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方法論記事

マウスの坐骨神経に対する単極高周波による熱損傷モデル

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DOI：

10.3791/69998

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2026年4月3日

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1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2National Medical Center for Neurological Diseases, 3National Clinical Research Center for Geriatric Diseases

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この研究では、マウスの坐骨神経に高周波システムを適用し、熱神経損傷の高周波アブレーションモデルを確立しました。このアプローチはマウスの末梢神経熱損傷モデルにおける制御可能性の問題を解決し、神経損傷修復および神経障害性疼痛の研究における実用的なモデリング手法を提供します。

要約

末梢神経損傷はしばしば神経障害性痛みを引き起こし、神経修復のプロセスを誘発します。制御可能な物理傷害モデルは現在確立されていますが、既存の熱傷害モデルは探索的であり、制御可能性が低いままです。臨床現場では、組織や神経に熱損傷を誘発するために無線周波数アブレーション(RFA)システムが頻繁に用いられます。RFAは、神経に熱損傷を与えることで痛みの伝達を効果的に遮断することが示された治療法です。アブレーションの範囲は、特定のパラメータや影響を受けた神経分布領域のしびれや運動機能障害の程度を調整することで調整できます。本研究では、マウスの坐骨神経に75°Cを30秒間適用し、単極高周波システムを用いて安定的で制御可能な神経損傷モデルを作成しました。手術後7日目から14日目にかけて機械的離脱閾値(MWT)が有意に増加し、28日目までに回復が見られました。本研究はRFA神経損傷モデルの現在のギャップを解消し、RFA手技後に臨床的に観察された神経損傷を再現し、RFA誘発性神経損傷に関する今後の研究のための方法論的枠組みを提供します。

概要

神経障害性疼痛は、その痛みのメカニズムが引き続き調査されている中で、臨床管理において継続的な課題を抱えています。神経障害性疼痛の分子および細胞的メカニズムを研究するために、脊髄神経結紮(SNL)1、慢性収縮損傷(CCI)2、部分坐骨神経結紮(pSNL)3、坐骨神経切断(SNT)4、および保存神経損傷(SNI)5 が齧歯類において末梢神経損傷の模擬に成功裏に用いられています。モデルの制御性と安定性を高めるために、以前の研究では圧力計や選択的損傷などの改良が提案されており、これらは実装されています。

高周波技術は臨床的に良好な結果をもたらしていますが、いくつかの副作用も伴っています。例えば、手術6の止血に用いられる高周波アブレーション(RFA)は、器具の先端7の高温により周囲組織に熱損傷を与え、末梢神経の熱損傷のリスクを負うことがあります。さらに、三叉神経痛8、帯状疱疹後神経痛9、その他の神経障害性疼痛疾患の治療に用いられるRFAは、術後の一次性疼痛を軽減しますが、支配領域の長期的な術後しびれ、表層性痛覚亢進、その他の不快感を伴う10,11。その結果、末梢神経への熱損傷に関する研究は徐々に注目を集めています。しかし、既存の動物モデルでは熱損傷の温度、持続時間、位置を正確に制御できず、損傷の重症度の均一性が制限されています。

これまでの研究では、熱伝導棒を一定温度の水浴12 や温水ポンプに接続し、神経13に直接接触したゴム管に熱水を注入し、RFAが神経損傷に与える熱的影響を模擬しようとしています。しかし、従来の熱損傷モデルでは熱損傷のみを誘発しており、高周波電流やそのパラメータが神経に与える影響を排除していました。RFAによる損傷が単に熱的影響によるものなのか、それとも無線周波数パラメータの変化などの要因が神経に独自の影響を与えるのかは、まだ探求されていません。神経損傷に直接無線周波数熱凝固システムを用いる動物モデルが現在不足しているため、RFAに関連する神経損傷の研究進展が妨げられています。本研究では、単極RFAシステムを直接用いて、臨床現場でRFA手技に関連する神経損傷を模擬し、マウスの坐骨神経にRFA損傷を誘発しました。末梢神経に対するRFA損傷に関する基礎研究の方法論的参考文献を提供します。

