細胞分離システムおよびドロップレットデジタルPCRを用いた循環希少細胞における表皮成長因子受容体DNA変異のプロファイリング

サマリー

ここでは、全血を含む人工サンプルから希少ながん細胞を分離する方法を示すプロトコルを示します。これは肺がん細胞にスパイクされたものです。このプロトコルは、半自動化されたラベルフリーセル分離プラットフォームを利用しています。その後、増殖細胞は表皮成長因子受容体の変異を検出するために、ドロップレットデジタルPCRを用いて解析されます。

要約

表皮成長因子遺伝子(EGFR)内に見られる変異は、肺がん患者に対する最も効果的な治療法を決定する上で極めて重要です。EGFR変異の定期的な検査は、腫瘍生検や肺がん患者の血漿からのctDNA解析の形をとることがあります。肺がん患者の血液サンプル検査は、ctDNA検出やCTC検出を通じて肺がんの有無や再発の洞察を得るために日常的に行われますが、通常は捕獲された細胞の分子分析を伴いません。希少な循環腫瘍細胞(CTC)に存在するEGFR遺伝子の個別変異の検出は、標的治療の潜在的な有効性、さらには特に非小細胞肺がん(NSCLC)における患者の予後に関するさらなる洞察を提供します。残念ながら、このような循環する腫瘍細胞の稀さと、そのゲノム情報を解析するための効率的な手順の欠如は、検出に大きな課題をもたらしています。

このプロトコルの目的は、全血からCTCを捕捉し、ddPCRを用いてその分子成分を評価する現実的な可能性を示すことです。半自動のサイズベースの細胞分離プラットフォームを用いて循環中の腫瘍細胞を捕捉し、その後回収して下流の分子解析に用いられました。捕獲細胞のゲノムDNA内に特異的なEGFR変異の存在を調べるために、DDPCRはEGFR pT790MおよびEGFR pL858Rのアッセイを用いて実施しました。

2つの別々の肺がん細胞株(A549およびH1975)を全血から積極的に濃縮し、細胞株H1975内に存在する変異の正確な定量をddPCRを用いて実施しました。

概要

液体生検の価値に関するトランスレーショナル研究が継続し、治療選択¹におけるctDNAモニタリングの臨床的価値を具体的に示した最近の論文により、液体生検は成熟しつつあります。液体生検は、従来の組織生検法と比べて、がんのモニタリングと予後に関する代替的で侵襲の少ない方法を提供します。血液中に見られる断片化されたDNA(細胞遊離DNA、cfDNA)、特に腫瘍由来のサブ区画である循環腫瘍DNA(ctDNA)に焦点を当てた広範な研究が行われてきました。ctDNAは過去20年間にわたり広く研究されており、腫瘍特異的な遺伝子変異(例:SNVや構造変異)、メチル化マーカー、非腫瘍cfDNAと比較して独自の断片パターンを含むことが示されています。これらの特定のctDNA特性は、がん患者の分子状態を早期発見、治療反応、最小残存病(MRD)、治療抵抗性のモニタリングに利用されています。同様に、原発腫瘍部位から血管に分離した循環腫瘍細胞(CTC)は、血液中の存在と量が疾患の進行や再発の可能性と密接な相関を示す有望なバイオマーカーとして最近進化しています。CTCの初期研究は主にタンパク質マーカーの発現と列挙に依存し^{ていましたが、}乳がんにおけるエストロゲン受容体1(ESR1)のゲノム変異検出や、さまざまながんにおける表皮成長因子遺伝子(EGFR)など、分子レベルでのCTCの研究においても有意な進展が見られています。

