液の場合
エッペンドルフ真空管 3810X	エッペンドルフ	30125150	P. aeruginosaグリセロール株について
FeSO4.7H2O	VWRインターナショナル株式会社	284005E	1Lの最小金属溶液の場合
フィジー(ImageJ)	国立衛生研究所	https://imagej.net/software/fiji/downloa DS	Zスタック画像処理
グルコース	シグマ・オルドリッチ	50-99-7	グルコース改性FAB培地用
グリセロール	シグマ・オルドリッチ	56-81-5	P. aeruginosaグリセロール株について
H3BO3	フィッシャー・サイエンティフィック	10043-35-3	1Lの最小金属溶液の場合
浜松オルカフラッシュ4.0カメラモデルC11440- 42U	浜松	C11440-42U	マイクロチャネルフローおよびバイオフィルム成長 実験のリアルタイムイメージング
KH2PO4	フィッシャー・バイオリエージェント	7778-77-04	改造されたFABメディア用
メチル化スピリット	シグマ・オルドリッチ	2857	微生物学キャビネットの掃除は、使用前後
MgCl2	シグマ・オルドリッチ	M8266-100G	改造されたFABメディア用
微生物学キャビネットクラスII	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	42111226	細菌、ブロス、寒天を汚染せずにプロトコル手順を実施するために
ミニインキュベーター	Labnet International	SN03171014	PAO1およびPA14を-80度&度後に解凍するために;C冷凍庫と で、初期24時間の細菌寒天プレート増殖に使います
MnSO4。H2O	シグマ・オルドリッチ	10034-96-5	1Lの最小金属溶液の場合
Na2HPO4.2H2O	シグマ・オルドリッチ	10102-40-6	改造されたFABメディア用
NaCl	シグマ・オルドリッチ	S5886-500G	改造されたFABメディア用
NaMoO4。H2O	シグマ・オルドリッチ	10102-40-6	1Lの最小金属溶液の場合
精密バランス	VWR	VWRI611-2299	使用されるメディアの構成要素を測定するために
冷蔵遠心分離機	ヘレウス	40289841	グリセロールストックのP. aeruginosa培養液と 上清液の分離
セミマイクロキュベット	アルファ・ラボラトリーズ	X72053	光密度測定のために
シェイキングインキュベーター	INFORS HT	https://infors- ht.com/en/products/incubator- シェイカー/マルチトロン標準	夜間培養用
クエン酸ナトリウム	シグマ・オルドリッチ	71498-250G	シトレートナトリウム改質FAB培地用
滅菌プラスチック接種ループ	マイクロスペック	15782105	P. aeruginosa のPAO1およびPA14を寒天プレートおよびファルコンチューブへの接種
トリプティック大豆寒天、ベジトン	ミリポール	14432-500G-F	寒天培地用 - 細菌の培養
トリプティック大豆ブロス	シグマ・オルドリッチ	T8907	脱水培養培地 - 6 g/200 mL
タイプ1 給水器	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	SN42103311	ディスタイル水の場合
ZnSO4.7H2O	フィッシャー・サイエンティフィック	7446-20-0	1Lの最小金属溶液の場合