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方法論記事

ストロンチウム90 β線に基づく放射線誘発皮膚損傷動物モデルの開発と応用

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DOI:

10.3791/70010

2026年1月27日

この記事について

サマリー

ここでは、ストロンチウム90(90Sr)β放射線を用いた放射線誘発性皮膚損傷の再現可能な動物モデルを確立するプロトコルを提示します。このプロトコルは、表層放射線損傷における線量効果や炎症反応の調査を可能にし、今後の機構研究の基盤を提供します。

要約

放射線誘発性皮膚損傷は、原子力事故の緊急事態や放射線関連の職業で頻繁に遭遇する重篤な合併症であり、メカニズム研究のために標準化された特異性に焦点を当てた損傷モデルの確立が必要です。従来のガンマ線や高エネルギーX線は強い貫通力を持ち、皮膚損傷を誘発しますが、必然的に複雑な深部組織反応を引き起こし、表層皮膚の影響の調査を妨げます。核降下物などのシナリオでβ放射線による顕著な表層組織損傷のリスクを考慮し、この課題に対処するために、放射線誘発皮膚損傷のストロンチウム90(90Sr)β線源ベースの動物モデルを開発しました。このモデルは、主に表層組織にエネルギーを蓄積するβ線の物理的特性を活用し、放射線物質が皮膚に接触することで生じる局所的な生物学的影響を正確にシミュレーションしつつ、深部浸透放射線によって引き起こされる全身的反応を回避できます。本研究は、 90Sr放射線源のパラメータ化、動物の照射プロトコル、病理標本の収集および評価方法を含む全体のワークフローを体系的に概説します。このモデルは、放射線誘発性皮膚損傷の病態生理学的メカニズムを解明し、メカニズム的研究や治療戦略の開発を促進する信頼性の高い動物ツールを提供します。

概要

電離放射線は、エネルギー、医療、産業、農業など複数の分野で広く使用されています。大きな利益をもたらす一方で、特に職業労働者やがん患者にとっては、人間の健康に直接的かつ潜在的な脅威をもたらすとも言えます 1,2。皮膚は体の最大の臓器であり、その外側の覆いを形成するため、電離放射線に曝露された際には必然的に主な標的となります。皮膚は表皮、真皮、皮下組織から成り、不可欠な生理機能を果たしています。しかし、放射線誘発性皮膚損傷のメカニズムや、その予防および治療に向けた効果的な戦略はまだ十分に解明されていません。したがって、放射線誘発性皮膚損傷を標的とした標準化され再現可能な実験モデルが急に求められており、機序的かつ介入的研究に適しています。そのため、この分野の研究を進めるために、放射線による皮膚損傷の新しい動物モデルを確立することに成功しました。

従来の研究では、X線やγ線などの高エネルギー放射線が皮膚損傷を誘発するために一般的に用いられます。モデル3,4。これらの放射線は高い貫通力を持ち、皮下組織や深部の組織や臓器と容易に相互作用できます。その結果、皮膚損傷を誘発する一方で、深部組織での広範な反応を引き起こし、皮膚に焦点を当てた研究におけるモデルの特異性を損なうとともに、結果の解釈を著しく複雑にします。この組織特異性の欠如は、皮膚制限放射線損傷を研究する主な研究目的が全身放射線の影響ではなく、皮膚制限による放射線損傷の調査において大きな制約となります。

これに対し、ストロンチウム90(90Sr)β線の特性、すなわち低エネルギーと限られた組織浸透力を活用した、より特異かつ洗練された皮膚損傷モデルを開発しました。研究によれば、β線による損傷は主に皮膚の表皮および真皮層に限られており、深部組織の反応による干渉を効果的に最小限に抑えています。高貫通放射線モデルと比較して、このアプローチは損傷の正確な位置特定、内臓の関与の減少、皮膚特異的な病理学的および炎症変化の解釈性向上を可能にします。さらに、β線を用いて放射性皮膚炎モデルを構築することも、現実世界の潜在的な脅威という重要な考慮点から正当化されます。チェルノブイリ原発事故からの教訓は、高線量のβ粒子への外部曝露が重度のβやけど、さらには致命的な怪我を引き起こす可能性があることを示しています。さらに、放射線汚染物質によるβ放射線による長期的な健康リスクも存在します 8,9

