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方法論記事

マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるApi5誘導幹性を明らかに

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DOI：

10.3791/69999

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2026年2月24日

 , 
1Biology Department, Indian Institute of Science Education and Research

この記事について

サマリー

本プロトコルは、非腫瘍性乳腺上皮細胞におけるアポトーシス阻害剤5(Api5)によるがん幹性を研究するためのマンモスフィア形成アッセイの設定方法を説明しています。一次世代のマンスフィアから採取された溶離物を分析し、幹細胞様特性の誘導を評価するために異なる幹性マーカーを分析します。

要約

乳がんは世界的に女性の間で最も多く見られ、年齢標準化による発症率と死亡率が最も高いです。乳がんを標的とした治療法の進歩にもかかわらず、患者の20%が再発しており、これは治療抵抗性がん幹細胞(CSC)の集団に起因する可能性があります。これらのCSCは、静止期にとどまることで従来の治療に耐えるか、腫瘍塊の不完全な切除により持続し、後期に再発を引き起こすことがあります。そのため、最近の研究はこの耐性細胞集団の同定、単離、標的化に焦点を当てています。in vitroでは、マンモスフィア形成アッセイが、乳房上皮集団内で幹様細胞を濃集・増殖させるための堅牢な三次元懸濁培養システムとして機能します。ここでは、腫瘍性でない乳腺上皮細胞でアポトーシス阻害剤5(Api5)の過剰発現によって可能になるがん幹細胞様表現型を評価するために、マンモスフィアアッセイを用いるアプローチを提示します。このプロトコルは、マンモスフィアを連続的な通路を通じて伝播させ、マンスフィアの形成効率と自己更新能力を評価することを含みます。さらに、マンスフィアから採取したタンパク質溶解液は免疫ブロッティングによって確立された幹性マーカーの検出を行っています。このアッセイにより、Api5のような新しい調節因子が乳上皮細胞集団におけるがん幹細胞様特性の研究が可能になります。このアプローチは分子介入の比較研究やCSCを標的とした治療薬のスクリーニングに適応可能です。

概要

化学療法耐性乳がんの増加により、治療抵抗性と再発の根本原因であるがん幹細胞群を特定し標的にすることへの注目が高まっています。これらの細胞は分化を回避し静止状態を保つ能力が特徴であり、さまざまながん治療法に抵抗力を持つことを可能にします1,2。乳がん幹細胞の同定には、マンモスフィア形成アッセイ3,4,5、細胞表面マーカーに基づく細胞選別6,7、排出特性に基づく分離、in vivo腫瘍原性アッセイ7、Oct48、Nanog9、Sox2 10、Bmi11などの幹細胞核モジュレーターの評価など、いくつかの方法が用いられます.通常、がん幹細胞の同定と分離には、これらの手法の一つ以上を組み合わせて行われます。

アポトーシス阻害剤5(Api5)は抗アポトーシスタンパク質であり、乳がん12,13,14、子宮頸がん15,16,17、B細胞慢性リンパ系白血病18、非小細胞肺がん19など、複数のがんで上位調節されることが確認されています。子宮頸がん16およびトリプルネガティブ乳がん12では、Api5の高レベルが化学療法耐性と関連していることが示されています。治療抵抗性と再発がしばしばがん幹細胞によって引き起こされるという証拠が増えています20,21。Songらによる興味深い研究22では、子宮頸がん細胞におけるApi5の過剰発現がナノグレベルを上昇させ、がん幹細胞の活性化に寄与していることが明らかになりました。当研究室の過去の研究では、Api5の過剰発現がマトリゲル支持3D培養中の非腫瘍性乳腺上皮細胞の形質転換を引き起こすことが示されています。これらの転換細胞は極性の破壊、増殖の増加、アンカー非依存の成長、そして部分的な上皮から間葉への転移(EMT)様の表現型を示します。3次元培養におけるApi5の過剰発現による表現型変化は、球体を単層培養に解離した後も保持されました14。Api5は化学療法耐性の三陰性性乳がんで上型調節されていることから、Api5は乳腺上皮細胞におけるがん幹性の特性も調節している可能性があると推測します。