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プロトコル

動物実験は首都医科大学玄武病院実験動物センターの動物倫理委員会により承認され、NIHの実験動物ケア・利用ガイド14に従って実施されました。成体のオスのC57BL/6マウス(生後8〜10週、体重20〜25g)は、1ケージあたり4〜5匹のグループ飼育として、管理された環境条件(22± 2°C、湿度50%〜60%、12時間の明暗サイクル、07:00に照明を点灯)のもとで、標準的な齧歯類の餌と水を自由に利用しました。すべての行動評価は、08:00から12:00のライトフェーズ中に実施されました。試薬、ソフトウェア、機器の詳細は 材料表に記載されています。

1. 麻酔とマウス製剤

  1. マウスには、体重10グラムあたり0.2mLの用量で20 mg/mLのトリブロモエタノール溶液を腹腔内注射して麻酔します。
  2. 綿のアプリケーターを使って両目に眼科軟膏を塗ります。
  3. マウスを左横の位置に置きます。右側の体毛(1cm×1cm)を電動カミソリで除去します(図1)。
    注:このステップは胴体と回路の負極との接触面積を増やし、回路抵抗を低減することを目的としています。
  4. マウスの胴体の一部を金属の負極板に右横向きで接触させます。胴体とプレートの接触面にイオン性液体(0.9% NaClまたは改良リンガー溶液;組成については 材料表 を参照)を数滴塗布し、電気伝導性を高めます。
    注意:頭部と顔はネガプレートから離して、目や他の臓器への意図しない電流流を防いでください。
  5. 左後肢を上向きに固定し、負極板に接着テープで膝を曲げます。左太ももの毛を取り除き、手術部位を75%エタノールで3回消毒します。
  6. 後肢や尾につまみ刺激を加えても撤退反応がないか確認し、麻酔の深さを十分に確認してください。
    注意:周術期中は局所麻酔薬(例:リドカイン)や非ステロイド性抗炎症薬(例:アセトアミノフェン)の投与を避けてください。これらの薬剤は術後の神経行動評価に影響を与える可能性があります。

2. 高周波焼灼手術

  1. 大腿骨を基準にしてください。マイクロハサミを使って大腿骨の長軸方向に1cmの皮膚切開を開き、尾側に0.5cmの外側並行をつけます(図2)。
  2. 皮膚切開部に沿って大腿二頭筋(BFM)を鈍く切り離し、微小鉗子で主坐骨神経幹を探します。坐骨神経は膝関節付近で分岐します(図3)。
  3. マイクロ鉗子を使って、坐骨神経幹を周囲組織から約2mm上から切り離し、長さは約5mmまで切り離します。鈍的分離時に血管を損傷しないようにしましょう。
    注意:偶発的な血管損傷の場合は、滅菌綿綿で血液を吸収し、適切な圧力をかけて出血を止めてください。血の漏れがなくなった後に手術を続けてください。
  4. RFA凝固針を高周波治療装置に接続します。針先を筋肉組織に平らに当てて抵抗を試します。抵抗が1 kΩを超える場合は、マウス本体と負極の間にドロッパーを使ってイオン液体を加え、抵抗が1 kΩ以下になるまで加えます。
  5. ガラスの分針で分離した坐骨神経を優しく持ち上げます。RFA針を坐骨神経の下に置き、露出した金属の先端は坐骨神経分岐部から3mm離れた位置に置きます(図4)。
  6. 放射線周波数治療機器のパラメータは以下の通りに設定されます:熱凝固モード、75°C、30秒、2Hz周波数、1msパルス幅。RFAエネルギー供給を起動。
  7. RFA針を優しく引き抜いてください。ピンセットを使って坐骨神経を再配置し、筋肉を持ち上げます。筋肉を6-0吸収性ポリグリコール酸(PGA)縫合糸で閉じます。皮膚切開部を4-0吸収性PGA縫合糸で閉じます。
  8. 手術後は、マウスを循環する温水ブランケット(38°C)または温度制御付き加熱パッド(37–38°C)に置き、トイレットペーパーやタオルで覆って毛を乾かし、直接的な熱による損傷を防ぎます。
  9. マウスをケージに戻し、麻酔からの回復を待ちます。定期的に入院し、切開部の完全性を毎日チェックし、食事量、水分摂取量、体の状態を監視してください。