これらのメカニズムを探るには、β線照射を受ける適切な動物を選ぶことも重要です。ミニピッグはβ線誘発皮膚損傷モデルの確立に成功していますがマウスに比べて研究への一般的な適用性は限定的です。さらに、マウスの皮膚の重要な特徴の一つは毛包密度が高いことであり、放射線による皮膚損傷の研究における放射線の影響を探るのに適したモデルとなっています。したがって、マウスモデルを使うことには顕著な利点があります。さらに、マウスモデルは低コスト、高いスループット、遺伝的操作性、分子および免疫解析との幅広い適合性といった実用的な利点を持ち、機構的研究や介入スクリーニングに特に適しています。

炎症性サイトカインは、免疫細胞および非免疫細胞の両方が分泌する生物学的に活性の高い小分子またはタンパク質で、広くは炎症促進または抗炎症作用に分類されます。電離放射線による皮膚損傷において、これらのサイトカインが主要な要因となります。実際、このような損傷は根本的に制御不能な炎症性疾患であり、主にサイトカインとケモカインのネットワークによって仕組まれています12。IL-6は主要な炎症促進メディエーターであり、放射線および感染に対する急性炎症反応に関与する重要なサイトカインの一つです(13,14,15)。最近の研究では、放射線がIL-6/STAT3シグナル伝達経路と細胞老化を促進し、免疫細胞浸潤を促進し、放射線皮膚炎、皮膚炎症、脱毛に寄与することが示されています16。興味深いことに、特定の文脈下でも放射線防護効果を示します(17,18)。対照的に、IL-10は重要な抗炎症調節因子です。その機能は過剰な炎症反応の抑制、自然免疫の強化、組織修復機構の促進、感染および炎症中の組織恒常性維持などです。IL-10はしばしばIL-6と共に作用し、皮膚創傷の治癒促進、瘢痕形成の減少、特定の皮膚疾患の改善に有益な効果を示します(21,22,23)。既存の研究ではIL-6とIL-10がそれぞれ放射線と紫外線曝露に反応することが示されていますが、β放射線に対する反応はまだ明確ではありません。

まとめると、本研究は 90Sr β放射線による放射線誘発皮膚損傷の安定かつ再現可能なマウスモデルを確立することを目的としています。このモデルは、皮膚放射線損傷、β放射線曝露シナリオ、炎症調節、皮膚付属肢損傷、長期的な組織再形成に焦点を当てた研究に特に適しています。しかし、通常はX線やγ線などの高透過放射線を必要とする深部組織や固形腫瘍放射線治療を再現することを目的としていません。私たちは、モデル確立の手順を提示し、放射線損傷スコア、組織学的検査、主要なサイトカイン(IL-6およびIL-10)の分子発現を含む多段階評価を通じて、その実現可能性を体系的に検証します。これらのパラメータの動的解析は、損傷過程におけるIL-6およびIL-10の調節役割を明確にし、将来の的外的介入戦略開発における確固たる実験的基盤と理論的参照を提供します。

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プロトコル

動物を対象としたすべての実験手順は、中国成都の華西基礎医学・法医学院動物実験倫理委員会によって審査・承認されました。

1. 動物の調理

  1. 動物の収容とグループ分け
    1. SPFグレードの雌C57BL/6Jマウス12匹(体重範囲:18〜25g、年齢:3か月)を4つの標準換気ケージに割り当て、ランダムに4つのグループ(n=3)に分けて、外部照射の異なる線量(非照射対照群と3つの実験照射群)に割り当てます。
    2. すべての動物は12時間の明暗サイクルで管理し、標準的な齧歯類の餌や水は自由に利用してください。
    3. 番号付きの耳タグを使って、各マウスを一意に識別し、実験グループを区別します。
    4. 実験動物が新しい環境に3日間慣れるまで、次の処置に備えてください。
    5. 同じ条件下で1匹のスプラグ・ドーリー(SD)ラット(年齢:2ヶ月、体重:約160g)を置きます。
  2. 麻酔
    1. マウスは1.25%トリブロモエタノール溶液の腹腔内注射で麻酔します。安全な麻酔を確保するために、体重に基づいて15〜20 mL/kgを投与し、定められた基準に従って注射量を計算してください。
  3. 照射現場の準備
    1. 麻酔後、電動クリッパーを使って意図した背側照射部位の毛を除去します。
    2. 赤いマーカーペンと、あらかじめ用意された直径約3cmの硬質型を使い、剃られた背側皮膚に照射用の円形の領域をマークします。
      注意:除毛クリームは皮膚の刺激を引き起こし、組織学的構造を変化させる可能性があり、実験結果を混乱させる可能性があるため使用しません。