この文脈では、Api5の過剰発現によって形質転換された3次元解離した非腫瘍性乳腺上皮細胞からがん幹細胞を同定するためのマンモスフィア形成アッセイを記述し、その後幹細胞マーカーのウェスタンブロットを行ってこれらの細胞の同定を確認します。マンモスフィアアッセイは、非接着性かつ非分化条件下で乳房上皮細胞を培養し、幹様・前駆細胞をマンモスフィアと呼ばれる三次元構造で濃縮することを可能にします。幹状の性質を持たない乳房上皮細胞は通常、アノイキス(アノイキ)を起こします。しかし、幹様特性を持つ細胞はマンモスフィア4,5を生じさせます。この方法はもともとDontuらによって開発され、神経幹細胞および前身の同定に用いられる神経球アッセイに触発されています23。ここで述べるマンモスフィアアッセイは、ビタミンAおよび組換えヒト表皮成長因子(EGF)を含まない最小限の培地でB27を補足した際の幹細胞活性および自己更新能力の評価を可能にします。Api5過剰発現の3D解離細胞は、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(pHEMA)コーティングされたプレート上にまばらにシードされます。これにより細胞は非接着状態で増殖でき、その後の各マンモスフィアはクローン起源となります。マンモスフィアは7日目まで成長させ、その後マンスフィア形成効率が計算されます。真の幹細胞と、時間とともに増殖能力を失う非幹細胞を区別するために、後続のマンモスフィア形成が行われます。マンモスフィアの連続通過は、一次生成で集められた球体を解離し、単一細胞を再プレートして二次(およびその後の)マンモスフィアを形成することを含みます。これにより細胞が球状形成を繰り返し開始できるかどうかが判定され、細胞5の自己更新能力として定量化されます。

この方法は、腫瘍形成または形質転換された乳上皮細胞中の乳がん幹細胞を特定するために利用できます。この方法は患者サンプルから乳がん幹細胞を単離するためにも応用可能です。このシステムは、化学療法耐性に関連する可能性のある乳がん幹細胞に対する新たな標的を特定するのに役立ちます。

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プロトコル

1. 組織培養プレートにポリ(2-ヒドロキシエチルメサクリレート)、pHEMAをコーティングする

  1. 分子量300,000のpHEMA1.2gを95%エタノール100mLに65°Cで絶えずかき混ぜて1.2%のpHEMA溶液を準備します(材料 表参照)。
  2. 標準的な組織培養プレートにpHEMAを塗布し、6ウェルプレートのウェルごとに1mLを塗布します。pHEMA溶液の体積は、組織培養容器の大きさに応じて調整可能です。
  3. 皿は40°Cのオーブンで無菌状態で乾燥させます。
  4. プレートをUV光に15分間当て、その後Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で3回洗浄した後、マンモスフィア形成アッセイのセットアップを行います。

2. 一次世代のマンスフィアのシーディング

  1. 培養3D解離されたMCF10A細胞(対照およびApi5過剰発現)は、培養培地で16日目の3D培養を解離して得られました。14。
    注:培養培地の組成:高グルコースDMEM(ピルビン酸ナトリウムなし)、5%の馬用血清、10 μg/mLインスリン、0.5 μg/mLヒドロコルチゾン、20 ng/mL組換えヒト表皮成長因子(EGF)、100 ng/mLのコレラ毒素、および200単位/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを補足します( 材料表参照)。
  2. 使用済み培地を取り出し、細胞を1 mLのDPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAを500 μL加えて、37°Cの加湿5%CO2インキュベーターで12〜15分間インキュベートし、すべての細胞がトリプシン化されるまで培養します。
  3. すべての細胞が取り除かれた後、トリプシン活性を中和するために2mLの再懸濁培地を加え、112× g で室温で10分間細胞懸濁液を回転させます。
    注:再懸濁培地の組成:ピルビン酸ナトリウムなしの高グルコースDMEMに20%馬血清、および200単位/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを補足。
  4. 上清液を吸引し、細胞ペレットを1mLのマンモスフィア培地に再懸濁させます。セルサスペンションを25Gの針に通すと、シングルセルサスペンションが得られます。
    注:マンモスフィア培地の組成:DMEM/F12に20 ng/mL表皮成長因子(EGF)、ビタミンAなしの×B27サプリメント1個、およびペニシリン・ストレプトマイシン200単位/mL( 材料表参照)。
  5. ヘモサイトメーターを使い、細胞数を数え、1井戸あたり0.2個×10個4 細胞をシードするのに必要な細胞懸濁量を計算します。
    注意:マンモスフィア形成効率を正確に測定するために、低密度のシードを維持し、細胞凝集の影響を最小限に抑えましょう。免疫ブロッティングのためにタンパク質溶解液を採取する際、細胞密度は1ウェルあたり最大2.5個×10個5細胞まで増加させることができます。
  6. 必要な細胞懸濁液を2 mLのマンモスフィア培地で希釈し、6ウェルプレートの各ウェルにシードします。種子細胞は各条件ごとに三倍ずつ。
  7. 加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで7日間培養します。
  8. 培養7日後、各ウェルで直径50μmを超えるマンモスフィアの数を手動で数えます。これは、グラティクル付きの顕微鏡を使ったものか、光学顕微鏡下の象限グリッドを用いて行われます。
  9. 光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを20倍倍で撮影します。
  10. マンモスフィア形成効率(MFE)は次の式5で計算します。
     式1