EGFR変異は、病因の決定や予後の決定だけでなく、肺がん患者に対する最も効果的な治療法の決定にも重要です³。EGFR変異の定期検査は、診断や進行時の固形腫瘍生検、または最近では再発・難治性^{肺がん患者の}血漿からのctDNAサンプリングなどが挙げられます。しかし、ctDNAベースのアプローチとは異なり、CTC由来のゲノム解析により、未保存の腫瘍細胞とその変異プロファイルを直接評価することが可能になります。ctDNAのMRD研究に加え、希少なCTCのEGFR遺伝子内の変異検出は、治療レジメンの潜在的な有効性、さらには特に非小細胞肺がん(NSCLC)における患者の予後に関するさらなる理解を提供します。CTCの希少性と、クリニックで使いやすい機器を活用した効率的なプロトコルの欠如は、広範な普及の深刻な障害となっています。この制約は、効率的なCTC分離と下流の分子分析の両方を可能にする標準化されアクセスしやすいワークフローの必要性を浮き彫りにしています。したがって、本研究の目的は、循環腫瘍細胞の濃縮とEGFR変異の検出を、細胞分離とデジタルPCR手法を組み合わせた手法で再現可能なワークフローを提示することです。

ジェネシス細胞分離システムはマイクロ流体細胞捕獲スライドを備え、CTCを半自動化プロセスで高生存性と高効率で捕獲できます。これは、一次白血球および赤血球集団に比べてより大きなサイズと変形性が低いことに基づいています^5,6。捕獲されたCTCは、スライドからの逆流によってマイクロ流体細胞キャプチャスライドから回収され、さらなる下流ゲノム解析に用いられます。捕獲細胞のゲノムDNA内に特異的なEGFR変異の存在を調べるために、DDPCRをCTC由来ゲノムDNAに用いてEGFR T790MおよびL858Rのアッセイを用いて実施しました。

このプロトコルは、CTCサンプルモデルと市販のddPCRアッセイを用いて、CTCにおけるがん関連変異の標的検出の入口を示すことを目的としています。このプロトコルは循環する腫瘍細胞におけるがん関連変異の検出に実用的なアプローチを提供し、液体生検の応用に関するさらなる研究を支援する可能性があります。

プロトコル

倫理的声明:

血液サンプルは研究利用のために認可された情報源から採取され、サンプル採取前にすべてのドナーから書面によるインフォームド・コンセントが取得されました。ヒト血液サンプルを含むすべての実験プロトコルは、血液ベンダーであるDiscovery Life Sciences(米国アラバマ州)の機関審査委員会によって審査・承認されました。ヒト血液サンプルを含むすべての手続きは、機関研究委員会の倫理基準およびヘルシンキ宣言に従って実施されました。

1. 半自動細胞分離システムを用いたがん細胞濃縮

注: 本節では、半自動細胞分離プラットフォームを用いた循環腫瘍細胞(CTC)の濃縮と、その後ドロップレットデジタルPCRによるEGFR変異検出について説明します。モデルCTCサンプルを用いて実現可能性を示し、臨床応用前にアッセイ検証を推奨します。2つの非小細胞肺がん(NSCLC)細胞株が用いられました。NCI-H1975(EGFR L858R/T790M変異)およびA549(EGFR野生型)で、変異検出の陰性対照群として機能しました。