2. 照射のための線量計算

注:90Srは崩壊中に高エネルギー β線を放出します(図1A)。β線は貫通性能が悪く、通常は表皮にのみ影響を及ぼします。マウスの照射時間を正確に測定するには、吸収線量率(D, cGy/s)の計算が必要です。

  1. 物理的な半減期(T1/2)から減衰定数(λ)を次の式で計算します。
    T1/2 ≈ 0.693/λ
    90 Srの半減期は約28.6年、λ ≈ 0.02423年-1であることを考えると、
  2. 放射性核種の数(N)は以下の式で計算します。
    A = λ N
    どこ:
    A: 放射能(mCi)
    N:時間t(年)後の放射性核種数
    初期放射能 A 0 = 30 mCi(1 Ci = 3.7x1010 Bq)、λ ≈ 0.02423 の場合、
    N0 = A0/λ = 1238.13454
    次に、一般的な放射線崩壊法則を適用します。すなわち、放射性核種の数は時間とともに指数関数的に減少します。
    dN/dt = -λ N
    積分の結果:
    N = N0 е-λt
    どこ:
    N0: t = 0 時の初期放射性核種数
    N:時間t後に残る放射性核種の数
  3. 最後に、以下の式を用いて吸収された線量率 DをcGy/s単位で計算します。
    90 Sr-90Yアプリケーターの吸収用量率の換算式:
    D = [(A×1770/S) ×(E90Y/E32P) ×Fm] /3600 = (A/S) ×0.6347
    どこ
    D:吸収用量率(cGy/s)
    A: ミリキュリー(mCi)
    S:面積(cm2)
    1770年: 32Pのイオン化定数
    E90Y: 平均エネルギー = 0.93 MeV
    E32P: 平均エネルギー = 0.693 MeV
    fm:曝露量換算係数(0.962)
    3600:時間から秒への換算係数
    注: 90のSrパラメータの計算は 表1にまとめられています。以下に計算例を示します:
    2023年3月3日:
    アプリケーター外径=3cm、内径=2.47cm、半径=1.235cm、放射能 A =30mCi
    S = π ×1.2352
    D=(A/S) ×0.6347 ≈ 3.9738 cGy/s
    2023年11月3日(t = 0.583年後):
    N(t) = N0 е-λt = 1238.13454×e-0.02423×0.583 ≈ 1220.7675
    A(t) = λN(t) = 0.02423×1220.7675 ≈ 29.579 mCi
    D = (A/S) ×0.6347 ≈ 3.918 cGy/s
    t = 2.25年後:
    N = N0 е-λt ≈ 1238.13454×e-0.02423×2.25 ≈ 1172.4391
    A = λN ≈ 0.02423×1172.4391 ≈ 28.408 mCi
    D = (A/S) ×0.6347 ≈ 3.7629 cGy/s
  4. 得られたデータに基づいて各投与群の照射時間を計算します( 表2参照)。

3. 照射

注: 90Srによるβ線は浸透が限られており、通常表皮層にのみ影響を及ぼします(図1D)が、それでも人間の健康に潜在的なリスクをもたらします。 90Sr源を含むすべての手続きは、オペレーターおよび環境への放射線被曝を最小限に抑えるために適切な保護措置を遵守することを確実にしてください。オペレーターは放射線源の取り扱いに関する専門的な訓練を修了しなければなりません。放射線源の取り扱いおよび使用手順は、2007年の国際放射線防護委員会勧告(ICRP出版物103)に記載された国際基準に厳格に従っていました。