3. 実験グループ

  1. RFAグループ:手順2.1–2.9に記載された完全なRFA手術プロトコルを実施します。
  2. シャムグループ:RFAグループと同一の手順を実行します(ステップ2.1–2.5および2.7–2.9)が、ステップ2.6でRFAシステムの配信を起動しません。RFA針を坐骨神経の下に30秒間保持し、電流を活性化させずに続けた後、ステップ2.7に進みます。
    注:Sham群は熱損傷とは無関係に外科的外傷、麻酔、神経操作、針の挿入をコントロールします。

4. MWTに対するフォン・フレイ評価

  1. 各テストの前に、ネズミをランダムにフォン・フレイのテストプラットフォームに入れます。探索行動が止まるまで15分間順応させてください。
    注:プラットフォームは、底部に0.6cmの穴×0.6cmの穴がある金属メッシュと、マウス用の赤い透明な容器がいくつかあり、互いに干渉せずに異なる容器に配置されています。
  2. フォン・フレイ評価をアップダウン法15で行います。フォン・フライファイバーワイヤーを装着し、左後ろ足の裏の中央を刺激し、わずかな曲げをさせます。3秒間、または離脱反応が起こるまで16秒を保ちます。
    注意:0.4gフィラメントでテストを開始してください。否定反応の後は次の高いフィラメントを、正の反応の後はさらに低いフィラメントを適用します。最初の方向転換後、さらに4件の申請を続けてください。実際には、この研究では2gのフィラメントが上限として設定されており、この力でフォン・フレイファイバーが前足を地面から持ち上げ、逃げたり引き抜いたりする反応を示さなかったためです。
  3. 応答を記録し、アップダウン法計算機(フォン・フレイ実験のアップダウン法、https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/)を使って50% MWTを計算します。
  4. 術前(ベースライン)および術後7日目、14日目、21日目、28日目、35日目にフォン・フライ検査を実施します。

5. DRG組織採取および免疫蛍光染色

  1. 術後7日目に、RFA群およびSham群からL4–L6 DRGを採取します。
  2. 組織を10%ショ糖パラホルムアルデヒドで4°Cで6〜12時間固定します。
  3. 組織を30%ショ糖-PBSで4°Cで一晩クライオプロテクトします。
  4. 組織を最適な切断温度の化合物17に埋め込む。
  5. 13μmのクライオスクリークを切断し、非イオン性界面活性剤で切片を透過させます。
  6. ブロッキング試薬を用いてブロッキングし、ポリクローナル抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
  7. 洗浄後、常温で2時間二次抗体と共に培養します。
  8. アンチフェードメディウムでマウントします。

6. 統計分析

  1. 正規分布の連続データを平均±標準誤差(SEM)として提示します。
  2. 独立標本t検定を用いてグループ間比較を行います。
  3. 分散の繰り返し測定分析(ANOVA)を用いて異なる時点のグループ内比較を分析します。
  4. 事後的なペアワイズ比較にはボンフェローニ補正を適用してください。
  5. すべてのデータを統計ソフトウェアで処理し、統計的有意性をP < 0.05に設定します。