1. 血液サンプル
   1. 採血前に献血者や患者からインフォームドコンセントを必ず取得してください。血液を含む人体標本を含む研究については、必要に応じて機関審査委員会(IRB)の承認を取得します。
   2. 実現可能性試験のため、研究目的のみで認可された第三者ベンダーから血液サンプルを入手してください。
   3. 末梢血をエチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)チューブで採取し、48時間以内にジェネシス濃縮プロトコルでサンプルを処理します。
      注記。下流解析およびGenesis濃縮プロトコルには、EDTAチューブの使用が推奨されます。ストレックおよびEDTAチューブは、Genesis Enumerationプロトコル(直接・間接)によるスライド上の免疫染色に使用できます。
   4. 血液サンプルはEDTAチューブで2〜8°Cで保存し、使用まで保管します。ジェネシス細胞分離では前処理は不要で、濃縮プロトコルには最大10mLまでの全血を使用できます。
2. モデルCTCサンプル/臨床サンプル製剤
   1. 100〜1,000細胞濃度の細胞ストック溶液を、10μLの適切な細胞培養培地またはリン酸緩衝生食塩水(PBS)バッファーで準備します。臨床サンプルを使用している場合はこのステップを省略してください。
      注:本研究で用いられたスパイキング濃度は、通常観察される臨床CTCレベルよりも高く、あくまで方法実証を目的としています。
   2. 細胞ストック溶液10μLを健康なドナーの全血10mLに加え、モデルCTCサンプルを準備します。臨床サンプルの場合、患者の全血サンプルにがん細胞は含めないでください。
   3. 血液サンプルを同量のPBS(1x)と混ぜ、室温の血液ロッカーで優しく攪拌して使用します。1時間を超える保存は4°Cで保存してください。
3. CTCエンリッチメント
   1. ジェネシス細胞隔離システムの電源を入れて、システムの初期化を待て。これには最大で5分かかることもあります。
   2. 廃棄物容器をステーションベイの基部に置き、廃棄物容器のチューブを廃棄物容器に取り付けます。
   3. チューブをピンチバルブに押し込み、カチッと音がするまで調整し、ジェネシスシステムのチューブを廃棄物瓶の出口に接続します。
   4. ホーム画面から「スタート」ボタンを押して画面上の「セルフテスト」にタッチしてセルフテストを実行しましょう。
   5. セルフテストが完了したら、選択プロトコルのオプションから 「2.0 キット濃縮」 を選択します。
   6. 画面の指示に従い、必要なデータ入力欄を入力し、プライミングとアセンブリ手順を完了します。70%エタノールと1倍PBSを用いた成功したプライミングは、DNA抽出における最良の細胞捕捉性能と回復をもたらします。プライミングは約20分で完了します。
   7. 適切な濃縮プログラム(2.0キット濃縮)を選択し、すべてのチュービング接続とスライドの設置が適切に固定されていることを確認してから開始してください。試料充填時に気泡を導入しないようにしてください。これは流れの一貫性や捕捉効率に影響を与える可能性があります。
   8. ステップ1.2.3(モデルCTCサンプル/臨床サンプル準備)で調製したモデルサンプルを入口ファネルに優しく投入し、システム画面の「再開」ボタンを押して濃縮プロトコルを継続します。