  1. 使用前準備: 90Srのソース使用申請を提出してください。監督者の承認を得た後、実験室の鍵と警報システムの解除コードを回収します。
  2. 必要な材料はすべて用意してください。マウスには背側の毛を剃り、マーキングしたもの、1mLの注射器、トリブロモエタノール溶液、食品用プラスチックラップ、タイマー、テープ、フォームボードも用意してください。
  3. マウス前処理
    1. トリブロモエタノール溶液の腹腔内注射でマウスを麻酔します(ステップ1.2参照)。
    2. 完全に鎮静したら、マウスの背面を硬い板の上に置き、背面をラップで覆い、テープで包帯を固定します。
  4. 照射手順
    1. 放射線源室に入り、警報システムを解除し、防護服(防護服、キャップ、ゴーグル、個人用線量計)を着用し、リードシールドから 90Srの発生源を取り出します。
    2. ソースの上部ノブに金属棒を取り付けてアプリケーターを持ち上げて動かします。
    3. 核事故や職業被曝に関連するβ放射線による皮膚損傷を模擬するために、90Srアプリケーターの放射面(図1B)を麻酔マウスの標識が削られた背面に位置付けます(図1C)。設置したらすぐにタイマーを始めてください。設定された時間が経った正確な時間が過ぎたら、アプリケーターを引っ込めて一時的に元の容器に保管します。
      注意:塗布機の下部をスタッフの方に向けてはいけません。
    4. 使用後は 90Srの電源をリードシールドに戻してください。
      注意:10 Gy ×5 群は、5日間連続で1日1回照射し、合計50 Gyの照射量を達成してください。
  5. 照射後のステップ
    1. 放射線源検査記録放射線源使用記録を記入し、警報システムを再起動し、ドアを施錠し、鍵を返却し、発生源の状態を報告してください。
    2. 手順中に発生したすべての放射性廃棄物を回収し、機関のガイドラインに従って処分してください。

4. 放射線損傷スコア

  1. マウスの皮膚損傷の進行状況を、初期段階で2〜3日ごとに照射部位を調べます。異常な皮膚の見た目が確認された場合は、検査頻度を1日に増やしてください。病変の進行が安定したら、評価間隔を2〜3日ごとに戻します。
    注:全過程を通じて、照射されていない対照群は照射を受けたグループと同様の手順を経て、その後の採点や組織採取が行われました。対照群のサンプリングは、照射群の皮膚損傷の進行段階と一致する予定です。
  2. 放射線照射された皮膚部分を定期的に撮影し、マウスの背中の放射線誘発性皮膚炎の状態を評価してください。
  3. 検証済みスケール( 表3参照)を用いて照射フィールド内の皮膚反応をスコア化します。
    注:損傷の評価を行う際は、放射線量を知らずに3人の調査員が独立してブラインド評価を行うべきです。主要な創傷の特徴に基づいて、確立された基準に基づいてスコアリングを行います。合意によって最終スコアを割り当て、スコアリングシステムのすべての記述に完全に一致しない傷もあるが、本質的な病理を反映していることを認めて。