3. 二次世代のマンスフィアの播種

  1. 第一世代で形成されたマンモスフィアを15mLのチューブと遠心分離機で300×gで室温で10分間採取します。
  2. 上清液を吸引し、マンモスフィアのペレットは残します。
  3. ペレットはDPBSで洗ってください。
  4. マンモスフィアペレットに0.05%トリプシンEDTAを200 μL加え、37°Cの加湿5%CO2インキュベーターで2〜3分間培養します。トリプシン溶液中のマンモスフィアを25Gの針に3回通し、単細胞懸濁液を得る。
  5. トリプシン活性を中和するために0.5mLの懸濁培地を加え、112× g で室温で10分間細胞懸濁液を回転させます。
  6. 上清液を吸引し、細胞ペレットを0.5 mLのマンモスフィア培地に再懸浮させます。
  7. ヘモサイトメーターを使い、細胞数を数え、1ウェルあたり0.2 ×10個4 細胞をシードするのに必要な細胞懸浮体積を計算します。
    注意:自己更新能力を評価するために細胞密度を低く保ち、細胞凝集の影響を最小限に抑えましょう。
  8. 必要な細胞懸濁液を2 mLのマンモスフィア培地で希釈し、6ウェルプレートの各ウェルにシードします。種子細胞は各条件ごとに三倍ずつ。
  9. 加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで7日間培養します。
  10. 培養7日後、グラティクル付きの顕微鏡または四分円グリッドを用いて、各プレートに直径50μmを超えるマンモスフィアの数を数えます。
  11. 光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを20倍倍で撮影します。
  12. 自己更新能力は次の式5で計算します。
    式2

4. Api5過剰発現時の多能性マーカーの変化を検出するためのウェスタンブロット法

  1. 第一世代で形成されたマンモスフィアを15mLチューブに収め、室温で300× g の遠心分離機で10分間処理します。
  2. 上清液を吸引し、マンモスフィアのペレットは残します。
  3. ペレットはDPBSで洗ってください。
  4. ペレットを氷冷のRIPAバッファーで採取し、タンパク質溶解液を得て標準プロトコル24に従って免疫ブロッティングを行います。
    注:RIPAバッファーの組成:50 mM トリスHCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、1% トリトンX-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)、1 mM フェニルメチスルホニルフッ化物(PMSF)、10 mM フッ化ナトリウム、1 mM オルトバナデートナトリウム。
  5. 茎の兆候(Oct3/4、Nanog、Sox2、Bmi1)のプローブと、負荷制御のGAPDH(抗体希釈については 材料表 を参照)を検出します。
  6. ImageJの密度測定解析を用いてタンパク質レベルを定量化します。ウェスタンブロット画像で関心のある領域を選択し、各レーンの密度プロファイルを作成します。
  7. 各レーンごとに、関心のあるタンパク質のGAPDH密度との相対的な密度を正規化します。各タンパク質の折りたたみ変化を計算します。
  8. どんなプロットソフトを使っても、たみの変化をプロットしてください。