   9. CTC回収が完了すると、半自動セル隔離システムがユーザーに廃棄物ジャーの取り外しとプライミングリザーバーの再接続を促します。
   10. ジェネシスシステムのチューブを廃棄物ジャーから外し、4mLの希釈バッファーをプライミングリザーバーにピペットで注入します。
   11. バックフローアダプターをプライミングリザーバーに接続し、ジェネシスシステムのチューブに再接続します。画面の「再開」を押して濃縮プロトコルを続けてください。これにより、マイクロ流体スライド内で捕捉された細胞が逆流作用して入口漏斗へと放出されます。
   12. 回収した細胞は、入口漏斗からピペットで5.0 mLのエッペンドルフ管へ移して採取します。入口漏斗内の水溶液を必ず収集してください。漏斗はしばしば4mLを超えることもあります。
   13. 回収サンプルを600gで5分間遠心分離し、細胞分解前に捕獲した細胞をペレット状にします。
   14. 上清液を慎重に除去し、DNA抽出プロトコル(セクション1.4)に進みます。
4. DNA抽出
   注意:DNAzol BDは皮膚に触れたり摂取した場合に有害です。皮膚や目への接触は避けてください。化学的なフュームフード環境内でのみ使用し、霧や蒸気、スプレーは吸わないでください。皮膚に触れた場合はすぐに水で洗い流してください。
   1. ステップ1.3.14のチューブに直接DNAzol BDを1mL添加します。
   2. サンプルの全体積を新しいEppendorf DNA LoBind 1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブに移し、激しく振る。
   3. チューブを室温で5分間孵化させます。チューブを強く渦巻かせ、室温で少なくとも4分間孵育させます。
   4. DNA回収を最大化するために、溶解および沈殿の段階で完全な混合を確保しましょう。RNA汚染が懸念される場合は、オプションでRNase処理を含めることもあります。
   5. DNAゾールBD細胞溶解液サンプル混合物に400μLのイソプロパノールを直接加えます。
   6. チューブを10,000gで6分間遠心分離してDNAを沈殿させます。
   7. 遠心分離後、上澄液を除去し、ペレット状DNAに0.5mLのDNAゾールBDを優しく添加します。
   8. DNAペレットが完全に拡散するまでチューブを渦巻く。
   9. 混合物を10,000gで遠心分離機にして5分間加熱します。
   10. 上澄液を取り除き、75%エタノール1mLをピペットで洗浄します。
   11. 9〜10の手順を繰り返し、合計2回のウォッシュを行います。
   12. チューブ底部の残留エタノールはマイクロピペットで除去します。
       注意:ペレットが完全に乾かないように注意してください。
   13. CTCサンプルからDNAを溶解するためにDNase/RNaseフリー脱イオン水20μLを加えます。
   14. Qubit 1x dsDNA高感度アッセイキットやBioanalyzer高感度DNA解析などのdsDNA定量アッセイキット/プラットフォームを用いて、サンプル中の二本鎖DNA(dsDNA)を定量します。
   15. 抽出したDNAサンプルは分解を防ぐために4°Cまたは-20°Cで保存します。
       一時停止点:抽出されたDNAサンプルは短期保存のために-20°C、長期保存のために-80°Cで保存し、その後の分析に進むことができます。