5. サンプリングと染色

  1. 皮膚組織の採取:照射後13日目、19日目、27日目、32日目に、各治療群のマウスから事前にマークされた円形照射フィールド内で連続した全身皮膚生検を採取します。
    1. ステップ1.2に従い、トリブロモエタノール溶液(15–20 mL/kg)を腹腔内注射してマウスを麻酔します。
    2. 手術部位を75%アルコールで消毒してください。その後、無菌の細かい鉗子を使って対象の皮膚を安定させます。
    3. 損傷組織間の遷移帯に沿って外科用ハサミを使って縦方向に約0.5 cm²の全層皮膚サンプルを切除し、中央の損傷部位を確実に含みます。ハサミを皮膚表面に垂直に持って、切開部を皮下筋膜層まで伸ばします。
    4. 採取した組織をすぐに4%のパラホルマルデヒドに浸して固定します。
    5. 止血のために傷口に優しく圧迫してください。各サンプリングセッションでは、照射場の中心に向かって4方向のいずれかに移動する戦略を踏みます。
  2. 組織学的および免疫蛍光染色
    注:H&Eおよび免疫蛍光染色は、商業サービス提供者(Servicebio Biotechnology、中国武漢)の協力を得て、標準最適化プロトコルに従って実施されました。
    1. 照射後13日目、19日目、27日目、32日目に採取した皮膚サンプルに対して、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色を行います。
      1. まず、固定組織サンプルをパラフィンに埋め込み、組織切片を作成します。
      2. 脱ワックスと水和を行い、セクションを順に環境に優しい脱ワックス透明液体I(20分)、環境に優しい脱ワックス透明液体II(20分)、無水エタノールI(5分)、無水エタノールII(5分)、75%エタノール(5分)に浸し、その後水道水ですすいでください。
      3. すべてのセクションにHDの定着前処理液を1分間処理してください。その後、ヘマトキシリン溶液で3〜5分間染色し、その後水道水で洗い流します。
      4. 次に、切片をヘマトキシリン分化液に浸し、再び水道水で洗い流します。その後、ヘマトキシリンブルーイング液で処理し、再度すすぎます。
      5. その後、セクションを95%エタノールに1分間浸し、エオシン染料で15秒のカウンターステインを施します。
      6. 次に、絶対エタノール(3回交換、各2分)、通常のブタノール(2回交換、各2分)、キシレン(2回交換、各2分)で断片を脱水し、最後に中性ガムで密封します。
    2. 炎症性サイトカインIL-6およびIL-10を可視化するために免疫蛍光染色を行います。
      注:損傷の全体的な進行状況に基づき、13日目に病変が現れ始めた組織と、損傷の進行が安定し回復の兆候が見られる27日目に取得した組織を選定し、炎症性サイトカインIL-6およびIL-10を可視化するために免疫蛍光染色を行いました。
      1. キシレン(3回交換、各10分)とグレードエタノール(純エタノール3回、各5分)で脱硫・再水和し、蒸留水で洗い流します。
      2. 抗原回収のために、スライドを1×クエン酸抗原修復液(pH6.0)で70°Cで20分間加熱します。スライドを自然に冷まし、その後脱色シェーカーでPBS(pH7.4)で洗い(3回、各5分)洗います。
      3. 次に、室温で30分間非特異的な結合を遮断するために3%のBSAを塗布します。
      4. 抗IL-6(1:3000)と抗IL-10(1:2000)を含む混合一次抗体溶液を準備・適用し、4°Cの加湿チャンバーで切片を一晩培養します。
      5. 翌日、スライドをPBSで洗い(3回、各5分)、適切な二次抗体と共に室温で暗闇で50分間培養します。
      6. PBSで3回、各5分洗った後、暗闇で10分間DAPIで核をカウンターステインします。その後、PBSで再度洗い(3回、各5分)、自己蛍光消光剤で5分間処理し、流水で10分間すすいでいます。
      7. 最後に、カバースリップをフェード防止メディウムで取り付けます。
  3. 定量的分析
    1. Image Jのソフトウェアを使って、H&E染色切片から表皮の厚さを定量化してください。
      1. 画像Jの画像スケールを、直線ツールでスケールバーをなぞり、「 Analyze > Set Scale」で既知の長さを設定してキャリブレーションします。
      2. 次に、 ROIマネージャー>「>ツールの分析 」に移動し、関心のある領域を選択してROIマネージャーに追加してください。
      3. 最後に、ROIマネージャー「測定」をクリックして実際の期間を確認できます。
    2. Image Jソフトウェアを使ってIL-6およびIL-10の平均免疫蛍光強度を測定します。
      1. 画像と分割チャンネルを画像 >カラー>分割チャンネルでインポートしてください。次に、ターゲット蛍光に対応するチャネルを選択します(例:IL-6は赤、IL-10は緑)。
      2. 画像>で自動閾値を適用し >自動閾値を調整>すべて試すしきい値ウィンドウで最適なアルゴリズムを選択し、スライダーを手動で実際の蛍光に合わせます。
      3. 分析」>「測定値をセット 」で、 平均グレー値 を確認し、 閾値への制限を有効にして測定値を設定します。
      4. 最後に、強度データを取得するために「 分析>測定 」を実行してください。