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結果

モデル確立の成功は、術中および術後の両方の指標によって確認されました。RFA終了時(75°C、30秒)、抜歯時にRFA針先端と坐骨神経の間に軽度の癒着が観察されました。この癒着は接触部位における局所的なタンパク質の変性と凝固によって生じ、適切な熱エネルギーの供給と直接的な神経接触を示唆しています。癒着がない場合は、手技中の針のずれを示し、神経損傷が不安定または最適でない状態を引き起こすことがあります。

術後では、RFA群のマウスは7日目および14日目にMWTが術前ベースラインおよびSham群と比較して有意に増加しました(P < 0.001; 図5)。この一過性の機械的低痛感は、RFA手技後の臨床所見と一致する表浅感覚の低下を反映しています。術後21日目にはMWT値が低下し始め、28日目と35日目にはベースライン値に戻り、永久的な軸索変性ではなく可逆的な神経損傷を示しました。対照的に、7日目から14日目にMWTの上昇が認められなかったり、術中の癒着が見られな...

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ディスカッション

低侵襲手術の急速な発展に伴い、無線周波数技術はますます普及しています。臨床実践における無線周波数技術の普及に伴い、関連研究がその広範な普及を促進しました。しかし、無線周波数電流が組織に与える影響についてはさらなる研究が必要であり、特に神経障害性疼痛の治療に無線周波数技術が適用された後、多くの患者の生活の質がRFA後の感覚異常などの合併症によって影響を受けています。

本研究では、マウスの坐骨神経損傷を治療するために単極RFAシステムを用いました。単極RFAシステムの手術の重要なポイントは、動作要件を満たすためにインピーダンスを低減することです。したがって、負極金属板の接触面の皮膚準備や導電性媒体の選択など、術前準備が特に重要です。マウスの毛はわずかに疎水性であるため、皮膚の準備は約1cm×1cmの露出皮膚を露出させ、導電性の媒体がそ...

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開示事項

著者たちは競合する利害関係を一切認めていない。

謝辞

本研究は、宣武病院人材収束プログラム(HZ2025PYDTR009年)およびCapitalの健康改善研究基金(2011年CFH2024 2月2日)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4-0縫合金環医療C412皮膚を閉じて
6-0縫合金環医療KCR631筋肉層を閉じます
Alexa フルオナ488二次抗体インビトロジェンA-11008二次抗体
ATF3ウサギ多クローナル抗体ノバス・バイオロジカルズNBP1-85816ポリクローナル抗体
湾曲した細い鉗子ビヨタイム・バイオテクノロジーFS031筋肉と筋膜の切断
DAPIアンチフェードマウントメディアビヨタイム・バイオテクノロジーP0131アンチフェード媒体
ガラス分針玉燕インストゥルメンツBLFZ10勇気を上げて
GraphPad プリズムグラフパッド・ソフトウェア合同会社バージョン9.0出力データ画像
マイクロハサミビヨタイム・バイオテクノロジーFS217切開皮膚切開
修正リンガーの解自己準備該当なし乳酸ナトリウム 3.10 g/L;NaCl 6.00 g/L;KCl 0.30 g/L;CaCl2 middot;2H2O 0.20 g/L
ニードルホルダー玉燕インストゥルメンツY32010針をホールドする
QuickBlockのブロックソリューションビヨタイム・バイオテクノロジーP0260免疫蛍光のためのブロッキング試薬
高周波治療装置コスマン・メディカルRFG-1A高周波システム
高周波熱凝固電極トロカーコスマン・メディカルTCD-10絶縁されたRF針
乳酸ナトリウムリンガー注射四川省 クラン 製薬 .有限公司;Ltd;86902180001566レジストを低減するためのイオン性液体
SPSS統計IBMコーポレーションバージョン27.0統計解析ソフトウェア
直線的な細い鉗子ビヨタイム・バイオテクノロジーFS027筋肉と筋膜の切断
フォン・フレイファイバーワイヤーダミック・グローバルアエステジオ・セムス・ワインスタイン挙動テスト

参考文献

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