2. ddPCRを用いたEGFR変異解析

デジタルPCRは、高感度かつ高精度で希少な変異を検出するのに適した方法です。ddPCR変異検出アッセイは、単一のチューブで提供される場合、変異アレルを標的としたFAM標識プローブと野生型対立遺伝子を標的とする第2のHEX標識プローブが含まれます。

1. 反応のセットアップと液滴生成
   1. ddPCRスーパーミックスを解凍し、ddPCR変異検出アッセイを氷上で行います。
   2. 各チューブを渦巻いて内容物が均一になるようにします。-20°Cでの保管中に濃度勾配が発生する可能性があるためです。
   3. チューブ底部の堆積物を遠心分離機で短時間取り、チューブを氷の上に置きます。
   4. 抽出したDNAサンプルを所定濃度で準備し、表 1のレシピに従って反応混合物を準備します。
   5. スーパーミックス、アッセイ、制限酵素、そして必要なサンプルごとに水を混ぜたプリミックスを作り、最後の反応成分としてサンプルDNAを個別に追加します。DNAサンプルの最終濃度は50 fg–100 ngであることを確認しましょう。
      注:精度向上、粘度低下、テンプレート利用の容易さ向上のために、液滴生成前の制限消化によるDNA断片化が推奨されます。ddPCRのセットアップ時に2〜5 Uの制限酵素を用いて直接消化することが推奨されます。EGFR点変異アッセイ(T790M/L858R)にはMseIが推奨されます。カスタマイズ前に、対応酵素のアッセイデータシートを参照してください。Bio-Radデジタルアッセイポータル(Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays |ホーム)
   6. 未知のサンプル濃度とほぼ同程度の濃度で、野生型テンプレートのみを含む少なくとも1つの井戸のネガティブコントロールを準備します。
   7. 反応管を渦巻いて十分に混ぜ、短時間遠心分離して各反応管の底にすべてのサンプルを沈殿させます。反応チューブを室温で2分間平衡させます。
   8. 各反応混合物を20μLをマイクロ流体カートリッジ(DG8カートリッジ)のサンプル井に投入し、その後75μLの液滴生成油を油井へのプローブ用に投入します。
   9. カートリッジをガスケットで覆い、QX200ドロップレットジェネレーターに入れます。
   10. ドロップレットジェネレーターの上部にあるボタンを押して蓋を閉じます。蓋を閉じると、自動的に滴の生成が始まります。この手法では、マイクロ流体カートリッジのマイクロチャネル内で試料と油を組み合わせ、各サンプルに対して約20,000ナノリットルサイズの液滴の乳剤を作成します。
2. PCR増幅(熱サイクル条件)
   1. 表2の推奨に従い、サーマルサイクラーの熱サイクル条件をプログラムしてください
   2. 液滴生成が完了すると、機器上のすべてのライトは緑色の点灯となります。ドロップレットジェネレーターのボタンを再度押し、カートリッジホルダーとカートリッジを取り外して器具を開けます。
   3. 使い捨てガスケットを取り外し、45μLの液滴をカートリッジから吸引します。ただし、ピペットの先端にわずかな角度を保ち、滴がシュレッダー化しないように注意してください。
   4. ddPCRの96ウェルプレートに液滴を注入し、PX1 PCRプレートシーラーを用いてPCRプレートヒートシールでプレートを密封します。
   5. 液滴を含む96ウェルプレートを密封した後、ステップ2.2.1で準備されたサーマルサイクラーに慎重に96ウェルプレートを移し、サーマルサイクリングを開始します。
3. 液滴読み取りとデータ解析
   1. ddPCRドロップレットリーダー機器(QX200ドロップレットリーダーまたはQX600ドロップレットリーダー)と、QXマネージャーソフトウェアをインストールし設定した接続されたコンピュータを起動します。
   2. 熱サイクルステップが完了したら、密閉された96ウェルプレートを液滴リーダー機器に移します。
   3. QXマネージャーソフトウェアを開き、実験設計に基づいて新しいプレートレイアウトを設定できます。「プレートを追加」 タブをクリックすると、ソフトウェアが「プレートの設定」ボタンを有効にします。「プレートの設定」 をクリックして、サンプルの詳細をプレートに割り当ててください。
   4. プレートと井戸の情報詳細を入力し、ウェルを選択し、試料条件、実験タイプ、ターゲット名、ターゲットタイプ、参照番号を指定します:ファムはch1、HEX色はch2です。
   5. 「適用」 をクリックして井戸を読み込み、読み終わったら「OK」を選択してください。
   6. すべてのサンプルのプレートレイアウトが完成したら、「実行」を選択して液滴読み取りを開始します。
   7. データ取得後、「解析」のウェルセレクターでサンプルを選択し、ddPCR変異検出アッセイの適切な閾値を設定して変異体と野生型シグナルを区別します。
   8. このプロトコルで用いられるような二重変異アッセイでは、QXマネージャーソフトウェアのデフォルト設定(結果図参照)を使って閾値を自動的に設定できます。
   9. あるいは、クロスヘア法やラッソ法を用いて手動で閾値を設定することもでき、閾値やラッソ境界が正負のクラスターを分け、各ランに含まれた正・負の対照群によって定義されたクラスタの位置に基づいて位置を決めることが可能です。
      注意:バッチ内のサンプル間で、陽性および陰性対照を用いて閾値を設定し、変異呼び出しの再現性を確保する必要があります。
   10. 報告された濃度は、最終反応1xの1 ddPCR反応のコピー数/μLです。

結果

マイクロフルイド細胞キャプチャスライドを用いたGenesis細胞分離システムは、血液サンプル中の25〜250細胞・^mL-1 濃度で平均84%のスパイクがん細胞を分離しました(図3A)。この高い捕捉効率は、全血サンプルから希少な循環腫瘍細胞を単離する際の濃縮ステップの有効性を示しています。システムEnumerationプロトコルを用いたマイクロフルイド細胞キャプチャスライドで捕捉された細胞の任意の免疫染色は、サイトケラチンに対する2つの陽性抗体、核形成細胞を識別するDAPI、そしてほとんどの白血球で発現するが通常CTCでは発現しないCD45に対する陰性抗体1つを用いて希少な細胞同定を示しました(図3B)).この染色パターンは、背景白血球を除外した循環腫瘍細胞の同定に成功していることを裏付けています。