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結果

身体検査の所見
マウスは 90Srの放射線源から3種類の用量(0 Gy、25 Gy、10 Gy×5、50 Gy)でβ放射線を被曝しました。同時に現地での評価が行われ、皮膚損傷の進行が安定するまで記録されました。実験結果は、 90Sr β放射線がすべてのグループで放射線誘発性皮膚損傷を引き起こし、損傷の程度は放射線線量に依存していることを示しました。用量や分割に関わらず、12日目から14日目の間に目に見える病変が現れ、その後急速に進行しました。初期の特徴は脱毛と脱毛を表します。被害は20日目頃にすべての被曝グループで最悪の程度に達しました。皮膚損傷スコアリングでは、50 Gyの単一線量放射線群は、25 Gyの単一線量および10 Gy×5放射線群と比べて有意により重篤な損傷を受けていることが明らかになりました(P < 0.05、 図2A)。

背側皮膚の最大創傷直径のモニタリングでは、50 Gy放射線群の単一線量が最も損傷...

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ディスカッション

放射線皮膚損傷の動物モデルを構築する際には、長寿命放射性核種90Srをβ放射線源として利用しました。放射線量率と照射時間の正確な計算は、このモデルの成功した開発において重要な一歩でした。腫瘍治療における90Srの臨床応用は記録されており、その信頼性は部分的に検証されています27,28。他のβ線放射性核種(例:32Pや204Tl)が潜在的な放射線源として利用される一方で、90Srは長い半減期から安定した放射線出力を理由に選ばれました。X線やγ線のより深い浸透と比べて、β線は表層の皮膚層をより正確に標的とします。その物理的特性から、原子力事故や職業被曝で遭遇するβ放射線損傷のシミュレーションに特に適しています。豚のモデルは人間の皮膚解剖学により近いものの、その高コストと長い実験期間が大きな制約を生んでいます。対照的に、マウスモデルは高スループット研究...

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開示事項

著者らは、本論文で報告された研究に影響を与えた可能性のある競合する財政的利害関係や個人的な関係は既知のものではないと述べています。

謝辞

この研究は中国国家自然科学基金(U25A20151、82473574、82203973)、西藏省重点イノベーションプロジェクト(XZ202501ZY0131)、および天府金城研究所の変革基金(2025ZH006)の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アンチIL-6ウサギpAbサービスバイオGB11117免疫蛍光染色
抗IL-10ウサギpABサービスバイオGB11108免疫蛍光染色
クエン酸抗原修復液(PH6.0)サービスバイオG1202免疫蛍光染色
脱水機ダイアパスドナテッロH&Eおよび免疫蛍光検査 染色
デジタル カメラ正史EOS 70D実験中の皮膚損傷の進行を記録する
使い捨て滅菌注射器使い捨て滅菌医療機器の専門製造者。GB20163140107腹腔内注射の場合
使い捨てラテックス手袋メディコム1186保護
環境に優しい脱ワックス透明液サービスバイオG1128-1LH&Eおよび免疫蛍光検査 染色
凍結プラットフォーム武漢君傑電子有限公司JB-L5H&E 染色
ヘマトキシリン・エオシン(H&)E) HDコンスタントダイキットサービスバイオG1076H&E 染色
画像J国立研究所画像処理組織学的染色データの正確な定量化を可能にする
リードエプロン山東省奥雷新放射線防護工程有限公司該当なし放射線被曝から人員を守る
リキッドブロッカーPAPペンサービスバイオG6100免疫蛍光染色
医療映画3歳10163337409520生物表面による放射線源の汚染を防ぐこと
ニュートラルガムSCRC10004160H&E 染色
核およびnbsp;放射線 検出器FNIRSI100128262296オペレーター周囲の周囲の放射線レベルをリアルタイムで監視し、人員の安全を確保します
パラホルムアルデヒド固定剤(4%)バイオシャープBL539A皮膚組織サンプルの固定
病理スライサー上海ライカインストゥルメント株式会社RM2016H&Eおよび免疫蛍光検査 染色
パラフィン埋め込み機武漢軍傑電子JB-P5H&Eおよび免疫蛍光検査 染色
ストロンチウム-90クロピンラジウム研究所株式会社(ラジウム研究所株式会社、ロシア)該当なしβ線を提供
トリブロモエタノール南京愛北バイオテクノロジー有限公司M2910マウスに麻酔を与える
水浴スライドドライヤー浙江金華台 器材KD-PH&Eおよび免疫蛍光検査 染色

参考文献

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