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結果

非接着条件下でのマンモスフィア形成効率を評価するため、プロトコルに従い、対照細胞およびApi5過剰発現した3D解離MCF10A細胞をポリHEMAコーティングプレートにシードしました。Api5過剰発現細胞は対照群に比べて平均乳球形成効率が1.58倍向上を示しました(図1B,C)。この増加は、Api5の発現が高いほど、非接着性で血清欠乏状態で存続・増殖する幹細胞様前身の割合が増加し、クローン由来の球体が形成されることを示しています。

一次マンモスフィアは集められ、解離され、再播種されて第二世代のマンモスフィアが形成されました。Api5過剰発現細胞は対照細胞の平均自己更新能力をほぼ2.5倍に示しました(図1D,E)。この結果は、Api5の過剰発現が自己更新する幹細胞様細胞のプールを増加させ、これらの細胞の連続回通における維持を支えることを示唆しています。

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ディスカッション

確立されたがん細胞株や腫瘍由来細胞の単層培養は、がん表現型を調節するさまざまな分子経路についての洞察を提供しますが、がん幹細胞に焦点を当てた研究は二次元培養では行えません。がん幹細胞は現在の治療法の再発の主な要因と考えられているため、これらの細胞を研究するための堅牢なアッセイを確立する必要があります。がん幹細胞活性を研究する最も信頼性の高いアッセイはマウスのin vivo移植アッセイですが、より効率的かつコスト効率の高いin vitroアッセイの必要性があります。マンモスフィア培養は、がん幹細胞集団を研究するための洗練されコスト効率の高い代替手段を提供します。

マンモスフィアの一次生成から評価されるマンモスフィア形成効率は、初期幹細胞活動の指標です。幹細胞の自己更新を評価するには、マンスフィアの連続通過が不可欠で...

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開示事項

著者たちは潜在的な利益相反を一切認めていない。

謝辞

この研究はSERB-POWER(SPG/2021/002661-G)からの助成金と、一部はIISERプネーコア資金によって支援されました。S.B.はUGC-SRFフェローシップによって資金提供されました。MCF10A細胞を寛大に提供してくださったScripps Research InstituteのRaymond C. Stevens教授と、原稿への貴重な助言をいただいたAbhijith K博士(Ahammune Biosciences Pvt. Ltd.)に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen25300062
37 °C humidified incubatorNew BrunswickGalaxy 170 R
Anti-Bmi1 Rabbit pAbABclonalA134721:1000 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-GAPDH antibodySigmaG9545-200UL1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature
Anti-Nanog Rabbit mAbABclonalA226251:5000 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)Santa Cruzsc-52791:300 dilution, overnight incubation at 4 °C
Anti-Sox2 Antibody (E-4)Santa Cruzsc-3658231:300 dilution, overnight incubation at 4 °C
B-27 Supplement (50x), minus vitamin AInvitrogen12587010
CentrifugeBeckman CoulterAllegra X-15R
Cholera toxin Sigma C8052-1MG 1 mg/mL stock in dH2O
DMEM/F12Thermo11330032
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)Invitrogen14190-144
Epidermal growth factor (EGF) Sigma E9644-0.2MG 100 mg/mL stock in dH2O
Ethanol absolute 99.9%Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany58051 L05
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)SRL43272
High glucose DMEM without sodium pyruvateInvitrogen11965126
Horse Serum  Invitrogen16050122
Hydrochloric acid (HCl)QualigensQ29145Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)
Hydrocortisone Sigma  H08881 mg/mL stock in ethanol
ImageJ Image processing software
ImageQuant LAS 4000 Cytiva
Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrateMerckWBKLS0500
Insulin Sigma I1882 10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid
Nikon Eclipse TS-100 microscopeNikonBM-1919
MCF10A cellsGift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E
Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)Sigma78830-5G
Plotting software GraphPad Prism 10
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)Santacruzsc-2532841.2% pHEMA in 95% ethanol
Sodium chloride (NaCl)SRL41721
Sodium deoxycholateAmresco0613-100G
Sodium dodecyl sulphate (SDS)SRL54468
Sodium fluoride (NaF)HiMediaRM1081-500G
Sodium orthovanadateSigma-AldrichS6508-10G
Tris bufferSRL71033
Triton X-100SigmaT8787-250ML

参考文献

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