ddPCR変異検出アッセイにより、濃縮がん細胞におけるEGFR変異の同定とプロファイリングが可能となりました。本研究では、ddPCRおよび変異検出アッセイを用いて、Genesisプラットフォームで最初に強化された細胞内のgDNA変異の検出が示されました。がん細胞株A549(EGFR野生型)およびH1975(L858R/T790M)のddPCRプロット(図4)では、ddPCRが全血にスパイクし、Genesisプラットフォームを経由して濃縮した後、細胞株H1975に存在する変異を感度に検出できることが示されました。H1975細胞では陽性の変異シグナルが観察されましたが、A549細胞では変異シグナルは検出されず、アッセイ特異性が確認されました。対照細胞株A549でスパイクしたサンプルでは変異はなく、ドロップはなく、L858RおよびT790Mの変異検出がH1975細胞株に特異的に関連していることが確認されました。GenesisプラットフォームでのCTC分離の実証とddPCRを用いた分子解析は、臨床サンプルを用いた液体生検や前臨床試験における強力な分子診断ツールを提供し、疾患の進行を監視し個別化治療を図ります。総じて、これらの結果は、濃縮とddPCRのワークフローを組み合わせることで、循環する腫瘍細胞におけるEGFR変異を確実に検出・定量できることを示しています。

図1:肺がんにおけるEGFR DNA変異のプロファイリングのための液体生検ワークフロー。 (A) 従来の組織生検および液体生検からの循環腫瘍細胞(CTC)を用いて検出された異なるEGFR変異プロファイルを示す腫瘍異質性の図。(B) 液体生検を用いた循環腫瘍細胞におけるEGFR DNA変異プロファイリングの概略ワークフロー。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図2:人工サンプルを用いたEGFR DNA変異プロファイリングの実証。 (A) EGFR変異状態が確定した肺がん細胞株を健康なドナーからの全血にスパイクしてモデルCTCサンプルを準備する。(B) 市販プラットフォームを用いた循環腫瘍細胞におけるEGFR DNA変異検出のワークフロー。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

図3:循環中の腫瘍細胞のラベルフリー分離および同定。 (A) 半自動化希少細胞分離プラットフォームを用いて健康なドナーから全血サンプルに入った、肺がん細胞株(A549およびH1975)の捕捉効率が急上昇しました。(B) サイトケラチン陽性腫瘍細胞を示す捕獲細胞の免疫染色。スケールバー=10μm。この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

図4。ドロップレットベースのデジタルPCRを用いたEGFR変異プロファイリング。 細胞溶解およびDNA抽出後の濃縮がん細胞におけるEGFR変異検出を示す二次元振幅プロット。A549細胞(野生型)は変異特異的シグナルを欠く一方、H1975細胞はEGFR L858RおよびT790M変異に対して陽性シグナルを示します。このアッセイにより、変異体および野生型DNA集団の高感度検出と定量が可能になります。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

構成要素	反応あたり体積(μl)	最終集中
プローブ用のddPCRスーパーミックス2台(dUTPなし)	10	1回
20倍のターゲット(FAM)および野生型(HEX)プライマー/プローブ	1	1回
希釈された制限酵素(Msel)	1	2-5 U/reaction
標的サンプルおよび/またはDNaseフリー水(NTA)	可変	可変
総体積	20	-

表1:液滴ベースのデジタルPCR変異検出のための反応設定。 がん細胞由来DNAサンプルにおける希少なEGFR変異検出に用いられる試薬の組成および最終濃度。

サーマルサイクリング*ステップ	温度	時間	ランプレート	サイクル数
	(ºC)		(ºC/sec)
酵素活性化	95	10分	2	1
変性	94	30秒	2	40
アニーリング/延長	55	1分	2	40
酵素不活性化	98	10分	2	1
冷却	4	30分	2	1
ホールド(任意)	4	∞(無限)	1	1
C1000 Touch Thermal Cyclerでは、加熱蓋を105ºCに設定し、サンプル容量を40μlに設定してください 96層の井戸反応モジュールを備えています。

表2:デジタルPCR増幅のための熱サイクル条件。 96ウェル反応モジュールを持つサーマルサイクラーを用いたEGFR変異標的の増幅に用いられる熱サイクリングパラメータ。

ディスカッション

固形腫瘍患者の血液中の循環腫瘍細胞の存在は60^年以上にわたり研究対象とされており、2010年に初めて集団試験に組み込まれる前から一次液体生検として認識され^{てきました。}しかし、CTCは稀であり、^全血から選択的に分離するのは困難です。しかし、CTCの捕捉および濃縮には多くの方法があり、以下の^{レビュー10,11}で示されており、物理的・微小流体的アプローチおよび細胞表面マーカー選択法をカバーしています。これらの方法の多くは時間がかかり、労力がかかり、必要な選択性を達成するために複数のステップやシステムを必要とすることが多いです。

このプロトコルにおける全血CTCの捕捉は、そのサイズ(> 8 μm)および表現型的に正常な赤血球および白血球の背景における変形の欠如に依存します。これらの赤血球はマイクロフルイディクス孔を通過します。したがって、適切なサンプルの装填、適切なスライドプライミング、詰まり防止は、捕獲効率とサンプル回収を維持するために極めて重要です。

ワークフローを成功させるためには、血液サンプル管理が鍵となります。新鮮な血液がサンプル処理に利用され、溶血を防ぐために適切な輸送・保管条件を維持すること。赤血球や白血球の分解は、CTC捕捉の質や稀なゲノム変異の検出感度にそれぞれ影響を与えます。溶血、凝固、または目に見えるサンプルの劣化が観察された場合、これらの条件はCTCの回復や下流の変異検出感度を低下させる可能性があるため、サンプルを処理すべきではありません。

CTCは全血中の1,000万個白血球あたり1CTC未満のレベルに存在するため、濃縮のために許容される範囲内をできるだけ多く捕捉することが不可欠です。マイクロ流体細胞キャプチャスライドは、通常7.5〜10mLの血液を保持するStreckやEDTAなどの標準的な血液捕捉チューブと一致し、10 mLの血液を収容可能です。採取した血液量の減少は、CTC捕捉感度およびその後のゲノム変異検出に直接影響を与えます。治療を受ける患者からこのルーチンを超える量を得ることは、臨床的にも倫理的にも困難な場合があります。10ml以上の体積増加や診断用白血球分離症サンプルを用いて白血球/CTC集団を増やすこと以外^に、より大きな体積での感度向上は現時点でGenesisプラットフォームの範囲外です。

プロトコルは標準SOPに記載された通りに実施されましたが、新鮮な血液採取、EDTAと血液の包括的な混合、使用前に採取した血液の慎重な保管に注意が払われており、標準的な運用手順が重視される臨床現場での利用可能性を示しています。しかし、このプロトコルは人工サンプルを用いて実証されたため、通常の臨床実施前に臨床患者検体との検証が必要です。

CTC集団内での変異検出の感度は、標準的な全血サンプル中のCTCの存在と、そのCTC集団内での体細胞変異の検出に依存します。これはCTCサブ集団における変異の頻度に依存します。これら2つの交絡因子は最終的に捕獲されたCTC集団における変異検出の全体的な感度を制限します。これは、CTCカウントや変異を含むCTC集団が多い後期サンプルに比べて、早期検出サンプルへの影響が大きいです。

現在の血液ベースの液体生検研究は、腫瘍の存在を示す指標として血漿中の循環腫瘍DNAに大きく偏っています。通常、ctDNAの検出は、SNV、構造変異、MSI-H、TMB、CGPなどの腫瘍特異的ゲノムマーカーの存在に基づいています。CTCは液体生検においてあまり利用されていないものの同様に有効なバイオマーカーであり、腫瘍の成長や転移の可能性から血流に排出されることが知られています⁸。CTCの解析は主に、その捕獲や捕獲後検証に用いられる細胞表面マーカーに焦点を当てており、確立またはカスタムの抗体パネル(例:パンサイトケラチン、ビメンチン、PD-L1、EpCAMなど)を用います。一方、CTCsの分子解析は、全血からCTCを選択的に濃縮・捕捉し、その後CTCサブポピュレーションの精密解析を行う課題があるため、採用が限られています。現在の手法は、CTCキャプチャの確立されたプロトコルを取り入れ、その後ddPCRを用いた分子分析と既製品アッセイを用いた、人工的に全血サンプル中の既知の病理学的に関連性ゲノム変異を検出する標準化されたワークフローを用いています。このアプローチは、濃縮CTCから直接変異プロファイリングを可能にし、血漿ctDNAベースの液体生検法を補完する点で重要です。

現在の手法を用いることで、捕獲された希少なCTCは全血中の存在およびCTC集団内で病理学的に関連のあるゲノムマーカーの有無を調べることができます。研究により、がん患者のctDNAプロファイルとctDNA¹³と並行して循環するCTC貯留体の両方を評価する価値が示されており、両方の変異源の評価が個々の患者の分子構造を拡大することが可能です。これにより、トランスレーショナルリサーチの範囲内で、最終的には臨床現場での病理検査パラダイムの開発が期待されています。新しいパラダイムでは、がんの存在・進行の指標としてのCTC存在と、CTC捕獲細胞内に存在する病理的変異の両方を取り入れ、クローンの増殖や治療抵抗性を示す可能性があります¹⁴。このことの示唆は、転移とクローン増殖の発生、そしてその後の薬剤耐性がctDNAレベルとCTCレベルの両方で同時に監視され、後期がんにおける治療選択に直接影響を与える可能性があるということです。

将来の応用としては、このワークフローを追加のがん関連変異に適応させたり、縦断的な臨床サンプルでその性能を検証したりする可能性がある。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	機器（「半自動細胞分離システム」と呼ばれる）
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	機器
QX200 Droplet ReaderまたはQX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003または12013328	機器（「ドロプレットリーダー機器」と呼ばれる）
PX1 PCRプレートシラー	Bio-Rad Laboratories	1814000	機器
C1000 Touchサーマルサイクラーwith 96–ディープウェル反応モジュール	Bio-Rad Laboratories	1851197	機器
Qubit 4フルオロメーター	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	機器
Celselectスライド			消耗品（「マイクロフジディック細胞捕捉スライド」と呼ばれる）
Celselectスライドエンリッチメントキット2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	消耗品
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	試薬
MseI制限酵素	New England Biolabs	R0525S	試薬
ddPCR変異検出アッセイ：EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	アッセイID dHsaMDV2010019	アッセイ
ddPCR変異検出アッセイ：EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	アッセイID dHsaMDV2010021	アッセイ
Qubit 1X dsDNA高感度アッセイキット	Invitrogen	Q33230	アッセイキット
QX200ドロプレットジェネレーター用DG8カートリッジ	Bio-Rad Laboratories	1864008	消耗品
プローブ用ドロプレット生成オイル	Bio-Rad Laboratories	1863005	消耗品
プローブ用自動ドロプレット生成オイル	Bio-Rad Laboratories	1864110	消耗品（オプション）
ddPCRスーパーミックスforプローブ（dUTPなし）	Bio-Rad Laboratories	1863023	試薬
PCRプレートヒートシール	Bio-Rad Laboratories	1814040	穿孔可能フイルムシール
DNA LoBindマイクロ遠心管、1.5 ml	Eppendorf	022431021	消耗品
ddPCR 96ウェルプレート	Bio-Rad Laboratories	12001925	消耗品